Benznidazol (BZ), fármaco utilizado para o tratamento da doença de Chagas, apresenta eficácia limitada na fase crônica da doença. Falhas terapêuticas foram atribuídas majoritariamente a diferenças na suscetibilidade a BZ entre as cepas do T. cruzi. Resultados prévios de nosso grupo indicam que o gene de um transportador ABC da subfamília G, TcABCG1, encontra-se super-expresso em cepas resistentes a BZ. Transportadores ABCG foram associados a resistência a drogas em vários organismos. O objetivo central do presente estudo foi caracterizar o gene TcABCG1 em cepas de diferentes linhagens e cuja suscetibilidade a BZ foi definida. A sequência do gene TcABCG1 (1.998 pb) de 14 cepas foi determinada. Observamos algumas variações de aminoácidos na proteína ABC entre as cepas. Análises genealógicas de TcABCG1 definiram quatro clados (TcI, TcII, TcIII e Tcbat). Os dois haplótipos das cepas híbridas TcV e TcVI agruparam com os clados TcII e TcIII. Dados de imunofluorescência indireta em epimastigotas indicam que TcABCG1 está localizado em vesículas intracelulares. / Benznidazole (BZ), drug employed for Chagas disease treatment, has limited efficacy in the chronic phase of the disease. Treatment failures have been attributed mostly to differences in BZ susceptibility among T. cruzi strains. Previous data from our group indicate that one ABC transporter gene of the G subfamily, named TcABCG1, is overexpressed in BZ-resistant strains. ABCG transporters have been associated to drug resistance in several organisms. The central goal of the present study was to characterize TcABCG1 gene in strains belonging to different lineages and of defined BZ susceptibility. TcABCG1 gene sequence (1,998 bp) of 14 strains was determined. Few amino acid substitutions were detected in the ABC transporter protein among the strains. Genealogic analyses of TcABCG1 showed four distinct clades (TcI, TcII, TcIII and Tcbat). The two haplotypes of TcV and TcVI hybrid strains clustered with TcII and TcIII clades. Indirect immunofluorescence analysis in epimastigote forms indicated that TcABCG1 is localized to intracellular vesicles.

No description available.

Benznidazol (BZ), fármaco utilizado para o tratamento da doença de Chagas, apresenta eficácia limitada na fase crônica da doença. Falhas terapêuticas foram atribuídas majoritariamente a diferenças na suscetibilidade a BZ entre as cepas do T. cruzi. Resultados prévios de nosso grupo indicam que o gene de um transportador ABC da subfamília G, TcABCG1, encontra-se super-expresso em cepas resistentes a BZ. Transportadores ABCG foram associados a resistência a drogas em vários organismos. O objetivo central do presente estudo foi caracterizar o gene TcABCG1 em cepas de diferentes linhagens e cuja suscetibilidade a BZ foi definida. A sequência do gene TcABCG1 (1.998 pb) de 14 cepas foi determinada. Observamos algumas variações de aminoácidos na proteína ABC entre as cepas. Análises genealógicas de TcABCG1 definiram quatro clados (TcI, TcII, TcIII e Tcbat). Os dois haplótipos das cepas híbridas TcV e TcVI agruparam com os clados TcII e TcIII. Dados de imunofluorescência indireta em epimastigotas indicam que TcABCG1 está localizado em vesículas intracelulares. / Benznidazole (BZ), drug employed for Chagas disease treatment, has limited efficacy in the chronic phase of the disease. Treatment failures have been attributed mostly to differences in BZ susceptibility among T. cruzi strains. Previous data from our group indicate that one ABC transporter gene of the G subfamily, named TcABCG1, is overexpressed in BZ-resistant strains. ABCG transporters have been associated to drug resistance in several organisms. The central goal of the present study was to characterize TcABCG1 gene in strains belonging to different lineages and of defined BZ susceptibility. TcABCG1 gene sequence (1,998 bp) of 14 strains was determined. Few amino acid substitutions were detected in the ABC transporter protein among the strains. Genealogic analyses of TcABCG1 showed four distinct clades (TcI, TcII, TcIII and Tcbat). The two haplotypes of TcV and TcVI hybrid strains clustered with TcII and TcIII clades. Indirect immunofluorescence analysis in epimastigote forms indicated that TcABCG1 is localized to intracellular vesicles.

