Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Gomes Neide (neide@bce.unb.br) on 2014-07-03T16:05:56Z No. of bitstreams: 1 2012_BrunoBenolielRocha.pdf: 6758229 bytes, checksum: 54ff8a4fee8a06cc51e9b37706664923 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-07-07T11:26:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_BrunoBenolielRocha.pdf: 6758229 bytes, checksum: 54ff8a4fee8a06cc51e9b37706664923 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-07T11:26:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_BrunoBenolielRocha.pdf: 6758229 bytes, checksum: 54ff8a4fee8a06cc51e9b37706664923 (MD5) / O Brasil é um grande produtor de resíduos agroindustriais, como o bagaço de cana. Esse substrato poderia ser usado como matéria-prima para produção microbiana de celulases com a finalidade de desenvolver processos sustentáveis como a produção de etanol de segunda geração. Para isso, este trabalho teve como objetivo a triagem de cepas fúngicas isoladas do Cerrado brasileiro com atividades celulolíticas. Entre os 13 isolados analisados o Trichoderma harzianum (L04) foi identificado como um promissor candidato para a produção de celulase quando cultivado em bagaço de cana in natura. A linhagem L04 revelou um complexo celulolítico bem equilibrado, apresentando uma rápida cinética de produção de endoglucanases, exoglucanases e β-glucosidases, obtendo valores máximos de atividades de 4022 UL - 1 (72 h), 1228 UL - 1 (120 h) e 1968 UL - 1 (48 h), respectivamente. Cerca de 60 % de rendimento de glicose foram obtidos a partir do bagaço de cana após 18 horas de hidrólise. Esta nova linhagem representa um candidato em potencial para a produção de celulases utilizando bagaço de cana como fonte de carbono. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brazil is a major producer of agro-industrial residues, such as sugarcane bagasse, which could be used as raw material for microbial production of cellulases as an important strategy for the development of sustainable processes of second generation ethanol production. For this purpose, this work aimed at screening for glycosyl hydrolase activities of fungal strains isolated from the Brazilian Cerrado. Among 13 isolates, a Trichoderma harzianum strain (L04) was identified as a promising candidate for cellulase production when cultured on in natura sugarcane bagasse. Strain L04 revealed a well-balanced cellulolytic complex, presenting fast kinetic production of endoglucanases, exoglucanases and β-glucosidases, achieving 4,022, U.L-1 (72 h), 1,228 U.L-1 (120 h) and 1,968 U.L-1 (48 h) as the highest activities, respectively. About 60% glucose yields were obtained from sugarcane bagasse after 18 hours hydrolysis. This new strain represents a potential candidate for on-site enzyme production using sugarcane bagasse as carbon source.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2014. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2014-10-16T19:08:21Z No. of bitstreams: 1 2014_FrancileneLopesdaSilva.pdf: 2838227 bytes, checksum: 2ba894041194431b0f5e7d4cf0cf231e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-10-16T19:09:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_FrancileneLopesdaSilva.pdf: 2838227 bytes, checksum: 2ba894041194431b0f5e7d4cf0cf231e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-16T19:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_FrancileneLopesdaSilva.pdf: 2838227 bytes, checksum: 2ba894041194431b0f5e7d4cf0cf231e (MD5) / Algumas espécies de Trichoderma quando em íntima associação com plantas hospedeiras podem desencadear sua resposta de defesa e, desta forma, induzir resistência contra subsequentes infecções fúngicas. No presente trabalho foi analisado a expressão dos genes codificadores de proteínas de defesa (Glu, Chit 1, LOX, PER e PAL) em feijoeiro comum, Phaseolus vulgaris, em resposta à asssociação com os isolados das espécies T. asperellum (468/02) e T. harzianum (475/2 e 303/2), após 24, 48 e 72 horas de interação; Além disso, foi analisado o secretoma da interação entre o feijoeiro comum e o isolado 303/02 visando mapear proteínas com papel na interação entre T. harzianum e feijoeiro comum em um sistema hidropônico. A presença do T. asperellum 468/02 e T. harzianum 457/02 aumentaram a expressão dos genes de defesa do feijoeiro Chit, Glu e PAL durante as primeiras 24h de interação. Um aumento mais tardio, com 72 h, foi observado na expressão desses mesmos genes de defesa