Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-28Bitstream added on 2014-06-13T20:31:23Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_tb_me_botfm.pdf: 1860474 bytes, checksum: ed09ce9cf8d1807484fc0313de2945e1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de identificar e caracterizar os produtos de excreção/ secreção (PE/S) de trofozoítos de Giardia duodenalis de uma cepa axênica isolada no Brasil (BTU-11), tendo por referência a cepa padrão Portland 1 (P-1) isolada nos Estados Unidos. Os PE/S foram obtidos a partir dos sobrenadantes de cultura de trofozoítos mantidos em meio RPMI por 6 horas a 37oC. Os PE/S de cada cepa foram analisados quanto ao perfil eletroforético em géis de poliacrilamida (SDSPAGE) e a atividade proteolítica foi avaliada em géis contendo gelatina e colágeno tipo I a 0,2% e em ensaios empregando hemoglobina a 0,1%. A caracterização das proteases dos PE/S foi realizada em ensaios para avaliar o efeito de inibidores sintéticos de cisteína, serina, metalo e aspartil proteases sobre a degradação de cada substrato testado. A análise dos perfis protéicos revelou padrões simples, porém distintos quanto ao número de bandas de proteínas, visualizando nos PE/S das cepas P-1 e BTU-11, respectivamente, seis e quatro bandas com massas moleculares distribuídas na faixa de 123 a 28 kDa. Quanto à atividade proteolítica, todos os substratos foram degradados por enzimas presentes nos PE/S. A atividade gelatinolítica foi observada na faixa de 77 a 18 kDa, destacando-se seis bandas evidentes de aproximadamente 77, 66, 54, 52, 21 e 18 kDa. A degradação do colágeno foi detectada na faixa de 145 a 18 kDa, sendo que as zonas de proteólise de maior evidência foram observada nas faixas de 145 a 82 kDa e de 56 a 34 kDa, onde destacam-se as bandas de 145, 96, 82 e 34 kDa. A análise dos padrões de hidrólise da hemoglobina demonstrou similaridade entre as cepas e revelou degradação total da cadeia dimérica e lise parcial da cadeia monomérica. A atividade gelatinolítica e... / The present investigation was undertaken to examine the protease activity in excretory/secretory (E/S) products of Giardia duodenalis trophozoites of an axenic Brazilian strain (BTU-11) and the reference strain Portland 1 (P1). E/S products in conditioned medium by trophozoites of each strain were tested in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis for the protein profiles, and the proteases activity was analyzed using substrate gelatin and collagen impregnated SDS-PAGE and haemoglobin assay. The proteases characterization was based on inhibition assays including synthetic inhibitors for cysteine, serine, metallo and aspartic proteases. Electrophoresis analysis of E/S products revealed a banding pattern composed by few bands (4-6 bands) in the migration region of 123 to 28 kDa. Proteolytic products were detected in the conditioned medium by trophozoites of both assayed strains. In the gels containing copolymerized gelatin and collagen, E/S products promoted degradation of both substrates and the most evident proteolysis zones were distributed in the migration regions of 77 to 18 kDa and 145 to 18 kDa, respectively, in the patterns of gelatinolytic and collagenolytic activities. Degradation of haemoglobin was also observed, and the pattern of hydrolysis was similar in both E/S products assayed. Inhibiton assays showed that the main proteolytic activity in E/S products is due to cysteine proteases although the presence of serine proteases was also indicated, mainly in the hydrolysis of haemoglobin. These observations are relevants, especially ...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:18:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andres_quesne_ioc_mest_2014.pdf: 2284982 bytes, checksum: 60f23c8536661b9357f727cee49ed7ee (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Giardia intestinalis (G. intestinalis) é o parasita gastrointestinal mais comum que coloniza o trato intestinal humano onde permanece extracelular e aderido às células intestinais. O parasita tem uma distribuição mundial, causando um número estimado de 2.8x108 casos por ano e recentemente a doença foi incluída como parte da Iniciativa das Doenças Negligenciadas da Organização Mundial de Saúde. As manifestações clínicas da giardíase são variáveis, e vão desde a ausência de sintomas até diarreias agudas ou crônicas. Adicionalmente, estudos recentes indicam que distúrbios gastrintestinais funcionais, tais como a síndrome do intestino irritável, e o déficit de crescimento em crianças podem ser associados com a infecção por G. intestinalis. Apesar da alta prevalência e das consequências desta doença, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes na giardíase ainda permanecem incompreendidos. Os trofozoítos causam a doença sem penetrar no epitélio intestinal, nem