Pouco se sabe sobre o mecanismo de ação da pentamidina, um composto utilizado no tratamento das leishmanioses. Para uma melhor compreensão do mecanismo de ação assim como o mecanismo de resistência à pentamidina, foi isolado um gene que codifica um membro da família de transportadores ABC, chamado PRP1 capaz de conferir resistência à pentamidina em formas promastigotas e amastigotas de Leishmania spp. O tratamento dos transfectantes que superexpressam a PRP1 com pentamidina em presença de concentrações não tóxicas de verapamil, um inibidor de transportadores ABC, foi capaz de reverter a resistência mediada por esse transportador. Foram ainda isolados nesse estudo duas linhagens de L. amazonensis resistentes à pentamidina. A análise molecular dos parasitos indicou que esses mutantes não apresentaram nenhuma amplificação de DNA, inclusive do gene PRP1 que também não se mostrou superexpresso em ambas as linhagens. As duas linhagens resistentes à pentamidina tiveram sua resistência revertida quando tratadas com verapamil, indicando que o mecanismo de resistência nesses mutantes pode estar associado a um transportador ABC. Os resultados obtidos nesse estudo fornecem dados para uma melhor compreensão do mecanismo de resistência à pentamidina e sugerem um provável potencial da associação pentamidina e verapamil no tratamento da doença. / Little it is known about the mechanism of action of pentamidine, an compound used for leishmaniases chemotherapy. To understand the mechanism of action and resistance of pentamidine, it was isolated a gene that codifies a member of ABC transporter family, named as PRP1 able to confer pentamidine resistance in promastigotes and amastigotes of Leishmania spp. Treatment of transfectants overexpressing PRP1 with pentamidine in presence of non toxic concentration of verapamil, an inhibitor of ABC transporters, was able to reverse the drug resistance mediated by this transporter. Two lines of L. amazonensis resistant to pentamidine were selected. Molecular analysis of parasites indicated that these mutants do not contain amplified DNA, including the PRP1 gene either not associated with overexpression in both lines. The two lines resistant to pentamidine had their resistance reversed when treated with verapamil, indicating that the mechanism of resistance may be associated to an ABC transporter. The results of this work lead to new insights for a better understanding of the mechanism of of resistance suggesting a probably potencial of pentamidine and verapamil association in the chemotherapy.

Pouco se sabe sobre o mecanismo de ação da pentamidina, um composto utilizado no tratamento das leishmanioses. Para uma melhor compreensão do mecanismo de ação assim como o mecanismo de resistência à pentamidina, foi isolado um gene que codifica um membro da família de transportadores ABC, chamado PRP1 capaz de conferir resistência à pentamidina em formas promastigotas e amastigotas de Leishmania spp. O tratamento dos transfectantes que superexpressam a PRP1 com pentamidina em presença de concentrações não tóxicas de verapamil, um inibidor de transportadores ABC, foi capaz de reverter a resistência mediada por esse transportador. Foram ainda isolados nesse estudo duas linhagens de L. amazonensis resistentes à pentamidina. A análise molecular dos parasitos indicou que esses mutantes não apresentaram nenhuma amplificação de DNA, inclusive do gene PRP1 que também não se mostrou superexpresso em ambas as linhagens. As duas linhagens resistentes à pentamidina tiveram sua resistência revertida quando tratadas com verapamil, indicando que o mecanismo de resistência nesses mutantes pode estar associado a um transportador ABC. Os resultados obtidos nesse estudo fornecem dados para uma melhor compreensão do mecanismo de resistência à pentamidina e sugerem um provável potencial da associação pentamidina e verapamil no tratamento da doença. / Little it is known about the mechanism of action of pentamidine, an compound used for leishmaniases chemotherapy. To understand the mechanism of action and resistance of pentamidine, it was isolated a gene that codifies a member of ABC transporter family, named as PRP1 able to confer pentamidine resistance in promastigotes and amastigotes of Leishmania spp. Treatment of transfectants overexpressing PRP1 with pentamidine in presence of non toxic concentration of verapamil, an inhibitor of ABC transporters, was able to reverse the drug resistance mediated by this transporter. Two lines of L. amazonensis resistant to pentamidine were selected. Molecular analysis of parasites indicated that these mutants do not contain amplified DNA, including the PRP1 gene either not associated with overexpression in both lines. The two lines resistant to pentamidine had their resistance reversed when treated with verapamil, indicating that the mechanism of resistance may be associated to an ABC transporter. The results of this work lead to new insights for a better understanding of the mechanism of of resistance suggesting a probably potencial of pentamidine and verapamil association in the chemotherapy.