em feijoeiro na presença T.harzianum 303/02. O gene PER teve sua expressão aumentada com 48 h de interação para os três isolados. O aumento na expressão do gene LOX foi baixa para os isolados 468/02 e 457/02 e não foi observado aumento para o isolado 303/02. A análise por LC-MS/MS do secretoma de T. harzianum 303/02 crescido na ausência da planta hospedeira permitiu a identificação de 185 proteínas, identificadas principalmente com enzimas hidróliticas (27 %), como as α ou β-1,3-, 1,4 e 1,6 glicanase, quitinases, e algumas poteases (16,5 %) como as serina e aspartato proteases. Uma cerato-platanina e uma alginato liase também foram identificadas nesta condição. A análise do secretoma da condição Co-cultivo (Feijoeiro comum/ T. harzianum) permitiu a identificação de 165 proteínas, sendo também a maioria formada por glicosil hidrolases (quitinase and glicanases). Estas mesmas sequências foram pareadas com o banco de dados de Phaseolus vulgaris, resultando na identificação de 7 proteínas de plantas: 2 glicosil hidrolases (famílias 17 e 18) proteínas relacionadas a patogênese e inibitores de proteases. Em ambas as condições foram encontradas muitas proteínas sem anotação no banco de dados. Não foram identificadas proteínas no secretoma da planta crescida sozinha. Os resultados obtidos sugerem que os isolados T. harzianum 457 e 303/02 e T. asperellum 468/02 agem como moduladores de resposta de defesa da planta. Provavelmente, eles desencadeiam a expressão de genes de defesa ou genes que codificam enzimas que participam da produção de compostos secundários envolvidas na resposta de defesa da planta. Estudos futuros serão realizados para confirmar a capacidade desses fungos de modular a resposta de defesa do feijoeiro comum bem como para mapear proteínas fúngicas envolvidas nesta interação. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Trichoderma species may trigger their defense responses and induce resistance against subsequent fungal infections. In the present work, the expression pattern of genes encoding defense proteins (Chit, Glu, LOX, PER and PAL) in common bean, Phaseolus vulgaris, was evaluated in response to association with T. asperellum (strain 468/02) and T. harzianum (strains 457/02 and 303/02) after 24, 48 and 72 hours of interaction. In addition, the secretome of this interaction was analyzed to mapp proteins playing a role in the association between T. harzianum and bean in a hydroponic system. The presence of T. asperellum 468/02 and T. harzianum 457/02 increased the expression of defense genes Chit, Glu and PAL in common bean during the first 24 hours of interaction. By contrast, a late increase, with 72 h, in the expression of these same defense genes in common bean was observed in the presence of T. harzianum 303/02. PER gene expression was increased with 48 h of interaction for all isolates. The increase in LOX gene expression was low for 468/02 and 457/02 strains and no increased was observed for 303/02 strain. LC-MS/MS analysis of the secretome T. harzianum 303/02 grown in the absence of the host plant led to the detection of 185 proteins, mostly identified as hydrolytic enzymes (27%), such as α or β-1,3-, 1,4 and 1,6 glucanases, chitinases, and some proteases (16.5%), such as serine and aspartate proteases. A cerato-platanin and an alginate lyase were also identified on this condition. Secretome analysis of the co-culture condition (common bean/T. harzianum 303/02 isolate) led to the detection of 165 proteins, mostly identified as glycosyl hydrolases (chitinases and glucanases). These sequences were mapped to P. vulgaris database, resulting in the identification of 7 plant proteins, 2 glycoside hydrolases (family 17 and 18), pathogenesis-related proteins and protease inhibitors. No proteins were identified when the plants were grown in the absence of T. harzianum 303/02. The results obtained suggested that T. asperellum 468/02 and T. harzianum (457/02 and 303/02) act as inducers of defense common bean. Probably, they triggered the expression of defense genes or genes encoding enzymes pertaining to secondary compounds pathways with roles in plant defense. T. harzianum 303/02 secreted mainly hydrolases (glycosyl hydrolases and proteases) in the absence or presence of the host plant. Further studies will be carried out to confirm their ability to modulate common bean defense response as well as to map fungal proteins presenting role in this association.