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Estudo da imunoexpressão dos transportadores de glicose 1 e 3 e do índice angiogênico em tumores odontológicos ceratocísticos isolados e associados à Síndrome de Gorlin

Leite, Rafaella Bastos 30 July 2014 (has links)
Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-03-15T13:08:48Z No. of bitstreams: 1 PDF - Rafaella Bastos Leite.pdf: 1326501 bytes, checksum: 57e6fffb3bbe74433cba4f469a5b6545 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-21T21:05:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Rafaella Bastos Leite.pdf: 1326501 bytes, checksum: 57e6fffb3bbe74433cba4f469a5b6545 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-21T21:05:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Rafaella Bastos Leite.pdf: 1326501 bytes, checksum: 57e6fffb3bbe74433cba4f469a5b6545 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T21:05:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Rafaella Bastos Leite.pdf: 1326501 bytes, checksum: 57e6fffb3bbe74433cba4f469a5b6545 (MD5) Previous issue date: 2014-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The keratocystic odontogenic tumor (KOT) stands out among the other odontogenic lesions in view of the potentially aggressive biological behavior and its association in some cases, with the Gorlin syndrome. Some studies have suggested a more aggressive biological behavior for KOTs associated with Gorlin syndrome, compared to isolated KOTs, characterized by greater growth capacity and bone infiltration and higher tendency to recur. The present study aimed to evaluate, descriptively and comparatively, by means of immunohistochemistry, the expression of glucose transporter-1 (GLUT-1) and -3 (GLUT-3) and the angiogenic index (CD34) in isolated primary and recurrent KOTs and in KOTs associated with Gorlin syndrome. The sample was composed by 21 isolated KOTs (14 primary and 7 recurrent) and 14 KOTs associated with Gorlin syndrome. The expression of GLUTs was evaluated in the epithelial component of the lesions, establishing the percentage of immunopositive cells, according to the scores: score 0 (negative), score 1 (≤ 25% of positive cells), score 2 (26% - 50% of positive cells), score 3 (51% - 75% of positive cells), and score 4 (≥ 76% positive cells). For the angiogenic index, the microvessel count (MVC) technique was applied, quantifying the microvessels immunoreactive to anti-CD34 antibody. Regarding the median scores for immunopositivity for GLUT-1 and the angiogenic index, comparisons between groups were performed using the nonparametric Kruskal-Wallis test. For GLUT-3, the data obtained from the evaluation of epithelial expression of this protein were submitted to descriptive statistical analysis. Possible correlations between the scores of immunopositivity for GLUT-1 and angiogenic index in the lesions were evaluated using the Spearman correlation test. The level of significance was set at 5% (p <0.05). The analysis of epithelial GLUT-1 immunoreactivity revealed predominance of score 4 in isolated primary KOTs (n = 9, 64.3%) and in KOTs associated with Gorlin syndrome (n = 8; 57.1%). In isolated recurrent KOTs, it was identified a slightly higher frequency of cases with scores 4 (n = 3; 42.9%) and 2 (n = 2; 28.6%). The nonparametric Kruskal-Wallis test showed no statistically significant difference between groups (p = 0.406). Regarding the GLUT-3, all groups showed higher frequency of negative cases. The few KOTs positive for GLUT-3 were classified as score 1 (≤ 25% of positive cells), showing a low expression of this protein in the epithelial component. The mean number of microvessels was 63.80 in isolated primary KOTs, 61.11 in KOTs associated with the