Universiẗat, Diss., 2007--Giessen.

Platelet activation and aggregation are essential processes for the sealing of injured vessel walls and preventing blood loss. Under pathological conditions, however, platelet aggregation can lead to uncontrolled thrombus formation, resulting in irreversible vessel occlusion. Therefore, precise regulation of platelet activation is required to ensure efficient platelet plug formation and wound sealing but also to prevent uncontrolled thrombus formation. Rapid elevations in the intracellular levels of cations are a core signaling event during platelet activation. In this thesis, the roles of Ca2+ and Mg2+ channels in the regulation of platelet function were investigated. Orai1, the major store-operated calcium (SOC) channel in platelets, is not only vital for diverse signaling pathways, but may also regulate receptor-operated calcium entry (ROCE). The coupling between the Orai1 signalosome and canonical transient receptor potential channel (TRPC) isoforms has been suggested as an essential step in the activation of store-operated calcium entry (SOCE) and ROCE in human platelets. However, the functional significance of the biochemical interaction between Orai and TRPC isoforms still remains to be answered. In the first part of this thesis, the functional crosstalk between Orai1 and TRPC6 was addressed. Orai1-mediated SOCE was found to enhance the activity of phospholipases (PL) C and D, to increase diacylglycerol (DAG) production and finally to regulate TRPC6-mediated ROCE via DAG, indicating that the regulation of TRPC6 channel activity seems to be independent of the physical interaction with Orai1. Furthermore, Orai1 and TRPC6 double deficiency led to a reduced Ca2+ store content and basal cytoplasmic Ca2+ concentrations, but surprisingly also enhanced ATP secretion, which may enhance Ca2+ influx via P2X1 and compensate for the severe Ca2+ deficits seen in double mutant platelets. In addition, Orai1 and TRPC6 were not essential for G protein-coupled receptor (GPCR)-mediated platelet activation, aggregation and thrombus formation. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) contains a cytosolic serine/threonine protein kinase. To date, a few in vitro substrates of the TRPM7 kinase have been identified, however, the physiological role of the kinase remains unknown. In the second part of this thesis, mice with a point mutation which blocks the catalytic activity of the TRPM7 kinase (Trpm7KI) were used to study the role of the TRPM7 kinase in platelet function. In Trpm7KI platelets phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) metabolism and Ca2+ mobilization were severely impaired upon glycoprotein (GP) VI activation, indicating that the TRPM7 kinase regulates PLC function. This signaling defect in Trpm7KI platelets resulted in impaired aggregate formation under flow and protected animals from arterial thrombosis and ischemic brain infarction. Altogether, these results highlight the kinase domain of TRPM7 as a pivotal signaling moiety implicated in the pathogenesis of thrombosis and cerebrovascular events. / Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sind zwei elementare Prozesse für das Abdichten verletzter Gefäßwände und damit zur Verhinderung von exzessivem Blutverlust. Unter pathologischen Bedingungen kann die Thrombozytenaggregation jedoch zur unkontrollierten Thrombusbildung und folglich zum irreversiblen Gefäßverschluss führen. Daher ist eine präzise Regulation der Thrombozytenaktivierung wichtig, um effizient Gefäßverletzungen zu schließen aber gleichzeitig eine unkontrollierte Thrombusbildung zu verhindern. Schnelle Veränderungen der zytoplasmatischen Konztentration von Kationen stellen ein Kernelement der Signaltransduktion während der Plättchenaktivierung dar. In dieser Arbeit wurden die Rolle von Ca2+ und Mg2+ Kanälen in der Regulation der Thrombozytenfunktion untersucht. Orai1, der bedeutendste store-operated calcium (SOC) Kanal in Thrombozyten, ist nicht nur entscheidend für verschiedene Signalwege, sondern reguliert möglicherweise auch receptor-operated calcium entry (ROCE). Die Kopplung zwischen dem Orai1-Signalkomplex und canonical transient receptor potential channel (TRPC) Isoformen wurde als entscheidender Schritt in der Aktivierung in der Aktivierung von store-operated calcium entry (SOCE) und ROCE in humanen Thrombozyten vermutet. Die Frage nach der funktionellen Relevanz der Interaktion zwischen Orai und TRPC Isoformen blieb jedoch unbeantwortet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der funktionelle Crosstalk zwischen Orai1 und TRPC6 adressiert. Hierbei zeigte sich, das Orai1-vermittelter SOCE die Aktivität der