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1393738 bytes, checksum: a972ec00e49dcfa2c5d44a8c6f9480a0 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The plants produce antifungous proteins and specialized antibiotics (phytoanticipins and phytoalexins) in order to defend from phytopathogenic fungus. Only the pathogens able to avoid those defensive plant responses at the initial stages of the infection are able to cause disease. The fungus Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Briosi & Cavara is the etiological agent of the anthracnose in the common bean plant (Phaseolus vulgaris L.), that is an important disease contributing to reduce the productivity of the bean plant crop in Brazil. The genes abcCl1 and cypCl1 were isolated from this phytopathogen and their deduced aminoacid sequences have high similarity with ABC transporters and cytochromes P450, respectively. Those genes are found in unique copy and clustered in genome of the fungus, as revealed by either the sequencing of one DNA 8,4 kb fragment from the genomic library of C. lindemuthianum and the hybridization profile. Those genes also show an increased expression in response to different toxic compounds, mainly when the fungus is grown at the presence of eugenol, hygromycin and pisatin phytoalexin. Therefore, besides their genes to be physically linked, the proteins ABCCl1 and CYPCl1 can also be involved in the same functional process: the fungus resistance to the toxic compounds produced by plants or antagonistic microorganisms. In the functional analysis of the gene abcCl1, the mutants abcCl1− showed reduction in their virulence to the leaf of the common bean plant, compared with the wild line of C. lindemuthianum. Those results indicate the gene abcCl1 to codify an ABC transporter that is necessary to pathogenicity of C. lindemuthianum, probably because providing the fungus with the ability to overcome the defense mechanism of the plant. The cytochrome P450, that is codified by the gene cypCl1, can represent a complementary detoxification mechanism used by this fungus during the establishment of the disease. / Para se defenderem de fungos fitopatogênicos, as plantas produzem proteínas antifúngicas e antibióticos especializados (fitoanticipinas e fitoalexinas). Somente patógenos que conseguem evitar estas respostas defensivas da planta nos estágios iniciais da infecção são capazes de causar doença. O fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Briosi & Cavara é o agente etiológico da antracnose do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), uma importante doença que contribui para redução da produtividade da cultura do feijoeiro no Brasil. Neste fitopatógeno foram isolados dois genes, abcCl1 e cypCl1, cujas sequências de aminoácidos deduzidas possuem alta similaridade com transportadores ABC e citocromos P450, respectivamente. Estes genes estão presentes em cópia única e agrupados no genoma do fungo, conforme revelado no sequenciamento de um fragmento de DNA de 8,4 kb da biblioteca genômica de C. lindemuthianum, bem como no perfil de hibridização. Estes genes também apresentam aumento de expressão em resposta a diferentes compostos tóxicos, principalmente quando o fungo é crescido na presença de eugenol, higromicina ou fitoalexina pisatina. Assim, além de seus genes estarem ligados fisicamente, as proteínas ABCCl1 e CYPCl1 podem, também, estarem envolvidas em um mesmo processo funcional: a resistência do fungo a compostos tóxicos produzidos por plantas ou microrganismos antagonistas. Na análise funcional do gene abcCl1, foi observado que mutantes abcCl1− apresentam redução na virulência a folhas de feijoeiro comum, em comparação com a linhagem selvagem de C. lindemuthianum. Estes resultados indicam que o gene abcCl1 codifica um transportador ABC, que é necessário para a patogenicidade de C. lindemuthianum, provavelmente por conferir ao fungo a capacidade de superar algum mecanismo de defesa da planta. O citocromo P450, codificado pelo gene cypCl1, pode representar um mecanismo complementar de destoxificação empregado por este fungo durante o estabelecimento da doença.