Zugl.: Berlin, Freie University, Diss., 2004. / Text engl. - Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format.

Trypanosoma, a genus of parasitic protists, is responsible for trypanosomiasis, a disease that affects both humans and animals, with a wide impact across 36 countries in sub-Saharan Africa. The transmission of these parasites is intimately linked to their blood-sucking vector, the tsetse fly. Once the tsetse fly takes up trypanosomes during a bloodmeal, the parasites undergo a complex developmental process within the fly's alimentary tract before reaching the fly's salivary glands or mouthparts and differentiating back into a mammalian infective stage. This intricate relationship underscores the importance of understanding the interaction between trypanosomes and tsetse flies in combating the spread of this neglected tropical disease. Subspecies of Trypanosoma brucei are the main cause of human African trypanosomiasis (HAT) while also playing a large role in animal African trypanosomiasis (AAT). In the mammalian host, T. brucei has two bloodstream forms, the long, proliferative slender form and the short-lived, cell cycle-arrested stumpy form. Slender forms dominate early on in infections and differentiate into stumpy forms in a density-dependent manner. The dogma of the past two decades suggested that the transition from slender to stumpy forms was thought to accomplish two functions. The first was to regulate the parasite load in the host, thereby reducing virulence, prolonging infections, and consequently increasing the chances of transmission. The second was that the stumpy form was thought to be the only developmental form able to infect the tsetse fly and spread the disease. This was called into question in 2021 however, when it was shown that slender forms could also infect tsetse flies (Schuster et al., 2021). This finding caused a debate as to whether slender forms can truly infect tsetse flies without using the infection-enhancing methods for fly infections commonly applied in a laboratory setting. The differentiation from stumpy cells to the first fly-resident form, the procyclic form has been studied in depth. While it has been known that slender cells can be differentiated to procyclic forms in vitro, the relevance of this to in vivo fly infections has not been extensively considered. The possibility that both bloodstream form trypanosomes might be able to infect the tsetse fly would have major implications in disease epidemiology. The main focus of this thesis was to confirm that slender bloodstream forms can infect tsetse flies in a natural infection, as well as to look at the marker proteins involved and how the timing of their expression compares to the stumpy form. To do this, fly infections were carried out using monomorphic trypanosomes, which are unable to become stumpy forms, with and without the addition of infection enhancing chemicals. Fly infections with pleomorphic trypanosomes, able to become slender or stumpy, were also carried out with flies of different ages, as these more fully represent flies in the wild. This showed that slender forms can infect tsetse flies in low numbers without additional chemicals, and in both young and old flies. This study further explored the slender to procyclic differentiation process using molecular markers and RNA sequencing, providing evidence that slender forms can directly differentiate to procyclic forms and complete their life cycle within the fly. The second part of this thesis focused on T. congolense, a sympatric trypanosome species responsible for AAT. Unlike T. brucei, T. congolense is monomorphic, possessing only one bloodstream form. This bloodstream form appears to rely on attachment to host red blood cells (RBCs) rather than active motility to survive in the mammalian bloodstream. The attachment mechanism has long been speculated to involve an enzyme called trans-sialidase (TS), responsible for transferring host sugars to the parasite surface. While the importance of TS for T. brucei survival in the tsetse fly and the American trypanosome T. cruzi in its mammalian hosts has been established, the role of TS in T. congolense remains incompletely understood. Therefore, the