Phosholipasen (PL) C und D steigert, die Diacylglycerol (DAG) Produktion verstärkt und schließlich TRPC6-vermittelten ROCE via DAG reguliert, was darauf hindeutet, dass die Regulation der TRPC6 Kanalaktivität unabhängig von einer direkten Interaktion mit Orai1 zu sein scheint. Darüber hinaus führte die Doppeldefizienz von Orai1 und TRPC6 zu verringerten Ca2+ Konzentrationen in intrazellulären Ca2+-Speichern und im Zytoplasma der Thrombozyten. Überraschenderweise war auch die ATP-Sekretion erhöht, was eventuell den Ca2+-Einstrom durch P2X1 verstärkt und möglicherweise das starke Ca2+-Defizit in den doppeldefizienten Thrombozyten kompensiert. Außerdem wurde gezeigt, dass Orai1 und TRPC6 nicht für die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sowie für die Thrombusbildung mittlels G protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) benötigt werden. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) enthält eine zytosolische Serin/Threonin-Kinase Domain. Bislang wurden zwar wenige in vitro Substrate der TRPM7 Kinase identifiziert, jedoch ist die physiologische Rolle dieser Kinase immer noch unbekannt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer Punktmutation, welche die katalytische Aktivität der TRPM7 Kinase blockiert (Trpm7KI) eingesetzt um die Rolle der TRPM7 Kinase für die Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In Trpm7KI Thrombozyten war der Metabolismus von phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) und die Ca2+-Mobilisierung nach Aktivierung des Rezeptors Glykoprotein (GP) VI schwer beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass die Aktivität der TRPM7 Kinase die Funktion der PLC reguliert. Aus diesem Signaltransduktionsdefekt in Trpm7KI Thrombozyten resultierte eine verringerte Aggregatbildung unter Flussbedingungen und ein Schutz der Tiere vor arteriellen Thrombosen und ischämischem Schlaganfall. Zusammenfassend heben diese Ergebnisse die Kinasedomäne von TRPM7 als einen ausschlaggebenden Bestandteil in Signalkaskaden hervor und implizieren eine Rolle dieser Domäne in der Pathogenese von ischämischen Kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen.

Le Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire est impliqué dans un grand nombre de processus biologiques chez toutes les cellules de l’organisme. Chez les cellules non-excitables, les protéines TRPC, pour transient receptor potentiel canonical, situées à la membrane plasmique, sont des canaux calciques impliqués dans l’entrée de calcium. TRPC6 est particulièrement étudiée vu son implication potentielle dans plusieurs problèmes pathologiques. La glomérulosclérose focale et segmentale (FSGS) qui est une maladie dérégulant le système de filtration du rein, l’hypertension artérielle pulmonaire idiopathique (IPAH), caractérisé par une élévation anormale et sporadique de la pression sanguine au niveau des artères pulmonaires, ainsi que dans certains cancers. Ses modes et mécanismes d’activation ainsi que sa régulation sont encore aujourd’hui très peu connus, malgré les nombreuses recherches menées. Le but de la présente étude est d'investiguer la régulation de TRPC6 via son ubiquitination. L’ubiquitination des protéines, processus étudié depuis longtemps, a été démontré pour moduler l’activité de plusieurs protéines et réguler leur localisation cellulaire et membranaire. Nos travaux démontrent, que l’état d'ubiquitination de TRPC6 est modulé et favorisé par une stimulation avec des agonistes du canal TRPC6 , tel que le CCh et la Tg. L’utilisation d’inhibiteurs des différentes voies de dégradation utilisant l’ubiquitine comme moyen de régulation, nous permet de démontrer que l’ubiquitination de TRPC6 se fait suivant son internalisation. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’implication de Rabex-5, un facteur d’échange de nucléotide guanylique (GEF) de Rab5 qui se lie aux protéines membranaire ubiquitinylées. Nous démontrons une interaction entre TRPC6 et Rabex-5. Cette interaction n’a aucune influence sur l’activité de TRPC6. De plus, nous démontrons que l’activité GEF de Rabex-5 n’est pas nécessaire à cette interaction et n’influence pas l’activité du canal TRPC6 . Cette étude a permis de déterminer que TRPC6 est un canal ubiquitinylé, que cette ubiquitination se fait suivant son internalisation et est modulée par certains agonistes, tel que le CCh et la Tg. Sans que cette dernière ne soit impliquée dans l’activité fonctionnelle du canal, nous démontrons également une interaction entre TRPC6 et Rabex-5, une protéine localisée au niveau des endosomes précoces. Cette étude est un premier pas vers la compréhension de la régulation via l’ubiquitination, pour le canal TRPC6.

