Mycobacterium abscessus est une mycobactérie responsable principalement d’infections pulmonaires, en particulier chez les patients atteints de mucoviscidose ou de dilatation des bronches. M. abscessus est naturellement résistante aux antituberculeux, laissant peu d’options thérapeutiques. Le traitement de référence associait classiquement un aminoside, un macrolide (clarithromycine) et une β-lactamine (céfoxitine ou imipénème), avec un taux de succès d’environ 50 %. Cependant, des souches résistantes à la clarithromycine sont fréquemment isolées, remettant en cause l’utilisation de cet antibiotique. M. abscessus produit naturellement une β-lactamase à large spectre (BlaMab) mais les mécanismes d’action des β-lactamines n’ont pas été étudiés chez cette espèce, ce qui constitue une entrave à l’optimisation des traitements par cette classe d’antibiotiques. Le premier objectif était d’identifier et de caractériser les cibles des β-lactamines chez cette espèce. Inhibant la dernière étape de polymérisation du peptidoglycane, les cibles potentielles des β-lactamines sont trois familles d’enzymes : les D,D-transpeptidases et les D,D­carboxypeptidases appartenant à la famille des protéines de liaison à la pénicilline (PLP), ainsi que les L,D-transpeptidases qui sont majoritairement responsables de cette dernière étape chez cette espèce. Pour identifier les cibles, des mutants résistants aux β-lactamines ont été sélectionnés à partir de la souche de référence M. abscessus CIP104536 et d’un dérivé portant une délétion du gène blaMab (∆blaMab). Pour les deux souches, l’émergence de la résistance aux β-lactamines a requis de multiples étapes, ce qui constitue un atout pour leur utilisation thérapeutique. Pour les mutants obtenus à partir de la souche CIP104536, les analyses phénotypiques ont montré que la résistance aux β-lactamines n'est pas due à une augmentation de l’efficacité catalytique de BlaMab, à une surproduction de cette enzyme, ou à une diminution de la perméabilité. Le séquençage des génomes de mutants résistants n’a pas révélé de mutations dans les gènes codant pour les L,D-transpeptidases, mais des mutations ont été trouvées dans des gènes codant pour deux PLP. D’autres mutations se situent dans des gènes codant en particulier pour des protéines non caractérisées. L’acquisition de la résistance pourrait donc dépendre de mutations affectant des facteurs essentiels à l’activité des cibles des β­lactamines. Le deuxième objectif était d’étudier et de comparer l’activité in vitro des β-lactamines sur M. abscessus. Des expériences de bactéricidie et d’activité intracellulaire chez le macrophage infecté ont été effectuées pour les souches CIP104536 et ∆blaMab. Parmi les antibiotiques étudiés (amikacine, céfoxitine, imipénème, ceftaroline, et amoxicilline), l’imipénème est le plus efficace sur les deux souches. Sur la souche ∆blaMab, l’association d’imipénème et d’amikacine est bactéricide. En l’absence de BlaMab, l’amoxicilline est aussi efficace que l’imipénème. L’avibactam augmente l’activité de la ceftaroline mais l’inhibition de BlaMab est seulement partielle en intracellulaire. Les résultats obtenus in vitro montrent que l’imipénème est supérieur à la céfoxitine pour des concentrations atteignables dans le sérum. L’inhibition de BlaMab pourrait augmenter l’efficacité de l’imipénème et d’autres composés utilisés pour traiter les infections pulmonaires à M. abscessus. / Mycobacterium abscessus is an important pathogen responsible for pulmonary infections in cystic fibrosis patients or in patients suffering from bronchiectasis. The treatment of infections due to M. abscessus is complicated since this bacterium is naturally resistant to the anti­tuberculous agents. The recommended treatment includes an aminoglycoside, a macrolide (clarithromycin) and a β-lactam (cefoxitin or imipenem), with a success rate of about 50 %. However, strains resistant to clarithromycin are frequently isolated, questioning the use of this antibiotic. M. abscessus naturally produces a broad spectrum β-lactamase (BlaMab) but the mechanisms of action of the β-lactams have not been studied in this species, impairing the optimization of the treatment by these antibiotics. The first objective was to identify and characterize the targets of β-lactams antibiotics in this species. Inhibiting the final stage of the peptidoglycan polymerization, the potential targets of β-lactams are three families of enzymes: the D,D-transpeptidases and D,D­carboxypeptidases belonging to the family of penicillin-binding proteins (PBP), and the L,D-transpeptidases which are mainly responsible for this final stage in this species. To identify the targets, mutants resistant to β-lactams have been selected from the reference strain M. abscessus CIP104536 and from its β-lactamase-deficient derivative ΔblaMab. For both strains, the emergence of resistance to β­lactams has required multiple steps, which is an advantage for the therapeutic use of these antibiotics. For the mutants derived from the strain CIP104536, phenotypic analyzes showed that