Einleitung: Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden zunehmend für klinische Anwendungen bei Pferdepatienten eingesetzt. Für die MSC-Isolation und Expansion ist ein Laborschritt obligatorisch, danach werden die Zellen an den teilnehmenden Tierarzt zurückgesandt. Die Erhaltung der biologischen Eigenschaften von MSCs bzw. die Erhaltung der Qualität der MSCs ist für den Erfolg der Therapie während dieses Transports von größter Bedeutung. Ziele der Untersuchung: Das Ziel der Studie war es, transportbezogene Parameter (Transportbehälter, Medien, Temperatur, Zeit, Zellkonzentration) zu vergleichen, die potenziell Einfluss auf die Eigenschaften der in Kultur expandierten MSC während des Transportes in Suspension haben können. Material und Methoden: Diese Studie wurde in drei Teile geteilt, in welchen (I) fünf verschiedene Transportbehälter (Kryotube, zwei Arten von Plastikspritzen, Glasspritze, CellSeal), (II) sieben verschiedene Transportmedien, vier Temperaturen (4 °C gegen Raumtemperatur, - 20 °C vs. - 80 °C), zwei verschiedene Zeitrahmen (24 h gegen 48 h im positiven Temperaturbereich, 48 h gegen 72 h im negativen Temperaturbereich) und (III) drei MSC-Konzentrationen (5 x 106, 10 x 106, 20 x 106 MSC/ml) für den positiven und negativen Temperaturbereich verglichen wurden. Jeder Teil der Studie wurde unter Verwendung von Proben von sechs Pferden (n = 6) ausgewertet und Differenzierungsprotokolle (adipogene, osteogene und chondrogene) sowie Untersuchung der Vitalität und Proliferationsfähigkeit der MSC wurden für jeden Teil der Studie in doppeltem Einsatz bzw. verdoppelt bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Median und mittlerer Interquartilabstand (IQR) dargestellt (p ≤ 0,05). Eine Anpassung des Signifikanzniveaus bei multiplen Vergleichen wurde mittels Bonferroni- Korrektur durchgeführt. Die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung erfolgte mittels Shapiro- Wilk-Test. Ergebnisse: In Teil I der Studie lieferten die Spritzenmodelle die höheren Werte hinsichtlich des Endvolumens und gleichzeitig erzielte die Glasspritze die beste Zellvitalität. Dieser Behälter wurde für die nachfolgenden Teile der Studie ausgewählt. In Teil II der Studie wurde die höchste Zelllebensfähigkeit mit autologen Knochenmarküberständen als Transportmedium bei 4 °C für 24 h beobachtet (70,6 % gegenüber der Kontrollgruppe 75,3 %). Im Gegensatz dazu war die Lebensfähigkeit für alle Gefrierprotokolle bei -20 °C oder -80 °C, insbesondere bei Knochenmarküberstand oder Plasma und DMSO, unannehmbar niedrig (< 40 %). In Teil III der Studie zeigten die untersuchte Zellkonzentrationen keinen Einfluss auf die ausgewerteten Parameter. Diskussion: In dieser Studie wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, möglicherweise war dies durch die hohe Anzahl von Transportbedingungen, welche gleichzeitig verglichen wurden, sowie die Anzahl der Stichproben (n=6) bedingt. Jedoch ergaben sich wichtige Hinweise zur Verbesserung des Transports der MSC für die klinisch-therapeutische Anwendung. Eine Einschränkung der chondrogenen Differenzierungsfähigkeit der MSC trat unter allen untersuchten Bedingungen auf. Im Vergleich zu früheren Pferdestudien wurde eine niedrigere Lebensfähigkeit der MSC nach dem Auftauen beobachtet. Mögliche Ursachen können unterschiedliche Protokolle beim Einfrieren und Auftauen der MSC sowie die große Anzahl an gleichzeitig bearbeiteten Proben sein. Zukünftige Studien könnten die möglicherweise negativen Auswirkungen des Transports auf die chondrogene Differenzierung klären. Schlussfolgerung: Trotz fehlender signifikanter Unterschiede ist eine deutliche Tendenz erkennbar, dass MSC aus dem Knochenmark schnellstmöglich bei 4 °C in autologem bzw. eigenem Knochenmark-Überstand aus dem Labor zum Patienten, in dem in dieser Studie untersuchten Glasspritzenmodell, zurückgesandt werden sollten.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................1 2 Literaturübersicht ......................................................................................................2 2.1 Der Ursprung mesenchymaler Stromazellen .........................................................2 2.2 Klassifizierung der MSC .........................................................................................3 2.3 Charakterisierung der MSC ....................................................................................4 2.4 Quellen von MSC ...................................................................................................4 2.5 Ablauf der MSC-Therapie beim Pferd ....................................................................4 2.6 Empfehlungen der EMA zur klinisch-therapeutischen Anwendung zellbasierter Therapien ..........................................................................................6 2.7 Rechtliche Aspekte ................................................................................................7 2.8 Tetrazoliumsalze zur Bestimmung der Zellaktivität (WST-1-Reagenztest) .............9 2.9 Zielstellung dieser Arbeit.......................................................................................10 2.10 Hypothese dieser Arbeit......................................................................................10 3 Material und Methoden............................................................................................11 3.1 Versuchspferde ....................................................................................................11 3.2 Allgemeine Schritte für die gesamte Studie ........................................................11 3.2.1 Knochenmarkentnahme beim Pferd .................................................................11 3.2.2 Blutentnahme beim Pferd ..................................................................................13 3.2.3 Probenverarbeitung und Zellkultur ....................................................................13 3.2.4 Isolation der MSC ..............................................................................................14 3.2.5 Bestimmung der Zellzahl ...................................................................................15 3.2.6 Expansion der MSC ..........................................................................................16 3.2.7 Kryokonservierung ............................................................................................16 3.2.8 Auftauen der MSC ............................................................................................16 3.2.9 Bestimmung der Zellvitalität .............................................................................17 3.2.10 Kumulative Populationsverdopplungen (kPV) der MSC ..................................18 3.2.11 Differenzierungspotentiale der MSC ...............................................................18 3.2.11.1 Differenzierung in Monolayer-Zellkultur für die adipogene und osteogene Linie ............................................................................................................................19 3.2.11.1.1 Adipogene Differenzierung ........................................................................19 3.2.11.1.2 Osteogene Differenzierung ........................................................................22 3.2.11.2 Chondrogene Differenzierung (dreidimensionales Modell) ...........................25 3.3 Studiendesign – allgemeine Darstellung ..............................................................32 3.3.1 Teil 1: Untersuchung zur Ermittlung des optimalen Transportbehälters ...........33 3.3.1.1 Studiendesign zum ersten Teil der Studie ......................................................33 3.3.1.2 Zeit0: Vorbereitung der Kontrolle ...................................................................33 3.3.1.3 Zeit0: Vorbereitung der Versuchsbedingungen nach 24 Stunden .................34 3.3.1.4 Transportbehälter ......................................................................................... 34 3.3.1.5 Zeit1: Auswertung der Transportbehälter nach 24 Stunden Inkubationszeit 35 3.3.2 Teil 2: Untersuchung zum optimalen Verhältnis von Medium-Temperatur-Zeit 36 3.3.2.1 Studiendesign zum zweiten Teil der Studie ................................................. 36 3.3.2.2 Untersuchungsbedingungen .........................................................................37 3.3.2.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ........................ 37 3.3.3 Teil 3: Untersuchung zur optimalen Zellkonzentration ..................................... 38 3.3.3.1 Studiendesign zum dritten Teil der Studie .................................................... 38 3.3.3.2 Untersuchungsbedingungen ......................................................................... 39 3.3.3.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ......................... 39 3.4 Statistische Auswertung ..................................................................................... 40 4 Ergebnisse ............................................................................................................. 41 4.1 Teil 1: Behälter .................................................................................................... 41 4.1.1 Evaluierung der Endvolumen pro Behälter ....................................................... 41 4.1.2 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 42 4.1.2.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 42 4.1.2.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 43 4.1.3 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 44 4.1.4 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 45 4.1.4.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 45 4.1.4.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 47 4.1.4.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 49 4.2 Teil 2: Medium, Temperatur und Zeit .................................................................. 53 4.2.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 53 4.2.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 53 4.2.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 54 4.2.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 56 4.2.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 58 4.2.3.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 58 4.2.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 59 4.2.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 61 4.3 Teil 3: Zellkonzentration ...................................................................................... 64 4.3.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 64 4.3.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 64 4.3.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 65 4.3.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 66 4.3.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 67 4.3.3.1 Adipogene Differenzierung .......................................................................... 67 4.3.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 69 4.3.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 71 5 Diskussion .............................................................................................................. 74 5.1 Zielsetzung der geplanten Durchführung ............................................................ 74 5.2 Diskussion zum Material ..................................................................................... 75 5.3 Vorversuche ........................................................................................................ 76 5.3.1 Inkubationsbedingungen ................................................................................. 76 5.3.2 Sechster Behälter ............................................................................................. 76 5.3.3 WST-1-Reagenztest ......................................................................................... 77 5.3.4 Adipogene Differenzierung ............................................................................... 77 5.3.5 Chondrogene Differenzierung .......................................................................... 78 5.3.6 Kryokonservierungsmedium in der Pferdereproduktionsmedizin..................... 79 5.3.7 Die Auswirkung von Druck auf die Zellmembran ............................................. 80 5.4 Diskussion der Ergebnisse und Vergleich mit der Literatur ................................ 80 5.4.1 Diskussion des ersten Teils der Studie............................................................. 80 5.4.2 Diskussion des zweiten Teils der Studie........................................................... 82 5.4.3 Diskussion des dritten Teils der Studie............................................................. 87 5.4.4 Schlussfolgerungen ..........................................................................................87 6 Zusammenfassung ................................................................................................ 89 7 Summary ............................................................................................................... 91 8 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 93