Gorlin syndrome, and 65.88 in isolated recurrent KOTs, without significant differences between groups (p = 0.965). The results of this study suggest that the differences in biological behavior of isolated KOTs and KOTs associated with Gorlin syndrome may not be related to the expression of GLUTs-1 and -3, or to the angiogenic index in the lesions. The high expression of GLUT-1 in KOTs suggests an important role for this protein in glucose uptake by the epithelial cells of these tumors. / O tumor odontogênico ceratocístico (TOC) se destaca entre as demais lesões odontogênicas em virtude do comportamento biológico potencialmente agressivo e por sua associação, em alguns casos, à síndrome de Gorlin. Pesquisas tem sugerido um comportamento biológico mais agressivo para os TOCs associados à síndrome de Gorlin, em comparação aos TOCs isolados, caracterizado por maior capacidade de crescimento e infiltração óssea e maior tendência a recorrência. O presente estudo se propôs a avaliar, descritiva e comparativamente, a imunoexpressão dos transportadores de glicose-1 (GLUT-1) e -3 (GLUT-3) e o índice angiogênico (CD34) em TOCs isolados primários e recorrentes e TOCs associados à síndrome de Gorlin. A amostra foi composta por 21 TOCs isolados (14 primários e 7 recorrentes) e 14 TOCs associados à síndrome de Gorlin. A expressão dos GLUTs foi avaliada no componente epitelial das lesões, estabelecendo-se o percentual de células imunopositivas, de acordo com os escores: escore 0 (negativo), escore 1 (≤ 25% das células positivas), escore 2 (26% - 50% das células positivas), escore 3 (51% - 75% das células positivas) e escore 4 (≥76% das células positivas). Para o índice angiogênico, foi empregada a técnica da contagem microvascular (MVC), quantificando-se os microvasos imunomarcados pelo anticorpo anti-CD34. Em relação às medianas para os escores de imunopositividade para GLUT-1 e para o índice angiogênico, as comparações entre os grupos foram realizadas por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Para o GLUT-3, os dados obtidos com a avaliação da expressão epitelial desta proteína foram submetidos apenas à análise estatística descritiva. Possíveis correlações entre os escores de imunopositividade para GLUT-1 e o índice angiogênico nas lesões foram avaliadas por meio do teste de correlação de Spearman. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05). A análise da imunoexpressão epitelial de GLUT-1 revelou predomínio de casos com escore 4 nos TOCs isolados primários (n = 9; 64,3%) e nos TOCs associados à síndrome de Gorlin (n = 8; 57,1%). Nos TOCs isolados recorrentes, foi identificada frequência discretamente maior para os casos com escores 4 (n = 3; 42,9%) e 2 (n = 2; 28,6%). O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis revelou ausência de diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p = 0,406). Em relação ao GLUT-3, todos os grupos estudados revelaram maior frequência de casos negativos. Os poucos TOCs positivos para GLUT-3 foram classificados como escore 1 (≤ 25% das células positivas), revelando uma baixa expressão desta proteína no componente epitelial. O número médio de microvasos foi de 63,80 nos TOCs isolados primários, 61,11 nos TOCs associados a síndrome de Gorlin e 65,88 nos TOCs isolados recorrentes, sem diferenças significativas entre os grupos (p = 0,965). Os resultados do presente estudo sugerem que as diferenças no comportamento biológico de TOCs isolados e TOCs associados à síndrome de Gorlin não foram relacionadas com a expressão de GLUTs-1 e -3 ou com o índice angiogênico (CD34) nas lesões. A alta expressão de GLUT-1 em TOCs sugere um importante papel para esta proteína na captação de glicose pelas células epiteliais destes tumores.