the resistance to β-lactams is not due to an increase in the catalytic efficiency of BlaMab, to an overproduction of this enzyme, or to a decrease in permeability. Genomes sequencing of the resistant mutants did not reveal mutations in the genes encoding the L,D-transpeptidases, but mutations have been found in genes encoding two PBPs. Other mutations have been detected in genes encoding uncharacterized proteins. Acquisition of resistance could therefore depend on mutations affecting key factors essential for the activity of β-lactams targets. The second objective was to study and compare the in vitro activities of β-lactams against M. abscessus. Bactericidal experiments and intracellular activity in the infected macrophage were performed for the strains CIP104536 and ΔblaMab. Among the antibiotics tested (amikacin, cefoxitin, imipenem, ceftaroline, and amoxicillin), imipenem is the most effective agent against the two strains. Combination of imipenem and amikacin was bactericidal against the ΔblaMab mutant. In the absence of BlaMab, amoxicillin was as active as imipenem. Avibactam increased the intracellular activity of ceftaroline but inhibition of BlaMab was only partial intracellularly. Evaluation of the killing and intracellular activities of β-lactams indicates that imipenem is superior to cefoxitin at clinically achievable drug concentrations. Inhibition of BlaMab could improve the efficacy of imipenem and extend the spectrum of drug potentially useful to treat pulmonary infections.

Mycobacterium tuberculosis est responsable de 8,7 millions de nouveaux cas de tuberculose et de 1,4 millions de décès en 2011. L’émergence de souches résistantes aux deux antituberculeux majeurs, isoniazide et rifampicine, (MDR) et aux antibiotiques de seconde ligne (XDR), ainsi que la difficulté d’éradiquer les formes « dormantes » du bacille nécessitent la recherche de nouveaux antibiotiques. Les β-lactamines n’ont jamais été utilisées en thérapeutique car M. tuberculosis produit une β-lactamase à large spectre, BlaC. Cependant, l’association d’une β-lactamine appartenant à la classe des carbapénèmes, le méropénème, et d’un inhibiteur de β-lactamase, l’acide clavulanique, est active sur M. tuberculosis incluant des souches XDR. Notre objectif a été de caractériser les cibles des carbapénèmes qui sont atypiques chez M. tuberculosis, parce que le peptidoglycane de cette bactérie contient majoritairement (80%) des ponts interpeptidiques formés par une classe particulière de transpeptidases, les L,D-transpeptidases. Nous avons comparé les cinq L,D-transpeptidases de M. tuberculosis au niveau de leur activité in vitro dans la formation des ponts interpeptidiques du peptidoglycane et dans la réaction d’inactivation par les carbapénèmes. Nous avons ainsi pu montrer que les cinq L,D-transpeptidases sont fonctionnelles in vitro. LdtMt1, LdtMt2, LdtMt4 et LdtMt5 sont capables de former des ponts interpeptidiques du peptidoglycane reliant l’acide aminé en position 3 d’un substrat tétrapeptidique donneur à l’acide aminé en position 3 d’un substrat tétrapeptidique accepteur. Ces mêmes enzymes peuvent également utiliser la D-méthionine comme accepteur dans une réaction d’échange de la D-Ala4 du substrat tétrapeptidique. LdtMt1, LdtMt2, LdtMt3 et LdtMt4 forment un complexe covalent avec les carbapénèmes. La réaction d’inactivation des L,D-transpeptidases par les carbapénèmes se déroulent en deux étapes. Dans un premier temps, un intermédiaire covalent réversible est formé (constante catalytique k1) puis la deuxième étape aboutit à la formation de l’acylenzyme (constante catalytique k2). La détermination des constantes catalytiques d’inactivation k1 et k2 a révélé d’importantes différences entre les carbapénèmes. Excepté pour LdtMt1, l’imipénème inactive plus rapidement les L,D-transpeptidases que les autres carbapénèmes suggérant que des modifications de la chaine latérale pourraient être envisagées pour optimiser l’activité « anti-mycobactérienne » de cette classe de β-lactamines. Nous avons en parallèle initié l’étude de la régulation des L,D-transpeptidases dans différentes conditions de culture ce qui permettra à terme d’identifier les L,D-transpeptidases essentielles pour la croissance et la persistance de M. tuberculosis. Ce travail pourrait déboucher sur l’identification de cibles essentielles permettant l’éradication des formes dormantes de M. tuberculosis qui sont très difficile à traiter. / Mycobacterium tuberculosis is responsible for 8.7 million of new cases of tuberculosis (TB) and 1.4 million of deaths in 2011. The emergence of strains resistant to the two first-line anti-TB drugs, isoniazid and rifampicin, (MDR), to second line-drugs (XDR) and the difficult to kill dormant forms of the bacilli require the discovery of new anti-TB antibiotics. β-lactams are usually not considered for tuberculosis treatment since M. tuberculosis produces a broad-spectrum β-lactamase, BlaC. However, the combination of β-lactam belonging to the carbapenem class, meropenem, with β-lactamase inhibitor, clavulanate, is