Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-22T17:38:21Z No. of bitstreams: 1 2015_HialyCristinaCamargosPoli.pdf: 1606339 bytes, checksum: ad09dfd2eb11ded44e751e88caf91e5a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-06-24T21:11:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_HialyCristinaCamargosPoli.pdf: 1606339 bytes, checksum: ad09dfd2eb11ded44e751e88caf91e5a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T21:11:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_HialyCristinaCamargosPoli.pdf: 1606339 bytes, checksum: ad09dfd2eb11ded44e751e88caf91e5a (MD5) / A Doença de Chagas é considerada uma doença negligenciada, endêmica na América Latina. e com tratamento ainda ineficaz. Estima-se que existam atualmente entre 6 e 7 milhões de pessoas infectadas pelo Trypanosoma cruzi (agente causador da doença) em todo o mundo. Esforços têm sido feitos na busca da produção de medicamentos efetivos e seguros além da necessidade na produção de uma vacina, tendo em vista a dificuldade do diagnóstico. Durante a transmissão vetorial, mais comum em regiões endêmicas Triatomíneos liberam formas tripomastigotas na corrente sanguínea que logo após contato com vários tipos celulares, inicia um processo de interação e infecção celular. Essa fase inicial é fundamental para a continuidade do ciclo biológico do parasito e instalação da doença. Dada a importância dessa fase, e pouco conhecimento sobre a modulação da célula hospedeira, o presente estudo realizou uma análise da célula hospedeira após interação inicial, utilizando para isso uma abordagem proteômica. Para essa investigação foi realizada análise comparativa por LC-MS/MS do extrato proteico de células HeLa (não fagocíticas) controle com extrato proteico de células HeLa após uma hora em contato com formas tripomastigotas (forma infectiva). Nossos resultados mostraram alteração em proteínas já conhecidas como por exemplo, proteínas de ligação ao cálcio e ao citoesqueleto. Ao se observar de forma detalhada proteínas com diminuição na abundância, foram encontradas proteínas constituintes do fator de histocompatibilidade de classe 1 (MHC1), subunidades importantes na montagem e função catalítica do proteassoma. Foram encontradas proteínas até então não descritas na literatura como moduladas pelo T. cruzi. Uma delas foi o aumento da Rpn11, uma subunidade do proteassoma com função de desubiquitinase, e a diminuição da cullina associada a NEDD8, uma proteína envolvida na identificação e ubiquitinação de proteínas que devem ser degradas. O processo de interação do T. cruzi com células HeLa também propiciou a modulação de proteínas participantes de outros processos celulares, como metabolismo, ligação ao DNA e chaperonas. / Chagas disease is regarded as a neglected illness endemic from Latin Americ and, furthermore, available drugs have limited efficacy and high toxicity. It is estimated that 6 to 7 milion people worldwide are infected by Trypanosoma cruzi (the etiologic agent of the disease). Nonetheless, efforts toward more effective treatment have been made as well as a vaccine is being pursued. In the vectorial transmission of the parasite, the most common in endemic regions, triatominean bugs release trypomastigotes in the lood stream. The parasites through the contact with several host cell types initiate biochemical processes for cell interaction and infection. This early stage is Given its importance, and the limited information available regarding the modulation of the host cell, this study analyzed the T. cruzi infection effects in mammalian host cells at the early stages of the process through high-throughput proteomic approach. Therefore, a comparative quantitative proteome analysis by means of LCMS/ MS was carried out between Hela cells which were incubated or not with trypomastigote forms (the main infective life form) The resulting list of regulated proteins showed known proteins, e.g calcium and cytoskeleton binding proteins. Regarding proteins with decreased expression, there were Major Histocompatibility Complex I proteins and subunits of the proteasome machinery important to its assembly and catalytic functions. This also corroborates with recent studies demonstrating its relevance on escaping the immune system’s surveillance by jeopardizing the host cell antigen presentation. Also there were proteins related to the ubiquitination process. And among those with no expression modulation reported so far, here we observed an increase in Rpn11, a proteasome subunit with deubiquitinase function, and decrease in cullin associated to NEDD8, a protein involved recognition and ubiquitination of proteins to be degraded. The interaction process between T. cruzi and HeLa cells also caused the modulation of proteins involved in metabolism, DNA binding and chaperones. This work underlines the need for further studies on processes of ubiquitination , degradation and targeting of T. cruzi proteins to MHC1 by host cells , which may be used by the immune system for the elimination of the parasite.