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Fisiologia molecular digestiva da larva de Musca domestica / Digestive molecular physiology of Musca domestica larvae

Pimentel, André Coppe 21 November 2011 (has links)
A digestão nos insetos ocorre no intestino médio de forma compartimentada. A digestão inicial dos polímeros ocorre no interior da membrana peritrófica. Os oligômeros resultantes difundem-se para o espaço luminal exterior à membrana peritrófica onde são atacados por outras enzimas. Na digestão final os dímeros resultantes são hidrolisados por enzimas imobilizadas na superfície do epitélio do intestino médio. Após o processo de digestão final os monômeros são absorvidos pelas células do epitélio intestinal. Os Díptera ditos superiores, incluindo a mosca doméstica, apresentam peculiaridades digestivas que aparentemente resultam de adaptações para digerir uma dieta que consiste principalmente de bactérias. No ventrículo anterior ocorre uma diminuição no conteúdo de amido do bolo alimentar. Na porção seguinte, o bolo alimentar passa para o ventrículo médio onde as bactérias são mortas pela ação combinada de baixo pH, uma lisozima digestiva e uma proteinase tipo catepsina D. O material liberado das bactérias é digerido no ventrículo posterior, como ocorre no ventrículo inteiro da maioria dos insetos de outros grupos taxonômicos. Com o objetivo de compreender a peculiar digestão em Musca domestica, foram utilizadas suas larvas para identificar funcionalmente as regiões absortivas de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas na absorção de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas com tamponamento e fluxos de fluidos intestinais, sequenciar as enzimas digestivas principais e identificar os seus sítios de secreção. Experimentos fisiológicos de absorção de glicose e análises de atividade enzimática permitiram acessar de maneira direta os aspectos da digestão. Contudo, experimentos de sequenciamento de bibliotecas de cDNA, análise de sequências transcritas e verificação de expressão de genes em diferentes tecidos foram abordagens fundamentais na identificação das moléculas subjacentes aos processos fisiológicos intestinas de Musca domestica. Os indícios de que absorção de glicose no intestino de Musca domestica se dê por transportadores do tipo SGLT, com a possível participação de facilitadores do tipo GLUT, permitem estabelecer um foco para futuros estudos. A descrição de sequências relacionadas ao tamponamento intestinal permitiu ampliar a discussão sobre tal processo. Ao detalhar os sítios de expressão da subunidade a da V-ATPase, do canal de cloreto e do transportador de amônia foi possível testar o modelo de tamponamento proposto anteriormente e propor a participação de outras moléculas no processo. Sequências correspondentes as atividades de carboxipeptidase, maltase e aminopeptidase descritas na literatura foram pesquisadas, gerando sequências candidatas a codificarem as referidas enzimas. Com isso, é possível descrever a digestão de oligômeros e dímeros com base nos genes transcritos e nas sequências de aminoácidos que formam as enzimas digestivas. A descoberta da sequência que transcreve uma metaloproteinase, por sua vez, abre caminhos para a descrição e caracterização de sua atividade proteolítica nos tecidos digestivos da larva de Musca domestica. Essa análise permitiu também elucidar a localização dos sítios de expressão e, portanto, as zonas de secreção de enzimas. De maneira geral, este estudo contribuiu para a compreensão de diversos aspectos da digestão de Musca domestica, elucidando questões da particular fisiologia digestiva desse inseto. / Digestion in insects occurs in the midgut in a compartmentalized way. Initial digestion takes place inside the peritrophic membrane. The resulting oligomers diffuse into the luminal space outside the peritrophic membrane where they are hydrolyzed by other enzymes. In the final digestion, the resulting dimers are hydrolyzed by enzymes immobilized on the midgut epithelium. After the final digestion, the monomers are absorbed by intestinal epithelial cells. The so-called higher Diptera, including the house fly, have digestive peculiarities apparently resulting of adaptations to digest a diet consisting mainly of bacteria. In the anterior midgut there is a decrease in the starch content of the food bolus. The bolus now passes into the middle midgut, where bacteria are killed by the combined action of low pH, a special lysozyme and a cathepsin D-like proteinase. Finally, the material released by bacteria is digested in the posterior midgut, as is observed in the whole midgut of insects of other taxa. In order to understand the peculiar digestion in Musca domestica, the larvae were used to identify (a) the functionally the nutrient absorptive regions, (b) the molecules involved in the absorption of nutrients, (c) the molecules involved in buffering and fluid flows, (d) the cDNA sequences corresponding to intestinal digestive enzymes, (e) the main sites of secretion. Physiological experiments of glucose absorption and enzyme activity analysis allowed a direct access to aspects of digestion. Otherwise, cDNA library sequencing followed by sequence annotation and tissue-specific expression analysis were fundamental approaches in the understanding of intestinal physiology of Musca domestica. Evidence that glucose absorption in the gut of Musca domestica occurs through SGLT-like transporters, with the possible participation of facilitators GLUT-like, allowed us to establish a focus for future studies. The description of cDNA sequences corresponding to proteins putatively responsible for intestinal buffering widened the discussion of this process. The finding of the expression sites of V-ATPase subunits, chloride channel, and ammonia transporter led to revising the present buffering model and the inclusion of other molecules in the process. The cDNA sequences corresponding to the activities of carboxypeptidase, aminopeptidase and maltase described in the literature were searched for as candidate sequences to encode those enzymes. This made it possible to describe the digestion of oligomers and dimers based on transcribed genes and enzyme amino acid sequences. The discovery of the metalloproteinase transcribing sequence opened a new research line: the description and characterization of its proteolytic activity in the midgut of the Musca domestica larvae. This study also allowed elucidating the location of digestive enzyme expression sites and, therefore, the putative zones of enzyme secretion. Overall, this study contributed to understanding many aspects of digestion of Musca domestica, clarifying aspects of the peculiar digestive physiology of this insect.
