Das Eukaryotische-Initiations faktor-4E Bindungsprotein (4E-BP) ist ein Inhibitor der Translationsinitiation. Nicht-phosphoryliertes 4E-BP bindet an den eukaryotischen Initiationsfaktor 4E (eIF4E). Diese Bindung blockiert die Rekrutierung des Initiationskomplexes eIF4F an die Cap-Struktur des 5´Endes von eukaryotischen zellulären mRNAs, was die Initiation der Translation verhindert. Phosphorylierung von 4E-BP durch die mTOR Kinase führt zur Dissoziation des 4E-BP/eIF4E Komplexes und erhöht die Verfügbarkeit von eIF4E, dies wird mit Zellproliferation assoziiert. Die Aktivität von eIF4E wird nicht nur von 4E-BP, sondern auch durch Phosporylierung reguliert, welche wiederum durch die "MAP-Kinase-Interacting-Protein-Kinase" (MNK) reguliert wird. Drei Isoformen von 4E-BP sind bekannt: 4E-BP1, 4E-BP2 and 4E-BP3. 4E-BP1 und 4E-BP2 sind an oxidativem und adipogenetischen Stress beteiligt. Beide Proteine werden im h?matopoetischen System gleich exprimiert, wohingegen 4E-BP3 nicht detektiert wird. 4E-BP1 wird während der Erythroblasten-Proliferation phosphoryliert. Aus diesem Grund habe ich die Hämatopoese und die durch Phenylhydrazine (PHZ) induzierte Stress-Erythropoese in 4E-BP1 und 4E-BP2 Knock-Out Mäusen und 4E-BP1,2 Doppel-Knock-Out Mäusen analysiert. Ich konnte zeigen, dass die Hämatopoese in 4E-BPs defizienten Mäusen nicht beeinflusst wird. Allerdings zeigten 4E-BP1,2-/- und 4E-BP2-/- Mäuse eine verspätete Antwort auf Phenylhydrazin (PHZ) induzierten erythropoetischen Stress. Gleichzeitig war die mRNA Translation von GATA-1, ein essentieller erythropoetischer Transkriptionsfaktor in Erythroblasten runterreguliert. Die Signaltransduktionswege mTOR und MNK1 waren bei erythropoetischen Stress aktiviert. Diese Daten zeigen, dass 4E-BP2, aber nicht 4E-BP1, notwendig ist um auf erythropoetischen Stress zu reagieren und deuten an, dass die 4E-BP gesteuerte translations-regulierende Maschinerie eine Rolle in der Stress-Erythropoese spielt. / Translational regulation allows an organism to generate fast responses to environmental changes quickly. Eukaryotic initiation factor 4E binding protein (4E-BP) is an inhibitor of translation initiation. Unphosphorylated 4E-BP binds to eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) blocking recruitment of the initiation complex eIF4F to the cap structure at the 5´ terminus of eukaryotic cellular mRNAs. Thus initiation of translation is blocked. Phosphorylation of 4E-BP by the mTOR kinase causes disassociation of the 4E-BP/eIF4E complex and increases the availability of eIF4E. EIF4E activity is not only regulated by 4E-BP, but also phosphorylation which is regulated by MAP kinase - interacting protein kinase (MNK). Three isoforms of 4E-BP are known, termed 4E-BP1, 4E-BP2 and 4E-BP3. 4E-BP1 and 4E-BP2 are involved in oxidative and adipogenetic stresses in vivo. They are equally expressed in hematopoietic system, whereas 4E-BP3 is not detected. 4E-BP1 is phosphorylated during erythroblast proliferation. Erythroid differentiation is blocked by overexpresssion of eIF4E in tissue culture. These studies implied that 4E-BPs might play role in response to erythropoietic stress. I examined hematopoiesis and phenylhydrazine (PHZ) induced stress erythropoiesis in 4E-BP1 and 4E-BP2 individual knock out mice and 4E-BP1,2 compound knock out mice. I found that the hematopoiesis of 4E-BPs deficient mice were unaffected. However, 4E-BP1,2-/- and 4E-BP2-/- mice showed delayed response to phenylhydrazine (PHZ) induced erythropoietic stress. Simultaneously, the mRNA translation of GATA-1, which is the essential erythroid transcription factor, was downregulated in their erythroblasts. The signaling pathways through the mTOR and MNK1 were activated in erythropoietic stress. These data showed that 4E-BP2 but not 4E-BP1 was required for the response to erythropoietic stress and suggested that 4E-BP related translation regulatory machinery played a role in stress erythropoiesis.