second objective of this thesis was to carry out preliminary experiments to investigate whether TS is responsible for T. congolense attachment to host cells. This was done by generating TS expressing T. brucei cells and checking for RBC attachment. In summary, this work uncovers greater plasticity in the development of trypanosomes than previously known. The linear life cycle originally ascribed to T. brucei has been challenged, revealing multiple forms that can infect tsetse flies. This change in the life cycle and the investigation of molecular signals involved in this transition have significant implications not only for the basic understanding of the parasite, but also for advancing efforts to eliminate trypanosomiasis. Furthermore, the identification of signals crucial for certain trypanosome species, such as TS, which may operate in different life cycle stages in other trypanosomes, highlights the plasticity of trypanosomes and provides insights into the optimal strategies for combatting the various parasite species contributing to trypanosomiasis. / Trypanosoma, eine Gattung parasitischer Einzeller, ist für die Trypanosomiasis verantwortlich, eine Krankheit, die sowohl Menschen als auch Tiere betrifft und in 36 Ländern in Subsahara-Afrika weit verbreitet ist. Die Übertragung dieser Parasiten ist eng mit ihrem blutsaugenden Vektor, der Tsetsefliege, verbunden. Sobald die Tsetsefliege Trypanosomen während einer Blutmahlzeit aufnimmt, durchlaufen die Parasiten einen komplexen Entwicklungsprozess im Verdauungstrakt der Fliege, bevor sie sich wieder in eine infektiöse Form für Säugetiere differenzieren, und sich in den Speicheldrüsen oder Mundteilen der Fliege ansammeln. Diese komplexe Beziehung unterstreicht die Bedeutung für das Verständis der Wechselwirkung zwischen Trypanosomen und Tsetsefliegen bei der Bekämpfung der Verbreitung dieser vernachlässigten Tropenkrankheit. Unterarten von Trypanosoma brucei sind die Hauptursache für die afrikanische Schlafkrankheit beim Menschen (HAT) und spielen auch eine große Rolle bei der afrikanischen Tiertrypanosomiasis (AAT). Im Säugetierwirt hat T. brucei zwei Blutbahnformen: die langen, proliferativen slender und die kurzlebigen, im Zellzyklus verbleibenden stumpy Formen. Am Anfang einer Infektion dominieren die slender Formen und differenzieren sich in einer dichteabhängigen Weise zu stumpy Formen. Das Dogma der letzten beiden Jahrzehnte besagte, dass der Übergang von slender zu stumpy Formen zwei Funktionen erfüllt. Die erste Funktion besteht darin, die Parasitenlast im Wirt zu regulieren, um die Virulenz zu verringern und die Dauer der Infektionen zu verlängern, was wiederum die Übertragungschancen des Parasiten erhöht. Die zweite Funktion besteht darin, dass man annahm, dass nur die stumpy Form in der Lage sei, die Tsetsefliege zu infizieren und die Krankheit zu verbreiten. Dies wurde jedoch im Jahr 2021 in Frage gestellt, als gezeigt wurde, dass auch slender Formen Tsetsefliegen infizieren können (Schuster et al., 2021). Diese Erkenntnis führte zu einer Debatte darüber, ob slender Formen tatsächlich Tsetsefliegen infizieren können, ohne die Verwendung von in Laboren üblichen infektionsfördernden Methoden. Die Unterscheidung von stumpy Zellen zur ersten Differenzierungsstufe, der procyclischen Form, wurde eingehend untersucht. Obwohl bekannt war, dass slender Zellen in vitro zu procyclischen Formen differenziert werden können, wurde deren Relevanz für in vivo Fliegeninfektionen nicht genau genug betrachtet. Die Möglichkeit, dass beide Blutbahnformen der Trypanosomen die Tsetsefliege infizieren könnten, hätte erhebliche Auswirkungen auf die Epidemiologie der Krankheit. Die primäre Fragestellung der vorliegenden Arbeit war, ob slender Blutbahnformen Tsetsefliegen in einer natürlichen Umgebung infizieren können, sowie die beteiligten Markerproteine zu untersuchen und den Zeitpunkt ihrer Expression mit der stumpy Form zu vergleichen. Hierfür wurden Fliegeninfektionen mit monomorphen Trypanosomen durchgeführt, die nicht zu stumpy Formen werden können. Dies wurde sowohl mit als auch ohne Zugabe von infektionsfördernden Chemikalien sowie mit Fliegen unterschiedlichen Alters durchgeführt, um mit einem