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Fisiologia molecular digestiva da larva de Musca domestica / Digestive molecular physiology of Musca domestica larvae

André Coppe Pimentel 21 November 2011 (has links)
A digestão nos insetos ocorre no intestino médio de forma compartimentada. A digestão inicial dos polímeros ocorre no interior da membrana peritrófica. Os oligômeros resultantes difundem-se para o espaço luminal exterior à membrana peritrófica onde são atacados por outras enzimas. Na digestão final os dímeros resultantes são hidrolisados por enzimas imobilizadas na superfície do epitélio do intestino médio. Após o processo de digestão final os monômeros são absorvidos pelas células do epitélio intestinal. Os Díptera ditos superiores, incluindo a mosca doméstica, apresentam peculiaridades digestivas que aparentemente resultam de adaptações para digerir uma dieta que consiste principalmente de bactérias. No ventrículo anterior ocorre uma diminuição no conteúdo de amido do bolo alimentar. Na porção seguinte, o bolo alimentar passa para o ventrículo médio onde as bactérias são mortas pela ação combinada de baixo pH, uma lisozima digestiva e uma proteinase tipo catepsina D. O material liberado das bactérias é digerido no ventrículo posterior, como ocorre no ventrículo inteiro da maioria dos insetos de outros grupos taxonômicos. Com o objetivo de compreender a peculiar digestão em Musca domestica, foram utilizadas suas larvas para identificar funcionalmente as regiões absortivas de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas na absorção de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas com tamponamento e fluxos de fluidos intestinais, sequenciar as enzimas digestivas principais e identificar os seus sítios de secreção. Experimentos fisiológicos de absorção de glicose e análises de atividade enzimática permitiram acessar de maneira direta os aspectos da digestão. Contudo, experimentos de sequenciamento de bibliotecas de cDNA, análise de sequências transcritas e verificação de expressão de genes em diferentes tecidos foram abordagens fundamentais na identificação das moléculas subjacentes aos processos fisiológicos intestinas de Musca domestica. Os indícios de que absorção de glicose no intestino de Musca domestica se dê por transportadores do tipo SGLT, com a possível participação de facilitadores do tipo GLUT, permitem estabelecer um foco para futuros estudos. A descrição de sequências relacionadas ao tamponamento intestinal permitiu ampliar a discussão sobre tal processo. Ao detalhar os sítios de expressão da subunidade a da V-ATPase, do canal de cloreto e do transportador de amônia foi possível testar o modelo de tamponamento proposto anteriormente e propor a participação de outras moléculas no processo. Sequências correspondentes as atividades de carboxipeptidase, maltase e aminopeptidase descritas na literatura foram pesquisadas, gerando sequências candidatas a codificarem as referidas enzimas. Com isso, é possível descrever a digestão de oligômeros e dímeros com base nos genes transcritos e nas sequências de aminoácidos que formam as enzimas digestivas. A descoberta da sequência que transcreve uma metaloproteinase, por sua vez, abre caminhos para a descrição e caracterização de sua atividade proteolítica nos tecidos digestivos da larva de Musca domestica. Essa análise permitiu também elucidar a localização dos sítios de expressão e, portanto, as zonas de secreção de