[EN] This thesis has focused mainly on the synthesis and characterization of biostable macroporous polymers from the family of polyacrylates, for application in regenerative medicine. Scaffolds and membranes developed in this work can have different applications in regenerative medicine that require the transplantation of cells to the organism. In particular, ring of cornea prosthesis, anchorage of bone prosthesis, articular cartilage, and dressing for stem cell transplantation on skin regeneration or treatment of corneal and mouth ulcers. For this purpose, initially poly (ethyl acrylate) (PEA) copolymers films, with different and controlled physicochemical properties were prepared through via radical polymerization. In order to know some of the physical and thermal properties that might affect the proteins adsorption, determining differences between surface properties (topography, chemistry and surface energy) and subsequent cell adhesion, a characterization of the obtained films was performed, by finding the degree of wettability, swelling and the presence of phase separation in the material, by measuring the contact angle (WCA), water absorption and differential scanning calorimetry (DSC), respectively. Subsequently, thin porous membranes with suitable structural and mechanical properties that allow cell colonization and proliferation inside the network and biostables in the human body were developed. To obtain the membranes with well interconnected pores that reach the requirements to be used in prosthetic implants and transplants of cells, a method combining the template technique and the anisotropic pores collapse was designed. Processing method, microstructure and mechanical properties of the synthesized membranes was analyzed, through scanning electron microscopy (SEM), scanning confocal laser microscopy, stress strain experiments in tension and tearing strength measurements, yielding a thin and strong three dimensional porous membrane. Two biological characterizations were performed by seeding bone marrow mesenchymal stem cells on poly (ethyl acrylate) copolymers with different hydrophilicity degrees and different crosslinking densities. Seeding efficiency, cell viability and proliferation was analyzed. Morphology and cell adhesion type at short times culture was observed by fluorescence microscopy, and cell proliferation capacity a long times culture by Confocal fluorescence microscopy. A good initial cell adhesion in the porous thin membranes compare to their respective membranes was observed. For larger time culture the cells were able to adhere and expand over all porous membranes, and in addition they exhibited high proliferation in surface after 21 days of culture. Moreover, corneal prosthesis prototype following a core skirt type model was developed. Starting from an anchorage ring with flexible and porous structure of poly (ethyl acrylate), in which center a rigid and transparent lens of poly (methyl methacrylate) (PMMA) was polymerized, generating the integration of both components on a single piece. Finally, in collaboration with other research groups, the adhered fibronectin (FN) by adsorption or grafting and its biological response on films of poly (ethyl acrylate) copolymers was evaluated. Furthermore, the influence of the properties of polymeric materials in fibronectin adhesion and its conformation by exposure of some cell adhesive motifs that interact with integrins was analyzed. / [ES] Esta tesis se ha centrado principalmente en la síntesis y caracterización de polímeros bioestables macroporosos de la familia de los poliacrilatos, para su aplicación en medicina regenerativa. Los soportes desarrollados en este trabajo pueden tener distintas aplicaciones en terapias que requieren el trasplante al organismo de células. Concretamente en el anillo de la prótesis de córnea, anclaje de prótesis de hueso, cartílago articular y en forma de apósito para el trasplante de células madre para regeneración de piel o el tratamiento de úlceras corneales o bucales. Con este propósito, inicialmente se han preparado diferentes series de copolímeros de poliacrilato de etilo (PEA) en forma de láminas no porosas a través de polimerización por vía radical, con propiedades físico químicas diferentes y controladas. A fin de conocer algunas de las propiedades físicas y térmicas que puedan afectar a la adsorción de las proteínas, determinando diferencias entre las distintas propiedades superficiales (topografía, química y energía superficial) y la consecuente adhesión celular, se realizó una caracterización de las distintas láminas obtenidas, determinando el grado de humectabilidad, de hinchamiento y la presencia de separación de fases en el material, a través de la medida de ángulo de contacto (WCA), absorción de