notably active on XDR strains. Our aim was to characterize the carbapenem targets, atypical in M. tuberculosis, since peptidoglycan of this bacteria contains a majority (80%) of cross-links formed by a special transpeptidase family, the L,D-transpeptidases. We have compared the five L,D-transpeptidases of M. tuberculosis for their in vitro activities with respect to peptidoglycan dimers formation and for inactivation reaction by carbapenems. Thus, we have showed that the five L,D-transpeptidases were functional in vitro. LdtMt1, LdtMt2, LdtMt4 et LdtMt5 were able to form peptidoglycan cross-links binding the third amino acid of a donor tetrapeptide substrate with the third amino acid of an acceptor tetrapeptide substrate. These enzymes were also able to use D-methionine as an acceptor in exchange reaction of D-Ala4 of the donor tetrapeptide substrate. LdtMt1, LdtMt2, LdtMt3 et LdtMt4 formed a covalent adduct with carbapenems. The inactivation reaction of L,D-transpeptidases by carbapenems proceed through two steps. In first, a reversible covalent adduct is formed (catalytic constant k1), followed by a second step leading to acylenzyme formation (catalytic constant k2). The determination of kinetic constants of inactivation k1 et k2 revealed important differences between carbapenems. Except for LdtMt1, Imipenem inactivates L,D-transpeptidases more rapidly than other carbapenems indicating that modification of the carbapenem side chain could be used to optimize their anti-mycobacterial activity. In parallel, we have started the study of the L,D-transpeptidases regulation in various culture conditions will allow identifying the L,D-transpeptidases essential for growth and persistence of M. tuberculosis. This work might lead to identification of essential targets allowing eradication of M. tuberculosis dormant forms, which are difficult to treat with conventional anti-TB drugs.

L’émergence de formes multirésistantes de tuberculose et la résistance intrinsèque de Mycobacterium abscessus à de nombreux anti-infectieux imposent l’identification de nouveaux antibiotiques et de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les mycobactéries sont naturellement peu sensibles aux β-lactamines par production d’une β-lactamase et de cibles atypiques de faible affinité, les L,D-transpeptidases, qui sont efficacement inactivées par une seule classe de β-lactamines, les carbapénèmes. L’objectif de la thèse est d’étudier le mode d’action des β-lactamines afin de proposer des stratégies permettant d’optimiser ces antibiotiques. Pour comprendre la spécificité des L,D-transpeptidases vis-à-vis des carbapénèmes, nous avons étudié la cinétique et le mécanisme de la réaction d’inactivation de ces enzymes par différentes méthodes de spectroscopie en flux arrêté. Nos résultats indiquent que l’efficacité des carbapénèmes est due à leur capacité à former rapidement un intermédiaire tétrahédrique et à la stabilité de l’acylenzyme. La spécificité des L,D-transpeptidases pour les carbapénèmes ne dépend pas de leurs chaînes latérales, qui pourraient être modifiées pour améliorer les propriétés pharmacologiques de ces antibiotiques. Chez M. abscessus, nous avons identifié un inhibiteur de la β-lactamase, l’avibactam, qui augmente l’activité de certaines β-lactamines in vitro, en intracellulaire et dans un modèle d’infection du poisson zèbre. Nos résultats montrent que les β-lactamines peuvent être optimisées pour le traitement des infections dues aux mycobactéries multirésistantes par l’amélioration de l’inactivation des cibles ou l’inhibition des β-lactamases. / The emergence of multidrug-resistant tuberculosis and the intrinsic resistance of Mycobacterium abscessus to most antibiotics require the identification of new drugs and new therapeutic strategies. Mycobacteria are naturally poorly susceptible to β-lactam antibiotics due to production of a β-lactamase and of atypical low-affinity targets, the L,D-transpeptidases, which are effectively inactivated by a single class of β-lactams, the carbapenems. The aim of the thesis is to study the mode of action of β-lactams to propose strategies for the optimization of these antibiotics. To understand the specificity of L,D-transpeptidase for carbapenems, we have studied the kinetics and mechanism of inactivation of these enzymes using various stopped-flow spectroscopic methods. Our results indicate that the efficacy of carbapenems is due to their ability to rapidly form a tetrahedral intermediate and to the stability of the acylenzyme. The specificity of the L,D-transpeptidases for carbapenems does not depend upon the side chains of the drugs, which may be modified to improve their pharmacological properties. In M. abscessus, we have shown that the β-lactamase inhibitor avibactam increases the activity of various β-lactams in vitro, intracellularly, and in zebrafish model. Our results show that β-lactams can be optimized for the treatment of infections due to multidrug-resistant mycobacteria by improving inactivation of the targets and by inhibiting the β-lactamases.