enzimas. De maneira geral, este estudo contribuiu para a compreensão de diversos aspectos da digestão de Musca domestica, elucidando questões da particular fisiologia digestiva desse inseto. / Digestion in insects occurs in the midgut in a compartmentalized way. Initial digestion takes place inside the peritrophic membrane. The resulting oligomers diffuse into the luminal space outside the peritrophic membrane where they are hydrolyzed by other enzymes. In the final digestion, the resulting dimers are hydrolyzed by enzymes immobilized on the midgut epithelium. After the final digestion, the monomers are absorbed by intestinal epithelial cells. The so-called higher Diptera, including the house fly, have digestive peculiarities apparently resulting of adaptations to digest a diet consisting mainly of bacteria. In the anterior midgut there is a decrease in the starch content of the food bolus. The bolus now passes into the middle midgut, where bacteria are killed by the combined action of low pH, a special lysozyme and a cathepsin D-like proteinase. Finally, the material released by bacteria is digested in the posterior midgut, as is observed in the whole midgut of insects of other taxa. In order to understand the peculiar digestion in Musca domestica, the larvae were used to identify (a) the functionally the nutrient absorptive regions, (b) the molecules involved in the absorption of nutrients, (c) the molecules involved in buffering and fluid flows, (d) the cDNA sequences corresponding to intestinal digestive enzymes, (e) the main sites of secretion. Physiological experiments of glucose absorption and enzyme activity analysis allowed a direct access to aspects of digestion. Otherwise, cDNA library sequencing followed by sequence annotation and tissue-specific expression analysis were fundamental approaches in the understanding of intestinal physiology of Musca domestica. Evidence that glucose absorption in the gut of Musca domestica occurs through SGLT-like transporters, with the possible participation of facilitators GLUT-like, allowed us to establish a focus for future studies. The description of cDNA sequences corresponding to proteins putatively responsible for intestinal buffering widened the discussion of this process. The finding of the expression sites of V-ATPase subunits, chloride channel, and ammonia transporter led to revising the present buffering model and the inclusion of other molecules in the process. The cDNA sequences corresponding to the activities of carboxypeptidase, aminopeptidase and maltase described in the literature were searched for as candidate sequences to encode those enzymes. This made it possible to describe the digestion of oligomers and dimers based on transcribed genes and enzyme amino acid sequences. The discovery of the metalloproteinase transcribing sequence opened a new research line: the description and characterization of its proteolytic activity in the midgut of the Musca domestica larvae. This study also allowed elucidating the location of digestive enzyme expression sites and, therefore, the putative zones of enzyme secretion. Overall, this study contributed to understanding many aspects of digestion of Musca domestica, clarifying aspects of the peculiar digestive physiology of this insect.
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Efeito da glicose sobre recuperação do pHi em células HEK-293. / Effect of glucose on pHi recovery in HEK-293 cells.