agua y Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC), respectivamente. Posteriormente se han desarrollado membranas finas porosas con propiedades estructurales y mecánicas adecuadas que permitan la colonización y proliferación celular en el interior de la red y su bioestabilidad en el cuerpo humano. Para obtener la membrana de poros bien interconectados que cumpla con los requisitos necesarios para su utilización en implantes protésicos y trasplante de células, se diseñó una variante del método que combina la técnica de las plantillas para producir los macroporos y el colapso de poros anisotrópico para obtener las membranas delgadas. Se analizó el procesamiento, microestructura y propiedades mecánicas de las distintas membranas sintetizadas, a través de la microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopia Confocal laser de Barrido, ensayos de tensión deformación y resistencia al desgarro, teniendo como resultado una malla tridimensional porosa, fina y resistente. Se realizaron dos caracterizaciones biológicas sembrando in vitro células mesenquimales de médula ósea sobre los materiales de copolímeros de poliacrilato de etilo con distinto grado de hidrofilicidad y con diferentes densidades de entrecruzamiento, analizando la eficiencia de la siembra, viabilidad y proliferación celular. Mediante microscopía de fluorescencia se observó la morfología y el tipo de adhesión celular a tiempos cortos de cultivo que presentan los distintos copolímeros, y a través de microscopía Confocal de fluorescencia la capacidad de proliferación celular a tiempos largos de cultivo, observándose inicialmente una buena adhesión celular en las láminas porosas frente a sus respectivas membranas. Para tiempos de cultivo mayores las células fueron capaces de adherirse y expandirse en todas las membranas, además de mostrar una alta proliferación en superficie tras 21 días de cultivo. Por otra parte, se desarrolló un prototipo de prótesis de córnea siguiendo un modelo tipo core skirt, partiendo de un anillo de anclaje de poliacrilato de etilo con estructura porosa y flexible, en cuyo centró se polimeriza la lente de poli metacrilato de metilo (PMMA) rígida y trasparente, generando como resultado la integración de ambos componentes en una única pieza. Finalmente y en colaboración con otros grupos de investigación, por un lado se ha evaluado la adsorción o el injerto de la fibronectina (FN) y la respuesta biológica posterior sobre láminas no porosa de copolímeros de poliacrilato de etilo. / [CA] Aquesta tesi s'ha centrat principalment en la síntesi i caracterització de polímers bioestables macroporosos de la família dels poliacrilats, per a la seua aplicació en medicina regenerativa. Els suports desenvolupats en aquest treball poden tenir diferents aplicacions en teràpies que requereixen el trasplantament a l'organisme de cèl·lules. Concretament en l'anell de la pròtesi de còrnia, ancoratge de pròtesi d'os, cartílag articular i en forma d'apòsit per al trasplantament de cèl·lules mare per a regeneració de pell o el tractament d'úlceres cornials o bucals. Amb aquest propòsit, inicialment s'han preparat diferents sèries de copolímers de poliacrilat d'etil (PEA) en forma de làmines no poroses a través de polimerització per vía radical, amb propietats fisico químiques diferents i controlades. A fi de conèixer algunes de les propietats físiques i tèrmiques que pugen afectar a l'adsorció de les proteïnes, determinant diferències entre les diferents propietats superficials (topografia, química i energia superficial) i la conseqüent adhesió cel·lular, es va realitzar una caracterització de les diferents làmines obtingudes, determinant el grau de humectabilitat, d'inflament i la presència de separació de fases en el material, a través de la mesura d'angle de contacte (WCA), absorció d'aigua i Calorimetria Diferencial d'Escombratge (DSC), respectivament. Posteriorment s'han desenvolupat membranes fines poroses amb propietats estructurals i mecàniques adequades que permeten la colonització i proliferació cel·lular a l'interior de la xarxa i la seua bioestabilitat en el cos humà. Per a obtenir la membrana de porus ben interconnectats que complisca amb els requisits necessaris per a la seua utilització en implants protèsics i trasplantament de cèl·lules, es va dissenyar una variant del mètode que combina la tècnica de les plantilles per a produir els macroporus i el col·lapse de porus anisotròpics per a obtenir les membranes primes. Es va analitzar el processament, microestructura i propietats mecàniques de les diferents membranes sintetitzades, a través de la microscòpia electrònica d'escombratge (SEM), microscòpia Confocal làser d'Escombratge, assajos de tensió deformació i resistència a l'esquinçament, tenint com resultat una malla