realitätsnahen Modell zu arbeiten. Dies zeigte, dass slender Formen Tsetsefliegen in geringer Anzahl ohne zusätzliche Chemikalien und sowohl bei jungen als auch bei alten Fliegen infizieren können. Diese Arbeit untersuchte weiterhin den Prozess der Differenzierung von slender zu procyclischen Formen unter Verwendung molekularer Marker und RNA-Sequenzierung. Dies lieferte Hinweise darauf, dass slender Formen direkt zu procyclischen Formen differenzieren können und ihren Lebenszyklus innerhalb der Fliege abschließen. Der zweite Teil dieser Dissertation konzentrierte sich auf T. congolense, eine sympatrische Trypanosomenart, die für die AAT verantwortlich ist. Im Gegensatz zu T. brucei ist T. congolense monomorph und besitzt nur eine Blutbahnform. Diese Blutbahnform scheint sich auf die Bindung an rote Blutkörperchen (RBCs) des Wirts zu verlassen, anstatt aktiv beweglich zu sein, um im Säugetierblutkreislauf zu überleben. Der Bindungsmechanismus wurde lange Zeit spekulativ unter Beteiligung eines Enzyms namens Trans-Sialidase diskutiert, das für die Übertragung von Wirtszuckern auf die Oberfläche des Parasiten verantwortlich ist. Während die Bedeutung der Trans-Sialidase für das Überleben von T. brucei in der Tsetsefliege und des amerikanischen Trypanosoms T. cruzi in seinen Säugetierwirten etabliert wurde, ist die Rolle der Trans-Sialidase (TS) bei T. congolense noch nicht vollständig verstanden. Daher bestand die zweite Forschungsfrage darin, zu untersuchen, ob Trans-Sialidase für die Bindung von T. congolense an Wirtszellen verantwortlich ist. Dies wurde durch die Generierung von TS exprimierenden T. brucei-Zellen erreicht, die normalerweise nicht an RBCs binden und durch anschließende Überprüfung der Bindung von TS exprimierenden T. brucei Zellen an RBCs. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit eine größere Plastizität auf in der Entwicklung von Trypanosomen als bisher bekannt war. Der lineare Lebenszyklus, der ursprünglich T. brucei zugeschrieben wurde, wurde in Frage gestellt und es wurden multiple Formen entdeckt, die Tsetsefliegen infizieren können. Diese Veränderung im Lebenszyklus und die Untersuchung der molekularen Signale, die an diesem Übergang beteiligt sind, haben nicht nur erhebliche Auswirkungen auf das grundlegende Verständnis des Parasiten, sondern auch auf die Bemühungen zur Bekämpfung der Trypanosomiasis. Darüber hinaus weist die Identifizierung von Signalen, die für bestimmte Trypanosomenarten entscheidenden sind - wie der Trans-Sialidase, die in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus bei anderen Trypanosomen wirksam sein kann - auf die Plastizität der Trypanosomen hin und liefert Einblicke in optimale Strategien zur Bekämpfung der verschiedenen Parasitenarten, die zur Trypanosomiasis beitragen.

African trypanosomes are protist pathogens that are infective for a wide spectrum of mammalian hosts. Motility has been shown to be essential for their survival and represents an important virulence factor. Trypanosoma brucei is transmitted by the bite of the bloodsucking tsetse fly, the only vector for these parasites. The voyage through the fly is complex and requires several migration, proliferation and differentiation steps, which take place in a defined order and in specific fly tissues. The first part of this doctoral thesis deals with the establishment of the trypanosome tsetse system as a new model for microswimmer analysis. There is an increasing interdisciplinary interest in microbial motility, but a lack of accessible model systems. Therefore, this work introduces the first enclosed in vivo host parasite system that is suitable for analysis of diverse microswimmer types in specific microenvironments. Several methods were used and adapted to gain unprecedented insights into trypanosome motion, the fly´s interior architecture and the physical interaction between host and parasite. This work provides a detailed overview on trypanosome motile behavior as a function of development in diverse host surroundings. In additional, the potential use of artificial environments is shown. This can be used to partly abstract the complex fly architecture and analyze trypanosome motion in defined nature inspired geometries. In