Silva, Olivia Beloto da 03 March 2009 (has links)
Os estudos foram realizados em cultura de células HEK-293 (human embrionic kidney cells). Por microscopia de fluorescência, avaliou-se a velocidade de recuperação do pHi (dpHi/dt). Por Western blot, avaliou-se a expressão de SGLTs e NHEs e a translocação dos SGLTs foi avaliada por imunofluorescência. Resultados: No controle, a dpHi/dt foi de 0,169 ± 0,020 unid pH/min (n=6). A glicose modula dose e tempo dependentemente a dpHi/dt. O tratamento crônico aumentou esse parâmetro e somente Florizina (inibidor dos SGLTs), H-89 (inibidor da PKA) e BAPTA (quelante de Ca2+intracelular Ca2+i) reduziram esse efeito. O tratamento crônico induziu a internalização do SGLT1, manteve o SGLT2 no citosol e aumentou sua expressão. Conclusões: No tratamento crônico, a internalização do SGLT1 depende da PKA, independe de Ca2+i e a permanência do SGLT2 no citosol depende tanto da PKA quanto do Ca2+i. Assim, a distribuição celular do SGLT2 altera a atividade dos NHEs. / In this work we used human embryonic kidney (HEK-293 cells). The pHi recovery rate (dpHi/dt) was evaluated through fluorescence microscopy. The expression of SGLT´s and NHEs was analysed through Western blot and translocation of SGLTs was evaluated through Imunofluorescence. Results: In the control situation, the dpHi/dt was 0,169 ± 0,020 units pH/min (n=6). This parameter was modulated by glucose in a concentration and time dependent manner. Chronic treatment increased the dpHi/dt and this stimulatory effect was inhibited by Phlorizin (SGLTs inhibitor), H-89 (PKA inhibitor) and BAPTA (intracellular Ca2+ cheleator - Ca2+i). The chronic treatment induced internalization of SGLT1, increased the expression of SGLT2 and kept it in the cytosol. Conclusions: In chronic treatment, the internalization of SGLT1 involves a PKA-dependent and Ca2+i- independent mechanism. The maintenance of SGLT2 in the cytosol depends on PKA and Ca2+i. Thus, the cellular distribution of SGLT2 is associated with NHEs activity.
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Efeito da glicose sobre recuperação do pHi em células HEK-293. / Effect of glucose on pHi recovery in HEK-293 cells.

Olivia Beloto da Silva 03 March 2009 (has links)
Os estudos foram realizados em cultura de células HEK-293 (human embrionic kidney cells). Por microscopia de fluorescência, avaliou-se a velocidade de recuperação do pHi (dpHi/dt). Por Western blot, avaliou-se a expressão de SGLTs e NHEs e a translocação dos SGLTs foi avaliada por imunofluorescência. Resultados: No controle, a dpHi/dt foi de 0,169 ± 0,020 unid pH/min (n=6). A glicose modula dose e tempo dependentemente a dpHi/dt. O tratamento crônico aumentou esse parâmetro e somente Florizina (inibidor dos SGLTs), H-89 (inibidor da PKA) e BAPTA (quelante de Ca2+intracelular Ca2+i) reduziram esse efeito. O tratamento crônico induziu a internalização do SGLT1, manteve o SGLT2 no citosol e aumentou sua expressão. Conclusões: No tratamento crônico, a internalização do SGLT1 depende da PKA, independe de Ca2+i e a permanência do SGLT2 no citosol depende tanto da PKA quanto do Ca2+i. Assim, a distribuição celular do SGLT2 altera a atividade dos NHEs. / In this work we used human embryonic kidney (HEK-293 cells). The pHi recovery rate (dpHi/dt) was evaluated through fluorescence microscopy. The expression of SGLT´s and NHEs was analysed through Western blot and translocation of SGLTs was evaluated through Imunofluorescence. Results: In the control situation, the dpHi/dt was 0,169 ± 0,020 units pH/min (n=6). This parameter was modulated by glucose in a concentration and time dependent manner. Chronic treatment increased the dpHi/dt and this stimulatory effect was inhibited by Phlorizin (SGLTs inhibitor), H-89 (PKA inhibitor) and BAPTA (intracellular Ca2+ cheleator - Ca2+i). The chronic treatment induced internalization of SGLT1, increased the expression of SGLT2 and kept it in the cytosol. Conclusions: In chronic treatment, the internalization of SGLT1 involves a PKA-dependent and Ca2+i- independent mechanism. The maintenance of SGLT2 in the cytosol depends on PKA and Ca2+i. Thus, the cellular distribution of SGLT2 is associated with NHEs activity.