tridimensional porosa, fina i resistent. Es van realitzar dues caracteritzacions biològiques sembrant in vitro cèl·lules mesenquimals de medul·la òssia sobre els materials de copolímers de poliacrilat d'etil amb diferent grau de hidrofilicitat i amb diferents densitats d'entrecreuament, analitzant l'eficiència de la sembra, viabilitat i proliferació cel·lular. Mitjançant microscòpia de fluorescència es va observar la morfologia i el tipus d'adhesió cel·lular a temps curts de cultiu que presenten els diferents copolímers, i mitjançant microscòpia Confocal de fluorescència la capacitat de proliferació cel·lular a temps llargs de cultiu, observant se inicialment una bona adhesió cel·lular en les làmines poroses enfront de les seues respectives membranes. Per a temps de cultiu majors les cèl·lules van ser capaces d'adherir se i expandir se en totes les membranes, a més de mostrar una alta proliferació en superfície després de 21 dies de cultiu. D'altra banda, es va desenvolupar un prototip de pròtesi de còrnia seguint un model tipus core skirt, partint d'un anell d'ancoratge de poliacrilat d'etil amb estructura porosa i flexible, en el centre de la qual es polimeritza la lent de polimetacrilat de metil (PMMA) rígida i transparent, generant com resultat la integració de tots dos components en una única peça. Finalment i en col·laboració amb altres grups de recerca, d'una banda s'ha avaluat l'adsorció o l'empelt de la fibronectina (FN) i la resposta biològica posterior sobre làmines no porosa de copolímers de poliacrilat d'etil. / Antolinos Turpín, CM. (2015). Mallas macroporosas bioestables con aplicación en implantes protésicos y trasplante de células [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48802

[ES] La lesión medular traumática (LM) se refiere a una condición neurológica en la que un insulto mecánico interrumpe la adecuada comunicación de impulsos nerviosos a través del sistema nervioso central (SNC), resultando en la pérdida de función locomotora por debajo del área lesionada. Lamentablemente, en la actualidad aún no existe cura efectiva para restaurar la funcionalidad después de una LM. La búsqueda de un tratamiento eficiente sigue siendo un gran desafío debido a nuestra aún incompleta comprensión de la multitud de procesos biológicos desencadenados por la lesión. La terapia celular destaca como la aproximación más recurrente para el tratamiento de la LM. En las últimas décadas, se han explorado varias estrategias celulares, siendo una de las más prometedoras el trasplante de células progenitoras neurales (CPN). Muchos estudios preclínicos demostrado el potencial del trasplante de CPN para proporcionar una recuperación motora en modelos animales, sin embargo, las mejoras funcionales en ensayos clinicos humanos son limitadas. Por lo tanto, aún se deben realizar esfuerzos para descubrir la cascada precisa de procesos moleculares a lo largo de la fisiopatología de LM, así como el mecanismo subyacente de los CPN. En ese contexto, el Capítulo 1 del presente trabajo tuvo como objetivo proporcionar una caracterización de los cambios en el perfil transcripcional medular a lo largo de las diferentes etapas temporales de una lesión severa contusiva. Además, hemos descrito el impacto transcripcional del trasplante de CPN en ratas lesionadas. Hemos demostrado que mientras la LM conllevó una fuerte desregulación de varios componentes de señalización de AMPc (entre ellos EPAC2), el trasplante de CPN pudo restaurar estas alteraciones transcripcionales. Para explorar el papel de EPAC2 en el mecanismo terapéutico mediado por CPN, realizamos un experimento de inhibición sostenida de EPAC2 mediante la administración de ESI-05. En comparación con los animales solo trasplantados, los animales CPN +ESI-05 mostraron un aumento en el área de cicatriz, una exacerbación de la polarización de la microglía hacia un perfil inflamatorio y una ampliación de la brecha de neuronas preservadas a lo largo de la lesión, sugiriendo que el trnasplante de CPN en el contexto de LM implican un mecanismo dependiente de EPAC2, reduciendo la neuroinflamación y proporcionando un entorno neuro-permisivo. El Capítulo 2 explora el potencial del AMPc para la regeneración de la LM. Hemos diseñado una estrategia innovadora para inducir AMPc en las neuronas corticoespinales a través de la activación optogenética de un adenilato ciclasa foto-inducible (bPAC). La estimulación optogenética en ratas con una hemisección dorsal torácica promovió una recuperación locomotora en comparación con el grupo control. Además, la estimulación de bPAC aumentó el número de neuronas marcadas retrógradamente desde el segmento lumbar tanto en la corteza motora como en la formación rafe-reticular, pero no en el núcleo rojo.La inmunotinción del tracto rafespinal mostró que