Les canaux TRPC6 sont des canaux cationiques non sélectifs perméables au calcium et au sodium. In vitro, ils laissent passer du manganèse, du baryum ou du fer. Ces canaux peuvent être activés par des analogues du diacylglycérol (SAG ou OAG) et par l'hyperforine (un antidépresseur d'origine végétal). Des expériences de dosages par ICP-OES, d'imagerie synchrotron et d'imagerie de fluorescence du FluoZin-3 ont montré que les cellules HEK surexprimant TRPC6 sont enrichies en zinc. Ces cellules sont plus sensibles à un stress oxydant et produisent plus d'espèces réactives de l'oxygène que les cellules HEK non transfectées. Dans les cellules HEK exprimant TRPC6, l'entrée de zinc en réponse au SAG est plus importante que celle observée dans les cellules HEK ou HEK-TRPC3. Les canaux TRPC6 sont exprimés dans les neurones corticaux. En réalisant des expériences d'imagerie de fluorescence et d'électrophysiologie, nous avons observé que l'activation de ces canaux par le SAG ou par l'hyperforine permettait l'entrée de zinc dans les neurones. La taille du pool de zinc fixé sur des protéines à groupement thiols est augmentée après un influx de zinc via TRPC6. Ceux-ci forment donc une voie d'entrée pour ce métal dans les neurones corticaux embryonnaires. Dans certains types cellulaires, les canaux TRPC6 participent à l'entrée calcique déclenchée en réponse à la déplétion du stock calcique du réticulum (canaux SOC). Cependant, dans les neurones corticaux, les voies SOC et activées par l'hyperforine possèdent des propriétés pharmacologiques distinctes suggérant que les canaux TRPC6 ne participent pas à la voie SOC. L'homéostasie des métaux dans les neurones est perturbée par l'hyperforine. Cet antidépresseur diminue la taille des pools de calcium et de zinc des mitochondries à la fois lors de traitements aigus et chroniques. Une relocalisation du zinc est observée dans les neurones traités de façon chronique à l'hyperforine ainsi qu'une augmentation de l'expression des métallothionéines à la fois in vitro et in vivo. Chez la souris, la quantité de soufre du cerveau est augmentée lors un traitement à l'hyperforine. Celle-ci serait donc un antidépresseur qui module les capacités de stockage du zinc en augmentant le nombre de groupements thiols cellulaires. L'hyperforine est présente dans les extraits de millepertuis. Ceux-ci ont diverses cibles pharmacologiques, agissant notamment sur la voie de signalisation du BDNF. Nos expériences montrent que, lors d'un traitement chronique de souris adultes, l'hyperforine augmente l'expression de TrkB et P-TrkB dans le cortex. In vitro, dans les neurones corticaux, TrkB, CREB et P-CREB sont surexprimés après un traitement de trois jours à l'hyperforine. L'inhibition de la PKA ou le blocage des canaux TRPC6 par le SKF-96365 empêche l'effet de l'hyperforine. Par ailleurs, la chélation du calcium par le BAPTA-AM supprime partiellement l'effet de l'hyperforine. Un traitement chronique avec cet extrait végétal semble agir sur une voie dépendante de la PKA et du calcium pour réguler la phosphorylation de CREB et l'expression de TrkB. Nos expériences montrent que l'effet de l'hyperforine sur les acteurs de la voie du BDNF n'est pas présent au niveau de l'hippocampe où l'expression de TrkB n'est pas affectée. De plus, ces traitements n'influencent pas la neurogenèse adulte chez la souris. L'hyperforine seule n'explique donc pas les effets complexes des extraits de millepertuis sur les activités neuronales. / TRPC6 channels are non selective plasma membrane cation channels permeable to calcium and sodium. In addition, in vitro data showed that they can transport manganese, barium or iron. These channels can be activated by diacylglycerol (DAG) or DAG analogues like SAG or OAG. They are also sensitive to hyperforin (a plant extract exhibiting antidepressant properties). ICP-OES experiments, X-ray synchrotron imaging and live-cell FluoZin-3 imaging show that the over expression of TRPC6 in HEK cells increases their zinc and sulfur content. This enrichment is associated with an increased sensitivity of transfected cells to oxidative stress by enhancing the production of reactive oxygen species in response to oxidative insults. The entry of zinc permitted by SAG or hyperforin is more