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O SP1 (transcription factor Sp1) participa da regulação transcricional do Slc2a4 mediada pelo receptor  de estrógeno ER-alfa em adipócitos 3T3-L1 / SP1 (transcription factor Sp1) participates in the transcriptional regulation of Slc2a4 mediated by estrogen receptor ER-alpha in 3T3-L1 adipocytes

Andrade, João Nilton Barreto 15 May 2018 (has links)
O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é caracterizado pela presença de resistência à insulina, a qual pode ser modulada pelo estrógeno, tanto em fêmeas como em machos. Nesse processo, o transportador de glicose GLUT4 (gene Slc2a4, solute carrier family 2 member 4) desempenha papel importante, pois aumento da expressão do GLUT4 melhora o controle glicêmico. Estradiol (E2) regula a expressão do Slc2a4 por meio do balanço dos efeitos contrários de seus receptores (ERs): ER-alfa estimula e ER-beta inibe a expressão. Efeitos transcricionais dos ERs envolvem a participação de co-reguladores, destacadamente o SP1 (transcription factor Sp1), potente estimulador do Slc2a4. Entretanto, o papel do SP1 na regulação do Slc2a4 mediada pelos ERs é desconhecido; e este foi o objetivo do presente estudo. Investigou-se adipócitos maduros 3T3-L1, tratados por 24 horas com E2, agonista de ER-alfa (PPT) ou agonista de ER-beta (DPN). Avaliou-se: a expressão gênica (RT-qPCR) de Slc2a4 e Sp1; o conteúdo (Western blotting) total de GLUT4 e o nuclear de ER-alfa/beta e SP1; a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4 (ensaio de mobilidade eletroforética); e a formação de complexos SP1/ER-alfa (imunoprecipitação). Os resultados confirmaram que E2 aumenta a expressão de Slc2a4/GLUT4 pela ação preponderante do ER-alfa. O agonista PPT aumentou: o conteúdo nuclear de SP1, a interação SP1/ER-alfa e a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4. O agonista DPN indicou que a ação repressora do ER-beta não envolve o SP1. Conclui-se que o efeito estimulador do ER-alfa na expressão do Slc2a4 envolve mecanismo de transativação gênica via SP1. Essas observações colocam a cooperação ER-alfa/SP1 como um novo alvo para o desenvolvimento de medidas terapêuticas para resistência à insulina e diabetes mellitus tipo 2 / Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is characterized by insulin resistance, which can be modulated by estrogen in both females and males. In this process, the glucose transporter GLUT4 (solute carrier family 2 member 4 gene - Slc2a4) plays an important role, since increasing GLUT4 expression improves glycemic control. Estradiol (E2) regulates the expression of Slc2a4, by a mechanism in which estrogen receptors (ERs) play opposite effects: ER-alpha stimulates, whereas ER-beta inhibits the expression. Transcriptional effects of ERs involve co-regulators, notably the transcription factor SP1, a powerful enhancer of Slc2a4. However, the role of SP1 in the ERs-mediated regulation of Slc2a4 is unknown; and that was the aim of the present study. Differentiated adipocytes 3T3-L1 were treated (24 hours) with E2, ER-alpha agonist (PPT) or ER-beta agonist (DPN). It was analyzed: gene expression (RT-qPCR) of Slc2a4 and Sp1; total content o GLUT4 and nuclear content of ER-alpha/beta and SP1 (Western blotting); binding activity of SP1 into Slc2a4 promoter (electrophoretic mobility shift assay); and content of nuclear SP1/ER-alpha complexes (immunoprecipitation). Results confirmed that E2 increases the expression of Slc2a4/GLUT4, by the dominant effect of ER-alpha. The ER-alpha agonist PPT increased the nuclear content of SP1, the interaction of SP1/ER-alpha, and the binding activity of SP1 into the Slc2a4. The agonist DPN evinced that ER-beta activity does not involve the SP1. In conclusion, the enhancer effect of ER-alpha upon Slc2a4 gene expression involves a transactivation mechanism via SP1. This observation point outs the cooperation of ER-alpha/SP1 as a new target for the development of approaches to treat insulin resistance and T2DM