Evolutionär konservierte, kleine offene Leserahmen (upstream open reading frames, uORFs) sind translational aktive Kontrollelemente, die bevorzugt in Boten-Ribonukleinsäuren von Schlüsselgenen zur Regulation von Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung vorkommen. In dieser Arbeit wurden Mäuse analysiert, die defizient für das uORF Initiationscodon des Transkriptionsfaktors CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBPbeta-Delta-uORF) sind. Proteinanalysen verschiedener Gewebe zeigten, dass C/EBPbeta-Delta-uORF Mäuse im Gegensatz zu Wildtyptieren nicht in der Lage sind, die kurze, auto-antagonistische C/EBPbeta LIP Isoform zu induzieren. Die verminderte LIP Expression verursachte eine gestörte Differenzierung knochenabbauender Osteoklasten und ging mit einer Zunahme von mineralisiertem Knochengewebe in C/EBPbeta-Delta-uORF Mäusen einher. Nach partieller Hepatektomie führte der Verlust der uORF-vermittelten Induktion von LIP in regenerierenden C/EBPbeta-Delta-uORF Lebern zu einer Überaktivierung C/EBPbeta-regulierter Akute Phase Gene. Im Vergleich zum Wildtyp wiesen Hepatozyten von C/EBPbeta-Delta-uORF Tieren einen verzögerten und abgeschwächten Wiedereintritt in die S-Phase des Zellzyklus auf. Genomweite Genexpressionsanalysen zeigten, dass die verminderte S-Phase Aktivität in regenerierenden C/EBPbeta-Delta-uORF Lebern mit einer persistierenden Repression von Zellzyklusgenen korrelierte, wobei insbesondere die verminderte Expression zahlreicher E2F-regulierter Gene auffällig wurde. Chromatinimmunpräzipitations- und Reportergenexperimente führten zur Entwicklung eines mechanistischen Modells, das eine isoformspezifische C/EBPbeta-Koregulation E2F-kontrollierter Zellzyklusgene vorschlägt. Die Analyse der C/EBPbeta-Delta-uORF Mäuse belegt erstmals die Funktionalität der uORF-gesteuerten translationalen Kontrolle im Säugetier und weist auf eine entscheidende Bedeutung dieses Kontrollmechanismus bei zahlreichen physiologischen und pathopysiologischen Prozessen hin. / Evolutionary conserved small upstream open reading frames (uORFs) are translational control elements predominantly prevalent in the 5'' mRNA regions of key regulatory genes of growth, proliferation, and differentiation. This thesis comprises the evaluation of mice deficient for the uORF initiation codon of the transcription factor CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBPbeta-Delta-uORF). Protein analysis of various tissues demonstrated that C/EBPbeta-Delta-uORF mice, in contrast to wildtype control animals (C/EBPbeta-WT), fail to induce translation of the truncated, auto-antagonistic C/EBPbeta LIP isoform. The reduced expression of LIP was associated with impaired differentiation of bone resorbing osteclasts and resulted in an increased bone volume of C/EBPbeta-Delta-uORF mice. After partial hepatectomy the loss of uORF-mediated LIP induction resulted in super activation of acute phase response genes in regenerating livers. Furthermore, C/EBPbeta-Delta-uORF hepatocytes showed a delayed and blunted re-entry into the cell cycle after partial hepatectomy as compared to C/EBPbeta-WT animals. Genome-wide transcript expression analyses revealed that the reduced S-phase activity in regenerating C/EBPbeta-Delta-uORF livers correlated with a persistent repression of cell cycle regulatory genes and showed a remarkable underrepresentation of genes regulated by the E2F family of transcription factors. Chromatinimmunoprecipitations and luciferase reporter gene assays allowed the development of a mechanistic model that suggests C/EBPbeta isoform-specific co-regulation of E2F-controled cell cycle genes. The analysis of C/EBPbeta-Delta-uORF mice validates the functionality of uORF-mediated translational control in vertebrates and suggests a comprehensive role of uORF regulation in physiology and the etiology of disease.