pronounced in cells over-expressing TRPC6 when compared to HEK or HEK-TRPC3 cells. TRPC6 channels are expressed in cortical neurons. Electrophysiological recordings and experiments with the fluorescent zinc probe FluoZin-3 demonstrated that TRPC6 channels are permeable to zinc in neurons. The size of the 2-2 'dithiodipyridine (DTDP) sensitive pool of zinc is augmented after the entry of this metal through TRPC6. These channels form a zinc entry pathway in cortical neurons. In some cell types, TRPC6 are involved in the mechanism of calcium entry in response to the depletion of intracellular pools of calcium. This calcium entry occurs via store-operated Ca channels (SOC). In our experiments, we have shown that in cortical neurons, hyperforin-sensitive channels and SOC are distinct since they exhibit distinct pharmacological properties. Hyperforin influences the homeostasis of metals in cortical neurons. We found that acute or chronic applications of this antidepressant decreases the size of the mitochondrial pools of calcium and zinc. In addition, in vitro and in vivo data show that a chronic treatment causes a cellular redistribution of zinc, associated with an increased expression of metallothioneins. Furthermore, brains of mice are enriched in sulfur. It seems that this antidepressant influences the zinc storage capacities of brain cells by altering the cellular expression of thiol-containing molecules. Hyperforin is an extract of the medicinal plant St John Worth. This latter one possesses complex properties, acting notably on the BDNF pathway. A chronic treatment with hyperforin increases the expression of TrkB and P-TrkB in the cortex of mice. In cortical neurons, TrkB, CREB and P-CREB are up regulated by a chronic treatment with hyperforin. This process is sensitive to inhibitors of PKA, TRPC6 channels and to the chelator of calcium BAPTA-AM. On the other hand, a chronic treatment with hyperforin does not influence the BDNF pathway in the hippocampus and also does not modulate the adult neurogenesis. Thus, the brain effects of hyperforin are distinct from those induced by the whole St John Worth extract.

Intracellular Ca[superscript 2+] is involved in many biological processes in all cells throughout the organism. In non excitable cells, TRPC proteins located at the plasma membrane are calcium channels involved in calcium entry. TRPC6 is particularly studied since its implication in many pathologies, as FSGS, IPAH and some cancers. Its activation and regulation modes and mechanisms are yet fully understood, in spite of the intense research. The purpose of the present study is to investigate the regulation of TRPC6 by phosphorylation. For this, we used metabolic labeling and videomicroscopy techniques in order to evaluate direct TRPC6 phosphorylation and activity. We hence identified a basal as well as a PKC-dependent phosphorylation on TRPC6. PKC is known to modulate the activity of TRPC1, TRPC3, TRPC4 and TRPC5. Recent studies also showed that TRPC6 is inhibited by PKC. Our first study confirms that activation of PKC leads to TRPC6 activity inhibition. When using GF1, a specific PKC inhibitor, calcium entry in TRPC6-expressing cells is potentiated. We moreover show that TRPC6 is phosphorylated following PKC activation. We identify the serine at position 448 as being phosphorylated and responsible for the PKC-mediated inhibition. The S448A mutant of TRPC6 is no longer phosphorylated nor inhibited by PKC. This first study thus demonstrates that PKC-dependent phosphorylation of serine 448 of TRPC6 mediates channel inhibition. In the second study, we investigate the basal phosphorylation of TRPC6, which was observed in the first study. Mass spectrometry analysis identified serine 814 as being potentially phosphorylated, a fact confirmed by metabolic labeling assays performed on the S814A mutant of TRPC6. We show that the S814A mutation does not affect TRPC6 activity. Even though the S814 is in a consensus CK2 phosphorylation sequence, we also show that CK2 is not involved in the phosphorylation or the regulation of TRPC6. These studies thus led to the identification of two new phosphorylations on TRPC6, serine 448 and 814. We also characterized the mechanism by which PKC regulates TRPC6.