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O SP1 (transcription factor Sp1) participa da regulação transcricional do Slc2a4 mediada pelo receptor  de estrógeno ER-alfa em adipócitos 3T3-L1 / SP1 (transcription factor Sp1) participates in the transcriptional regulation of Slc2a4 mediated by estrogen receptor ER-alpha in 3T3-L1 adipocytes

João Nilton Barreto Andrade 15 May 2018 (has links)
O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é caracterizado pela presença de resistência à insulina, a qual pode ser modulada pelo estrógeno, tanto em fêmeas como em machos. Nesse processo, o transportador de glicose GLUT4 (gene Slc2a4, solute carrier family 2 member 4) desempenha papel importante, pois aumento da expressão do GLUT4 melhora o controle glicêmico. Estradiol (E2) regula a expressão do Slc2a4 por meio do balanço dos efeitos contrários de seus receptores (ERs): ER-alfa estimula e ER-beta inibe a expressão. Efeitos transcricionais dos ERs envolvem a participação de co-reguladores, destacadamente o SP1 (transcription factor Sp1), potente estimulador do Slc2a4. Entretanto, o papel do SP1 na regulação do Slc2a4 mediada pelos ERs é desconhecido; e este foi o objetivo do presente estudo. Investigou-se adipócitos maduros 3T3-L1, tratados por 24 horas com E2, agonista de ER-alfa (PPT) ou agonista de ER-beta (DPN). Avaliou-se: a expressão gênica (RT-qPCR) de Slc2a4 e Sp1; o conteúdo (Western blotting) total de GLUT4 e o nuclear de ER-alfa/beta e SP1; a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4 (ensaio de mobilidade eletroforética); e a formação de complexos SP1/ER-alfa (imunoprecipitação). Os resultados confirmaram que E2 aumenta a expressão de Slc2a4/GLUT4 pela ação preponderante do ER-alfa. O agonista PPT aumentou: o conteúdo nuclear de SP1, a interação SP1/ER-alfa e a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4. O agonista DPN indicou que a ação repressora do ER-beta não envolve o SP1. Conclui-se que o efeito estimulador do ER-alfa na expressão do Slc2a4 envolve mecanismo de transativação gênica via SP1. Essas observações colocam a cooperação ER-alfa/SP1 como um novo alvo para o desenvolvimento de medidas terapêuticas para resistência à insulina e diabetes mellitus tipo 2 / Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is characterized by insulin resistance, which can be modulated by estrogen in both females and males. In this process, the glucose transporter GLUT4 (solute carrier family 2 member 4 gene - Slc2a4) plays an important role, since increasing GLUT4 expression improves glycemic control. Estradiol (E2) regulates the expression of Slc2a4, by a mechanism in which estrogen receptors (ERs) play opposite effects: ER-alpha stimulates, whereas ER-beta inhibits the expression. Transcriptional effects of ERs involve co-regulators, notably the transcription factor SP1, a powerful enhancer of Slc2a4. However, the role of SP1 in the ERs-mediated regulation of Slc2a4 is unknown; and that was the aim of the present study. Differentiated adipocytes 3T3-L1 were treated (24 hours) with E2, ER-alpha agonist (PPT) or ER-beta agonist (DPN). It was analyzed: gene expression (RT-qPCR) of Slc2a4 and Sp1; total content o GLUT4 and nuclear content of ER-alpha/beta and SP1 (Western blotting); binding activity of SP1 into Slc2a4 promoter (electrophoretic mobility shift assay); and content of nuclear SP1/ER-alpha complexes (immunoprecipitation). Results confirmed that E2 increases the expression of Slc2a4/GLUT4, by the dominant effect of ER-alpha. The ER-alpha agonist PPT increased the nuclear content of SP1, the interaction of SP1/ER-alpha, and the binding activity of SP1 into the Slc2a4. The agonist DPN evinced that ER-beta activity does not involve the SP1. In conclusion, the enhancer effect of ER-alpha upon Slc2a4 gene expression involves a transactivation mechanism via SP1. This observation point outs the cooperation of ER-alpha/SP1 as a new target for the development of approaches to treat insulin resistance and T2DM

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