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-10T18:21:06Z No. of bitstreams: 1 2016_PaulaBeatrizSantiago.pdf: 14571538 bytes, checksum: e6692f71f1b3e972f9f5a7e93a8a6ea1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-10T18:22:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_PaulaBeatrizSantiago.pdf: 14571538 bytes, checksum: e6692f71f1b3e972f9f5a7e93a8a6ea1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-10T18:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_PaulaBeatrizSantiago.pdf: 14571538 bytes, checksum: e6692f71f1b3e972f9f5a7e93a8a6ea1 (MD5) Previous issue date: 2017-10-10 / Programa de apoio a Núcleos de excelência (PRONEX); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF); Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP). / A doença de Chagas é causada pelo tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi, geralmente transmitido ao hospedeiro vertebrado através do contato com as fezes do inseto vetor infectado durante o repasto sanguíneo. A lesão vascular ocasionada pela picada do triatomíneo hematófago desencadeia no hospedeiro manifestações que poderiam interferir na alimentação, tais como resposta imune, inflamação e hemostasia. No entanto, os insetos hematófagos são capazes de neutralizar essas defesas através de um complexo repertório de moléculas salivares, fundamentais para a manutenção do fluxo sanguíneo e o sucesso do repasto. No intuito de conhecer a complexidade molecular da saliva dos triatomíneos Rhodnius neglectus e Triatoma dimidiata, esta tese descreve os transcritomas de suas glândulas salivares utilizando sequenciamento de próxima geração. Foram obtidos 5.704 transcritos a partir da biblioteca de cDNA das glândulas salivares de T. dimidiata e 5.705 da biblioteca de R. neglectus, dos quais 662 e 636, respectivamente, codificam proteínas secretadas. A análise revelou a expressão de famílias gênicas já descritas na saliva de outros hematófagos, como lipocalinas, grupo abundante, antígeno-5 e apirases. Além disso, inibidores de proteases do tipo Kazal e proteases também foram encontrados. Adicionalmente, o conteúdo salivar foi submetido à análise proteômica, sendo identificadas 111 e 73 proteínas nos proteomas de T. dimidiata e R. neglectus, respectivamente. Os resultados obtidos validaram alguns transcritos putativamente secretados. Este estudo evidenciou que a saliva dos triatomíneos investigados tem característica multifuncional diretamente relacionada a diferentes atividades anti-inflamatórias, anti-hemostáticas e imunomoduladoras. O estudo dos compostos salivares auxilia a compreensão acerca da biologia dos vetores e transmissão de doenças, da evolução dos hematófagos, além de estimular a busca por novos fármacos. / Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi trypanosomatid, usually transmitted to vertebrate host through contact with faeces of infected vector insects during a blood meal. The vascular injury caused by the bite triggers symptoms capable to preventing an association with the host, such as immune response, inflammation and haemostasis. However, hematophagous arthropods are able to neutralize these defenses through a complex repertoire of salivary proteins acting as vasodilators, antiplatelets and anticoagulants. These molecules are essential for the blood flow maintenance and the success of the blood meal. In order to understand the salivary molecular complexity of Rhodnius neglectus and Triatoma dimidiata, this work describes their salivary glands (SG) transcriptome using next-generation sequencing. It was possible to obtain 5,704 transcripts from T. dimidiata and 5,705 from R. neglectus SGs, of which 662 and 636 encoded putatively secreted proteins respectively. The analysis revealed the expression of gene families already described in the saliva of other hematophagous insects, such as lipocalin, abundant protein family, antigen-5 and apyrases. Besides, Kazal type protease inhibitors and proteases were also found. In addition, the salivary content was submitted to proteomic analysis, being possible to identify 111 and 73 proteins in T. dimidiata and R. neglectus proteomes respectively. The results validated some putatively secreted transcripts. This work showed that saliva of the triatomines investigated here possess multi-functional feature directly related to different anti-inflammatory, anti-hemostatic and immunomodulatory activities. Salivary research helps the understanding of vector biology and disease transmission, hematophagous evolution, in addition to stimulating the search for new drugs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-11-03T16:56:43Z No. of bitstreams: 1 2015_MarcelleAraujoRibeiro.pdf: 2353438 bytes, checksum: 52175a4000b57978111e13f9f7945300 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-11-05T10:07:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MarcelleAraujoRibeiro.pdf: 2353438 bytes, checksum: 52175a4000b57978111e13f9f7945300 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-05T10:07:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MarcelleAraujoRibeiro.pdf: 2353438 bytes, checksum: 52175a4000b57978111e13f9f7945300 (MD5) / O Trypanosoma cruzi é transmitido principalmente por via vetorial, entretanto, outras vias de transmissão também apresentam importância epidemiológica, como a transfusão sanguínea, a via transplacentária e por meio da contaminação de alimentos. A transmissão sexual do T. cruzi foi sugerida por vários pesquisadores, desde a descoberta da doença de Chagas, contudo, poucos trabalhos científicos foram realizados. Pesquisas anteriores sugerem que camundongos infectados podem transmitir o parasito por via sexual durante a fase aguda da doença, quando a