the second part of the thesis, the infection of the tsetse fly is under investigation. Two different trypanosome forms exist in the blood: proliferative slender cells and cell cycle arrested stumpy cells. Previous literature states that stumpy cells are pre adapted to survive inside the fly, whereas slender cells die shortly after ingestion. However, infection experiments in our laboratory showed that slender cells were also potentially infective. During this work, infections were set up so as to minimize the possibility of stumpy cells being ingested, corroborating the observation that slender cells are able to infect flies. Using live cell microscopy and fluorescent reporter cell lines, a comparative analysis of the early development following infection with either slender or stumpy cells was performed. The experiments showed, for the first time, the survival of slender trypanosomes and their direct differentiation to the procyclic midgut stage, contradicting the current view in the field of research. Therefore, we can shift perspectives in trypanosome biology by proposing a revised life cycle model of T. brucei, where both bloodstream stages are infective for the vector. / Afrikanische Trypanosomen sind pathogene Protisten, die ein breites Spektrum von Säugetierwirten infizieren. Es wurde gezeigt, dass die Zellmotilität für das Überleben der Parasiten essenziell ist und einen wichtigen Virulenzfaktor darstellt. Trypanosoma brucei wird durch den Biss der blutsaugenden Tsetsefliege übertragen, dem einzigen Vektor für diese Parasiten. Der Entwicklungszyklus in der Fliege ist komplex und beinhaltet mehrere Migrations-, Proliferations- und Differenzierungsschritte, die in einer definierten Reihenfolge und in spezifischen Fliegenorganen stattfinden. Der erste Teil dieser Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Etablierung des Trypanosomen Tsetse Systems als ein neues Modell für Motilitätsanalysen. Es besteht ein wachsendes interdisziplinäres Interesse an mikrobieller Motilität, aber es fehlen zugängliche Mikroschwimmersysteme. Deswegen stellt diese Arbeit das erste abgeschlossene in vivo Wirt Parasit System vor, das für Analysen von verschiedenen Mikroschwimmertypen in spezifischen Umgebungen geeignet ist. Verschiedene Methoden wurden benutzt und adaptiert, um sowohl Einblicke in die Trypanosomenbewegung, die innere Fliegenarchitektur als auch die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Parasit zu erhalten. Diese Arbeit bietet einen detaillierten Überblick über das motile Verhalten von Trypanosomen als Funktion der Entwicklung in diversen Wirtsumgebungen. Zusätzlich ist die potenzielle Nutzung von artifiziellen Umgebungen gezeigt. Diese können benutzt werden, um die komplexe Architektur der Fliege teilweise zu abstrahieren und die Trypanosomenbewegung in definierten und von der Nature inspirierten Geometrien zu analysieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Infektion der Fliege genauer betrachtet. Im Blut existieren zwei verschiedene Trypanosomenformen: proliferierende ‘slender’ und Zellzyklus arretierte ‘stumpy’ Zellen. Bisherige Literatur besagt, dass stumpy Zellen präadaptiert sind, um in der Fliege zu überleben, wohingegen slender Zellen kurz nach der Aufnahme sterben. Dennoch konnten Infektionsexperimente in unserem Labor zeigen, dass auch slender Zellen potenziell infektiös sind. Während dieser Arbeit wurden weitere Infektionen so durchgeführt, dass die Möglichkeit für die Aufnahme von stumpy Zellen minimiert wurde und die Infektionskapazität der slender Zellen bestätigt werden konnte. Durch Lebendzell Mikroskopie mit fluoreszenten Reporterzelllinien wurde eine vergleichende Analyse für die frühe Entwicklung von slender und stumpy Parasiten nach der Infektion durchgeführt. Die Experimente zeigten zum ersten Mal das Überleben von slender Trypanosomen in der Tsetsefliege und ihre direkte Differenzierung in das prozyklische Mitteldarmstadium. Sie widersprechen demnach der aktuellen Auffassung im Forschungsbereich. Demzufolge können wir von einem Perspektivwechsel in der Trypanosomenbiologie sprechen und schlagen einen revidierten Lebenszyklus für T. brucei vor, in dem beide Blutstromformen für den Vektor infektiös sind.