A l’instar des D,D-transpeptidases de la famille des protéines de liaison à la pénicilline (PLP), les L,D-transpeptidases catalysent la formation des ponts interpeptidiques du peptidoglycane. Chez un mutant de Enterococcus faecium, la totalité du peptidoglycane est synthétisée par les L,D-transpeptidases entrainant une résistance à toutes les β-lactamines à l’exception des carbapénèmes. Le peptidoglycane de Mycobacterium tuberculosis étant majoritairement synthétisé par des L,D-transpeptidases, ces enzymes sont une cible potentielle pour le développement de nouveaux traitements de la tuberculose. Les objectifs de cette thèse sont de comprendre la spécificité des L,D­transpeptidases pour les carbapénèmes et d’identifier les sites de fixation des précurseurs du peptidoglycane à ces enzymes. Les résultats montrent que l’oxyanion formé lors de l’attaque du cycle β-lactame des carbapénèmes par la cystéine active est stabilisé dans le site actif des L,D­transpeptidases. Cette stabilisation combinée à l’absence d’hydrolyse de l’acylenzyme conduisent à l’inactivation rapide, totale et irréversible des L,D­transpeptidases par les carbapénèmes. La structure de l’acylenzyme indique que ces propriétés sont indépendantes de la nature de la chaine latérale des antibiotiques qui pourrait être optimisée. La localisation de l’accepteur d’acyle dans la Poche II de Ldtfm ainsi que des interactions supplémentaires avec les chaines glycanes du peptidoglycane montrent que d’autres sites que celui ciblé par les β­lactamines, mimes du donneur d’acyle, sont des cibles pour le développement de nouveaux antibiotiques qui pourraient agir en synergie avec les β­lactamines. / L,D-transpeptidases, as D,D-transpeptidases belonging to the penicillin-binding protein (PBP) family, catalyse the last cross-links step of peptidoglycan biosynthesis. The peptidoglycan of an Enterococcus faecium mutant is exclusively cross-linked by L,D-transpeptidases leading to resistance to all β-lactams except the carbapenems. Since peptidoglycan cross-links are predominantly synthesized by L,D-transpeptidases in Mycobacterium tuberculosis these enzymes are potential targets for chemotherapy of tuberculosis. The aims of the thesis are to identify the kinetic features that account for the specificity of L,D-transpeptidases for carbapenems and to characterise the binding sites for the peptidoglycan precursors in these enzymes. Our results show that the oxyanion resulting from nucleophilic attack of carbapebems by the catalytic cysteine is stabilized into the active site of L,D-transpeptidases. This stabilisation, combined to the absence of hydrolysis of the acylenzyme, leads to the rapid, total and irreversible inactivation of L,D-transpeptidases by carbapenems. Resolution of the acylenzyme structure shows that these kinetic features are independent from the carbapenem side chain that could be modified to optimize the antibiotics. The binding of the acyle acceptor has been identified in Pocket II of Ldtfm that is distinct from the binding site for β-lactams (Pocket I), which mimic the acyle donor. This site and additional peptidoglycan binding sites reveal additional targets for development of new antibiotics that might act in synergy with β-lactams.