carga parasitária é alta. Como a maioria dos indivíduos infectados são diagnosticados na fase crônica, é de extrema importância investigar se também ocorre a transmissão sexual do T. cruzi em condições de baixa parasitemia. O presente trabalho teve como objetivo investigar a transmissão sexual do T. cruzi no modelo experimental murino durante a fase crônica. Dez camundongos BALB / c, machos e fêmeas sexualmente maduros, infectadas por via intraperitoneal com 103 formas tripomastigotas de T. cruzi, foram cruzados com animais não infectados após 90 dias da infecção. Os casais foram avaliados depois de duas gestações e a infecção pelo T. cruzi foi analisada por testes parasitológicos, sorológicos e métodos moleculares. Além disso, foi determinada a carga parasitária em diferentes tecidos por qPCR. Os resultados mostram que camundongos cronicamente infectados por T. cruzi podem transmitir o parasita aos parceiros sexuais. O exame parasitológico identificou o parasito no sangue periférico em 100% dos animais infectados intraperitonialmente e em 20% dos camundongos que foram infectados pela via sexual. Os testes sorológicos e moleculares demonstraram a presença de anticorpos específicos e amplicons em todos os animais testados após o período de 120 dias. Análise histopatológica do coração, testículo/ovário, intestino e músculo, identificou a presença de infiltrado inflamatório moderado e destruição de fibras cardíacas nos animais infectados pela via intraperitoneal, na ausência de ninhos de amastigota. A transmissão sexual do parasita para fêmeas inicialmente não infectadas também foi validada pela identificação da infecção transplacentária para os filhotes. A análise da progênie mostrou que a infecção congênita ocorreu em 25/26 (96,15%) animais, que apresentaram resultados positivos nos testes moleculares. Os resultados confirmam a transmissão sexual do T. cruzi na fase crônica da infecção. Até onde sabemos, esta é a primeira demostração experimental da transmissão sexual do T. cruzi na fase crônica da infecção. A via sexual pode ser um fator potencial de dispersão da Doença de Chagas no mundo. A determinação desta via de transmissão em animais cronicamente infectados é de suma importância, uma vez que a maioria dos indivíduos com CD encontram-se na fase crônica. Além disso, estudos epidemiológicos em áreas livres de triatomíneos são necessários para determinar o potencial de infectividade em casais em que apenas um dos parceiros tem uma história de CD, favorecendo a maior compreensão da importância da transmissão sexual em populações humanas. / Trypanosoma cruzi is mainly transmitted by haematophagous triatomines, however, other routes of transmission also have epidemiological importance, such as blood transfusion, transplacental route and through food contamination. Sexual transmission of T. cruzi was suggested by several researchers, since the discovery of Chagas disease, but, few scientific studies have been conducted on the subject. Previous work suggests that infected mice can transmit the parasite sexually during the acute phase of the disease, when the parasite load is high. Since most infected individuals are diagnosed during the chronic phase, it is important to investigate whether also occurs sexual transmission of T. cruzi in low parasitaemia conditions. This study aimed to investigate the sexual transmission of T. cruzi in murine model during the chronic phase. Ten sexually mature BALB/c, males and females, infected intraperitoneally with 103 T. cruzi trypomastigotes were crossbred with non-infected animals 90 days after infection. The couples were assayed after two pregnancies and T. cruzi infection was analyzed by parasitological, serological and molecular methods. In addition, parasite load was determined in different tissues by qPCR. The results show that mice chronically infected with T. cruzi can transmit the parasite to sexual partners. Parasitological test identified the parasite in the peripheral blood in 100% of intraperitoneally infected animals and in 20% of mice that were infected through sexual contact. The serologic and molecular analysis demonstrated the presence of specific antibodies and amplicons in all animals tested after 120 days. Histolopathological analysis of heart, testis / ovary, intestine and muscle identified the presence of mild infiltration and destruction of cardiac fibers in animals infected intraperitoneally, in absence of amastigote nests. Sexual transmission of the parasite to naive females was also validated by the identification of transplacental infection in their offspring. Progeny analysis showed that congenital infection arised in 25/26 (96.15%) animals, which showed positive results in molecular tests. The results confirm the sexual transmission of T. cruzi in the chronic phase of infection. To the best of our knowledge, this is the first confirmation of sexual transmission of T. cruzi, a route with great potential for spreading CD worldwide. The determination of this pathway in chronically infected animals is of paramount importance, since most individuals with CD are in the chronic phase. In addition, epidemiological surveys in triatomine-free areas are required to determine the infectivity rate in couples in which only one partner has a history of CD, thus helping to clarify the importance of this mode of transmission in human populations.