entrar na corrente sanguínea e sem secretar nenhuma toxina conhecida. Nos últimos anos, tem sido descrito que as vesículas extracelulares podem participar na interação parasita-célula hospedeira. As vesículas extracelulares podem ser: microvesículas (MVs) e derivadas da membrana plasmática; exosomos, pequenas vesículas originadas a partir de membranas de endossomos; e corpos apoptóticos contendo material do núcleo celular. As MVs têm sido mostradas como importantes fatores na interação parasita-célula hospedeira No presente trabalho, foi utilizada uma combinação de metodologias, incluindo citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, proliferação celular, análises de proteoma e ensaios de aderência celular para investigar o papel das microvesículas liberadas por trofozoítos de G. intestinalis nas propriedades patogênicas deste parasita. Demonstramos que G. intestinalis produz e secreta microvesículas com exposição superficial de fosfatidilserina. Além disso, o processo de liberação de MVs é dependente do tempo e da concentração de cálcio, envolve microdomínios de membrana e as microvesículas contêm RNA de baixo peso molecular. Observamos também que os microdomínios de membrana estão envolvidos na adesão do parasita à células Caco-2. Nossa análise proteômica preliminar sugere presença de componentes do citoesqueleto, alfa giardinas, enzimas metabólicas e proteínas variáveis de xi superfície (VSP) nas MVs isoladas de G. intestinalis. Foi demonstrado também que as MVs de G. intestinalis interagem com as células do hospedeiro aumentando a proliferação destas e incrementado também o número de trofozóitos aderidas à estas células. O presente estudo é o primeiro a sugerir um papel potencial para as microvesículas de G. intestinalis na colonização do hospedeiro. Uma melhor compreensão do papel das MVs liberadas pelo parasita na interação com a célula hospedeira poderá fornecer novas perspectivas sobre patogênese e possivelmente novas ferramentas para o diagnóstico e a terapia da doença / Giardia intestinalis ( G. intestinalis ) is the most common gastrointestinal parasite that colonizes the human intestinal tract where it remains extracellular and adheres to intestinal cells . The parasite has a global distribution causing an estimated 2.8x10 8 cases per year and the illness was recently included in the World Health Organization Neglected Disease Initiative . Clinical manifestations of giardiasis are quite variable, and range from the absence of symptoms to acute or chronic diarrhea. Aditionally, r ecent studies indicate that functional gastrointestinal disorders , such as irritable bowel syndrome , and failure of children to thrive can be associated with G. intestinalis infection . Even though the high prevalence and consequences of this disease , pathophysiological mechanisms underlying symptomatic giardiasis remain incompletely understood . Trophozoites cause disease without penetrating the intestinal epithelium , entering the bloodstream or secreting toxin s . In recent years it has been described that extracellular ves icles could participate in parasite - host cell interaction. The extracellular vesicles ma y be: microvesicles (MVs) and derived f rom the plasma membrane; exosome s, small vesicles originated from endosomal limiting membrane ; and apoptotic bodies containing nuclear material. MVs have been shown to be important factors in the parasite - host cell in teraction. Here, we used a combination of methodologies including flow cytometry, fl u orescence microscopy, cell proliferation, proteomics analysis and cell adherence assays to investigate the role of released microvesicles from G. intestinalis trophozoites on the pathogenic properties of this parasite . We have found that G. intestinalis produces and secretes microvesicles with superficial exposition of phosphatidilserine. Additionally , the shedding process was calcium and time - dependent , involve s membrane microdomains and the microvesicles contain low - molecular weight RNA . We also observed that membrane microdomains are involved in parasite attachment to Caco - 2 cells. Our preliminary proteomic analysi s suggested the presence of cytoskeleton components, alpha giardins, metabolic enzymes and variant - specific surface protein ( VSP ) in the isolated MVs from G. intestinalis. We demonstrate that G. intestinalis microvesicles interact with host cells xiii increasing their prolifer ation and augment ing the number of trophozoites adhered t o these cells . The present study is the first to suggest a potential role for G. intestinalis microvesicles in host cell colonization. A better understanding of the role of the released microvesicles by the parasite on the host - cell interaction will provide insights into pathogenesis and possibly new tools for diagnosis and therapy