Les canaux TRPC6 sont des canaux cationiques non sélectifs perméables au calcium et au sodium. In vitro, ils laissent passer du manganèse, du baryum ou du fer. Ces canaux peuvent être activés par des analogues du diacylglycérol (SAG ou OAG) et par l'hyperforine (un antidépresseur d'origine végétal). Des expériences de dosages par ICP-OES, d'imagerie synchrotron et d'imagerie de fluorescence du FluoZin-3 ont montré que les cellules HEK surexprimant TRPC6 sont enrichies en zinc. Ces cellules sont plus sensibles à un stress oxydant et produisent plus d'espèces réactives de l'oxygène que les cellules HEK non transfectées. Dans les cellules HEK exprimant TRPC6, l'entrée de zinc en réponse au SAG est plus importante que celle observée dans les cellules HEK ou HEK-TRPC3. Les canaux TRPC6 sont exprimés dans les neurones corticaux. En réalisant des expériences d'imagerie de fluorescence et d'électrophysiologie, nous avons observé que l'activation de ces canaux par le SAG ou par l'hyperforine permettait l'entrée de zinc dans les neurones. La taille du pool de zinc fixé sur des protéines à groupement thiols est augmentée après un influx de zinc via TRPC6. Ceux-ci forment donc une voie d'entrée pour ce métal dans les neurones corticaux embryonnaires. Dans certains types cellulaires, les canaux TRPC6 participent à l'entrée calcique déclenchée en réponse à la déplétion du stock calcique du réticulum (canaux SOC). Cependant, dans les neurones corticaux, les voies SOC et activées par l'hyperforine possèdent des propriétés pharmacologiques distinctes suggérant que les canaux TRPC6 ne participent pas à la voie SOC. L'homéostasie des métaux dans les neurones est perturbée par l'hyperforine. Cet antidépresseur diminue la taille des pools de calcium et de zinc des mitochondries à la fois lors de traitements aigus et chroniques. Une relocalisation du zinc est observée dans les neurones traités de façon chronique à l'hyperforine ainsi qu'une augmentation de l'expression des métallothionéines à la fois in vitro et in vivo. Chez la souris, la quantité de soufre du cerveau est augmentée lors un traitement à l'hyperforine. Celle-ci serait donc un antidépresseur qui module les capacités de stockage du zinc en augmentant le nombre de groupements thiols cellulaires. L'hyperforine est présente dans les extraits de millepertuis. Ceux-ci ont diverses cibles pharmacologiques, agissant notamment sur la voie de signalisation du BDNF. Nos expériences montrent que, lors d'un traitement chronique de souris adultes, l'hyperforine augmente l'expression de TrkB et P-TrkB dans le cortex. In vitro, dans les neurones corticaux, TrkB, CREB et P-CREB sont surexprimés après un traitement de trois jours à l'hyperforine. L'inhibition de la PKA ou le blocage des canaux TRPC6 par le SKF-96365 empêche l'effet de l'hyperforine. Par ailleurs, la chélation du calcium par le BAPTA-AM supprime partiellement l'effet de l'hyperforine. Un traitement chronique avec cet extrait végétal semble agir sur une voie dépendante de la PKA et du calcium pour réguler la phosphorylation de CREB et l'expression de TrkB. Nos expériences montrent que l'effet de l'hyperforine sur les acteurs de la voie du BDNF n'est pas présent au niveau de l'hippocampe où l'expression de TrkB n'est pas affectée. De plus, ces traitements n'influencent pas la neurogenèse adulte chez la souris. L'hyperforine seule n'explique donc pas les effets complexes des extraits de millepertuis sur les activités neuronales.

Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the extremely fatal brain tumors. The main reason that makes it so lethal is its capability to invade and spread to other parts of CNS producing secondary tumors. Among other factors hypoxia, reduced oxygen availability, is linked to higher metastatic potential of cancers. Hypoxia causes numerous changes in genome and proteome of the cell. These changes help a normal cell to adapt to nutritional deficiency, but the same changes can increase the malignancy and metastasis in tumor cells. Extensive research by a number of curious scientists reveal that various pathways involving numerous proteins cross-talk and interact with each other and execute a response to hypoxia. We are trying to establish the link between two such pathways HIF1-alpha pathway and Notch pathway. Both, HIF1-alpha, which is a transcription factor that becomes active in hypoxic conditions and Notch, which is an evolutionarily conserved cell-fate determinant, are implicated in hypoxia-induced metastasis of cancer. In this given project, we confirm the cross talk between Notch and HIF1-alpha pathway and further continue our study to show that TrpC6 is the downstream mediator of this pathway, leading to metastasis of GBM. Expression analysis of hypoxia-induced U373 cells (Grade 3 glioblastoma cells), using Real-time PCR, western blot and immunocytochemistry, revealed elevated levels of Notch, Hif1 and TrpC6 indicating that these proteins might be important for the cellular response to hypoxia. Blocking Notch and/or HIF1-alpha, either by DAPT or HIF1-inhibitor, confirmed the communication between these two pathways. Role of TrpC6 in metastasis was demonstrated by knocking down this gene using siRNA against TrpC6. Inhibition of TrpC6 markedly decreased cell proliferation, migration, angiogenesis and tumorigenesis in these hypoxia-induced Glioblastoma cells. In summary, all these results reveal that TrpC6 is indeed an important member of the Notch-mediated metastasis of Glioblastoma under hypoxic conditions. This role of TrpC6 can therefore be utilized for pharmacological intervention to prevent hypoxia-induced metastasis in GBM.