la estimulación de bPAC aumenta el ratio de axones serotonérgicos caudales a la lesión correlacionando con una mejora funcional. Por último, la depleción del sistema serotoninérgico mediante la administración de 5,7-Dihydroxytryptamina suprimió la abolió la mejora mediada por bPAC, confirmando la implicación de la vía serotoninérgica en la recuperación de los animales estimulados. En resumen, se han proporcionado nuevos conocimientos sobre los cambios transcripcionales que ocurren a lo largo de la progresión de la LM y tras el trasplante de CPN, con énfasis en la señalización de AMPc. La manipulación optogenética de AMPc en las neuronas corticoespinales después de la LM ha demostrado ser efectiva para la recuperación funcional y permitido descubrir una ruta cortical alternativa a través del tracto descendente serotoninérgico / [CA] Lesió medul·lar traumàtica (LM) es una condició neurològica en la qual un traumatisme interromp la comunicació adequada dels impulsos a través del sistema nerviós central (SNC), amb el resultat de la pèrdua de la funció locomotora per baix de la zona lesionada. Lamentablement, en l'actualitat encara no hi ha una cura efectiva per a restaurar completament la funcionalitat de la medul·la espinal després de la lesió. La recerca d'un tractament eficient per a la LM roman un repte complex a causa de la nostra comprensió encara incompleta de la gran quantitat de processos biològics desencadenats per la lesió primària. La teràpia cel·lular destaca com l'aproximació més recurrent per al tractament de la LM. En les dècades passades, s'ha explorat diverses estratègies basades en cèl·lules i una de les més prometedores és el trasplantament de cèl·lules progenitores neurals (CPN). Molts estudis preclínics han demostrat el potencial del trasplantament de CPN per proporcionar una recuperació motora en models animals, no obstant això, les millores funcionals en pacients humans tractats són limitades. Per tant, encara s'han de fer esforços per a descobrir la cascada precisa de processos moleculars al llarg de la fisiopatologia de la LM, així com el mecanisme subjacent dels CPN. El Capítol 1 del present treball va tindre com a objectiu proporcionar una caracterització dels canvis en el perfil transcripcional espinal al la llarga de les diferents etapes temporals de una lesió contusiva. A més, s'ha descrit l'impacte transcripcional del trasplantament d'CPN en animals lesionats. S'ha demostrat que mentre la LM va causar una forta desregulació de diversos components de senyalització de AMPc (sent EPAC2 el gen més regulat a la baixa), el transplantament de CPN van ser capaç de restaurar les alteracions derivades de la LM. Per a explorar el paper d'EPAC2 en el mecanisme terapèutic mediat per CPN, es va realitzar un experiment de inhibició sostinguda d'EPAC2 degut a l'administració d'ESI en animals lesionats. En comparació amb els animals només trasplantats, els animals CPN+ESI-05 van mostrar un augment de l'àrea de cicatriu, una exacerbació de la polarització de les micròglies cap a un perfil inflamatori i una ampliació de la bretxa de neurones preservades a través de la lesió.Aquests resultats suggereixen que el trasplantament de CPN en el context de la LM involucren un mecanisme depenent d'EPAC2, reduint la neuroinflamació i proporcionant un entorn més neuropermissiu. El Capítol 2 va tindre com objectiu explotar el potencial de regeneració de AMPc dissenyant una nova estratègia per a les induccions artificials de AMPc en les neurones corticoespinals mitjançant l'activació optogenètica d'una adenilat ciclasa fotoinduïble (bPAC). L'estimulació diària de AMPc en rates que pateixen una hemisècció dorsal toràcica va promoure una recuperació en comparació amb els control. L'estimulació de bPAC va augmentar el nombre de neurones marcades retrògradament des del segment lumbar, tant a l'escorça motora com a la formació rafe-reticular, però no al nucli roig. A més, la immunotinció del tracte rafespinal va mostrar que l'estimulació de bPAC va augmentar la ràtio d'axons serotoninèrgic cabals a la lesió, cosa que es va correlacionar significativament amb una millora dels paràmetres funcionals. Finalment, la depleció del sistema serotoninèrgic mitjançant l'administració de 5,7-Dihydroxytryptamina va abolir la millora mediada per bPAC, confirmant la implicació de la via serotoninèrgica en la recuperació. En resum, la investigació ha proporcionat coneixements sobre els canvis transcripcionals que tenen lloc a la llarga de la progressió de la LM i després del trasplantament de CPN, amb un èmfasi especial en la senyalització d'AMPc. La manipulació optogenètica d'AMPc a les neurones corticoespinals després de la LM ha demostrat ser efectiva per a la recuperació funcional i ha permès descobrir una ruta cortical alternativa