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Os transtornos do espectro autista (TEA) são um grupo de doenças neuropsiquiátricas caracterizadas por um prejuízo na capacidade de comunicação e de interação social e por padrões comportamentais estereotipados. Os TEA são geneticamente heterogêneos o que dificulta a identificação das alterações genéticas que estão contribuindo para estes transtornos. No presente estudo, selecionamos como uma primeira abordagem o estudo de translocações cromossômicas, buscando encontrar genes candidatos para posteriores estudos funcionais. No primeiro caso, uma translocação de novo balanceada envolvendo os cromossomos 2q11 e Xq24, não identificamos nenhum candidato funcional rompido pelos pontos de quebra. Detectamos ainda a presença de uma isodissomia materna do cromossomo 5 nesta paciente. Este resultado sugere que, possivelmente, tanto a translocação cromossômica quanto a isodissomia devem estar contribuindo para a etiologia do TEA nesta paciente, caracterizando este como um caso de efeito poligênico. Já o estudo da translocação de novo balanceada (3,11)(p21,q22) revelou que o gene TRPC6, um canal de cálcio envolvido no desenvolvimento de dendritos e sinapses excitatórias, encontrava-se rompido no cromossomo 11 deste paciente. As análises dos neurônios e células progenitoras neurais deste paciente obtidas através da técnica de reprogramação celular e o estudo global de expressão gênica sugerem fortemente que o rompimento do gene TRPC6 é o fator etiológico do TEA neste caso. Por fim, nós também realizamos um estudo de expressão gênica global de pacientes autistas idiopáticos e verificamos que os genes diferencialmente expressos nestes pacientes estão principalmente envolvidos na regulação da dinâmica do citoesqueleto, indicando que este pode ser o processo biológico comumente afetado nos pacientes autistas. Nosso trabalho mostra que os estudos citogenéticos são importantes para a identificação de genes candidatos para os TEA e reforça a hipótese de que estes transtornos são causados por diferentes variantes genéticas mas que levam ao comprometimento de um processo biológico comum. Acreditamos que o modelo de reprogramação celular contribuirá para o entendimento da implicação de tais processos na etiologia dos TEA. / Autism spectrum disorders (ASD) are a group of neurodevelopmental diseases characterized by impairments in social and communicative skills and repetitive behaviors. The investigation of ASD causes is hampered by the genetic heterogeneity of these neurodevelopmental diseases. In the present study, we mapped the breakpoints associated to chromosomal translocations found in two autistic patients as a first screening approach, trying to identify single candidate genes that could be further investigated by functional analysis. In the first case, a de novo balanced translocation involving the chromosomes 2q11 and Xq24, we did not find any functionally known relevant gene disrupted by the breakpoints but, surprisingly, SNP-array data showed that the patient also presents a maternally inherited isodisomy on chromosome 5. In this case, is possible that ASD is caused by the combination of the molecular results caused by the translocation and the UPD on chromosome 5, which would characterize this case as an example of polygenic effects on ASD etiology. On the other hand, the study of a second case, a boy with a de novo balanced translocation (3;11)(p21;q22), revealed that TRPC6, a calcium channel involved in dendritic spine and excitatory synapse formation, was disrupted by the translocation on chromosome 11. Making use of cellular reprogramming to generate neurons and neuronal progenitor cells from this patient and expression analysis, we demonstrated that TRPC6 disruption can respond for the phenotype seen in this patient. Finally, we also performed a genome-wide expression analysis to investigate idiopathic autistic patients and we verified that ASD DEGs are mainly implicated in cytoskeleton dynamics, suggesting that the regulation of this cellular structure can be one of the common mechanisms of ASD etiology. Our work shows that cytogenetic studies are important for the identification of ASD candidate genes and reinforces the hypothesis that these disorders are caused by different genetic variants that are implicated in a common biological process. We believe that cellular reprogramming will contribute for the understanding of the implication of such biological processes in the etiology of ASD.

Os transtornos do espectro autista (TEA) são um grupo de doenças neuropsiquiátricas caracterizadas por um prejuízo na capacidade de comunicação e de interação social e por padrões comportamentais estereotipados. Os TEA são geneticamente heterogêneos o que dificulta a identificação das alterações genéticas que estão contribuindo para estes transtornos. No presente estudo, selecionamos como uma primeira abordagem o estudo de translocações cromossômicas, buscando encontrar genes candidatos para posteriores estudos funcionais. No primeiro caso, uma translocação de novo balanceada envolvendo os cromossomos 2q11 e Xq24, não identificamos nenhum candidato funcional rompido pelos pontos de quebra. Detectamos ainda a presença de uma isodissomia materna do cromossomo 5 nesta paciente. Este resultado sugere que, possivelmente, tanto a translocação cromossômica quanto a isodissomia devem estar contribuindo para a etiologia do TEA nesta paciente, caracterizando este como um caso de efeito poligênico. Já o estudo da translocação de novo balanceada (3,11)(p21,q22) revelou que o gene TRPC6, um canal de cálcio envolvido no desenvolvimento de dendritos e sinapses excitatórias, encontrava-se rompido no cromossomo 11 deste paciente. As análises dos neurônios e células progenitoras neurais deste paciente obtidas através da técnica de reprogramação celular e o estudo global de expressão gênica sugerem fortemente que o rompimento do gene TRPC6 é o fator etiológico do TEA neste caso. Por fim, nós também realizamos um estudo de expressão gênica global de pacientes autistas idiopáticos e verificamos que os genes diferencialmente expressos nestes pacientes estão principalmente envolvidos na regulação da dinâmica do citoesqueleto, indicando que este pode ser o processo biológico comumente afetado nos pacientes autistas. Nosso trabalho mostra que os estudos citogenéticos são importantes para a identificação de genes candidatos para os TEA e reforça a hipótese de que estes transtornos são causados por diferentes variantes genéticas mas que levam ao comprometimento de um processo biológico comum. Acreditamos que o modelo de reprogramação celular contribuirá para o entendimento da implicação de tais processos na etiologia dos TEA. / Autism spectrum disorders (ASD) are a group of neurodevelopmental diseases characterized by impairments in social and communicative skills and repetitive behaviors. The investigation of ASD causes is hampered by the genetic heterogeneity of these neurodevelopmental diseases. In the present study, we mapped the breakpoints associated to chromosomal translocations found in two autistic patients as a first screening approach, trying to identify single candidate genes that could be further investigated by functional analysis. In the first case, a de novo balanced translocation involving the chromosomes 2q11 and Xq24, we did not find any functionally known relevant gene disrupted by the breakpoints but, surprisingly, SNP-array data showed that the patient also presents a maternally inherited isodisomy on chromosome 5. In this case, is possible that ASD is caused by the combination of the molecular results caused by the translocation and the UPD on chromosome 5, which would characterize this case as an example of polygenic effects on ASD etiology. On the other hand, the study of a second case, a boy with a de novo balanced translocation (3;11)(p21;q22), revealed that TRPC6, a calcium channel involved in dendritic spine and excitatory synapse formation, was disrupted by the translocation on chromosome 11. Making use of cellular reprogramming to generate neurons and neuronal progenitor cells from this patient and expression analysis, we demonstrated that TRPC6 disruption can respond for the phenotype seen in this patient. Finally, we also performed a genome-wide expression analysis to investigate idiopathic autistic patients and we verified that ASD DEGs are mainly implicated in cytoskeleton dynamics, suggesting that the regulation of this cellular structure can be one of the common mechanisms of ASD etiology. Our work shows that cytogenetic studies are important for the identification of ASD candidate genes and reinforces the hypothesis that these disorders are caused by different genetic variants that are implicated in a common biological process. We believe that cellular reprogramming will contribute for the understanding of the implication of such biological processes in the etiology of ASD.