a través del tracte descendent serotoninèrg / [EN] Traumatic spinal cord injury (SCI) refers to a neurological condition in which a mechanic insult disrupts the proper communication of the impulses through the central nervous system (CNS), resulting on the loss of locomotor function below the injured area. Unfortunately, nowadays there is still no effective cure to completely restore the functionality of the spinal cord after the injury. Cell therapy is the most recurring approach for SCI treatment. In the past decades several cell-based strategies have been explored, being one of the most promising the transplantation of neural progenitor cells (NPCs). Many pre-clinical studies evidenced the potential of the NPCs transplantation to provide a substantial motor recovery in animal models, yet functional improvements in clinical trials have been limited. Therefore, efforts still need to be made in disclosing the precise cascade of molecular processes along SCI pathophysiology as well as the NPCs underlying mechanism. In that context, Chapter 1 of the present work aimed to provide a comprehensive characterization of the spinal transcriptional changes along the different temporal stages of rats suffering a severe contusive injury. Additionally, we have described the transcriptional impact of acute and subacute NPCs transplantation in injured animals. Interestingly we have shown that while SCI caused a strong dysregulation of several cAMP-signaling components (being EPAC2 the most downregulated gene), NPCs was able to restore SCI-derived alterations over this pathway with EPAC2 significant upregulation. In order to further explore EPAC2 role in NPCs-mediated therapeutical mechanism we performed a loss-of-function experiment by sustained EPAC2 inhibition via ESI-05 administration along with NPCs transplantation after SCI. Compared with only transplanted animals, NPCs+ESI-05 animals showed increased scar area, exacerbated microglia polarization into an inflammatory profile and widened gaps of preserved neurons across the lesion. Overall, these results suggest that NPC therapeutic mechanisms in the context of SCI involve an EPAC2-dependent mechanism, reducing neuroinflammation and providing a neuro-permissive environment. Chapter 2 aimed to further explore cAMP potential for SCI regeneration. We designed a novel strategy for artificial cAMP inductions in corticospinal neurons via optogenetic activation of a photoinducible adenylyl cyclase (bPAC). Daily optogenetic cAMP stimulation in rats suffering a thoracic dorsal hemisection, which completely disrupt the dorsal aspect of the corticospinal tract (CST), promoted and early and sustained locomotor recovery compared to non-treated control animals. We have shown that bPAC stimulation increased the number of retrograde traced neurons from the lumbar segment both in the motor cortex and the raphe-reticular formation, but not in the red nuclei. Moreover, immunolabelling of the raphespinal tract by 5-HT showed that bPAC stimulation increased the ratio of descending serotoninergic axons caudal to the injury which significantly correlated with improved functional parameters. Our results from corticobulbar projection study, WGA trans-synaptic tracing, and P-CREB analysis suggest that bPAC modulation of cortico-serotonergic pathway might occurs at the brainstem level. Lastly, the serotonergic system depletion by 5,7-Dihydroxytryptamine administration suppressed bPAC-mediated recovery, confirming the implication of the serotonergic tract in the recovery of stimulated animals. In summary, our research has provided new insights into the transcriptional changes that occur along SCI progression and after NPCs transplantation with a special emphasis on cAMP signaling. Optogenetic cAMP manipulation in corticospinal neurons after SCI has proven to be effective for functional recovery and allowed to unveil a cortical rerouting pathway through the serotonergic descending tract. / This research was funded by FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-BC21/ERDF]. Part of the equipment employed in this work was funded by Generalitat Valenciana and cofinanced with ERDF funds (OP ERDF of Comunitat Valenciana 2014– 2020) and the UE; Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) incluido en el Programa Operativo FEDER de la Comunidad Valenciana 2014-2020. B. MartinezRojas was supported by a grant from the Conselleria de Educación, Investigación, Cultura y Deporte de la Generalitat Valenciana and the European Social Fundation ACIF/2019/120. / Martínez Rojas, B. (2024). Transcriptional Insights for Spinal Cord Injury and Neural Precursor Cell Therapy: Toward a Novel Optogenetics-Based Treatment for cAMP Neuronal Induction [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202972