Trypanosoma brucei is a digenetic eukaryotic parasite that develops in different tissues of a mammalian host and a tsetse fly. It is responsible for sleeping sickness in sub-saharan Africa. The parasite cycle involves more than nine developmental stages that can be clearly distinguished by their general morphology, their metabolism and the relative positioning of their DNA-containing organelles. During their development, trypanosomes remain exclusively extracellular and encounter changing environments with different physico-chemical properties (nutritional availability, viscosity, temperature, etc.). It has been proposed that trypanosomes use their flagellum as a sensing organelle, in agreement with the established role of structurally-related cilia in metazoa and ciliates. Recognition of environmental triggers is presumed to be at the initiation of differentiation events, leading to the parasite stage that is the best suited to the new environment. These changes are achieved by the modification of gene expression programmes, mostly underlying post-transcriptional control of mRNA transcripts. We first demonstrate that the RNA-binding proteins ALBA3/4 are involved in specific differentiation processes during the parasite development in the fly. They are cytosolic and expressed throughout the parasite cycle with the exception of the stages found in the tsetse fly proventriculus, as shown by both immunofluorescence and live cell analysis upon endogenous tagging with YFP. Knock-down of both proteins in the developmental stage preceding these forms leads to striking modifications: cell elongation, cell cycle arrest and relocalization of the nucleus in a posterior position, all typical of processes acting in parasites found in the proventriculus region. When ALBA3 is over-expressed from an exogenous copy during infection, it interferes with the relocalization of the nucleus in proventricular parasites. This is not observed for ALBA4 over-expression that does not visibly impede differentiation. Both ALBA3/4 proteins react to starvation conditions by accumulating in cytoplasmic stress granules together with DHH1, a recognized RNA-binding protein. ALBA3/4 proteins also partially colocalize with granules formed by polyA+ RNA in these conditions. We propose that ALBA are involved in trypanosome differentiation processes where they control a subset of developmentally regulated transcripts. These processes involving ALBA3/4 are likely to result from the specific activation of sensing pathways. In the second part of the thesis, we identify novel flagellar proteins that could act in sensing mechanisms. Several protein candidates were selected from a proteomic analysis of intact flagella performed in the host laboratory. This work validates their flagellar localization with high success (85% of the proteins examined) and defines multiple different patterns of protein distribution in the flagellum. Two proteins are analyzed during development, one of them showing down-regulation in proventricular stages. The functional analysis of one novel flagellar membrane protein reveals its rapid dynamics within the flagellum but does not yield a visible phenotype in culture. This is coherent with sensory function that might not be needed in stable culture conditions, but could be required in natural conditions during development. In conclusion, this work adds new pieces to the puzzle of identifying molecular switches involved in developmental mRNA control and environmental sensing in trypanosome stages in the tsetse fly. / Trypanosoma brucei ist ein digenetischer, eukaryotischer Parasit, der zwischen Säugetier und Tsetsefliege alterniert, in welchen er unterschiedliche Gewebe besiedelt. Er ist die Ursache für die Schlafkrankheit in Afrika südlich der Sahara. Der Lebenszyklus der Trypanosomen besteht aus mehr als neun Parasitenstadien, die eindeutig anhand ihrer Morphologie, ihres Metabolismus und der Positionierung ihrer DNA Organellen unterschieden werden können. Trypanosomen bleiben ausschließlich extrazellulär und kommen im Laufe ihres Infektionszyklus mit sich verändernden Umwelteinflüssen in Berührung, z. B. Temperaturschwankungen, Variation in vorhandenen Energiequellen, erhöhte Viskosität usw. In Übereinstimmung mit der anerkannten sensorischen Funktion die Cilien in Vielzellern ausüben, wurde für diese Rolle das strukturverwandte Flagellum in Trypanosomen vorgeschlagen. Die Erkennung wechselnder Umweltparameter ist der vermutliche Auslöser für Differenzierungsprozesse, die ein Entwicklungsstadium hervorbringen, welches am besten an die neue Umgebung angepasst ist. Dies wird durch eine Modifizierung der Genexpression erreicht, die in Trypanosomen fast ausschließlich auf posttranskriptioneller Ebene erfolgt. Diese Arbeit zeigt, dass die RNA bindenden Proteine ALBA3 und ALBA4 an der Differenzierung von Trypanosomen in der Tsetsefliege beteiligt sind. Immunfluoreszenzanalyse und Lebendvideomikroskopie von Zellen, die eine an YFP gekoppelte Variante der Proteine enthalten, haben gezeigt, dass sich ALBA3/4 im Zytosol befinden und dass sie in jedem Parasitenstadium exprimiert sind, mit Ausnahme derer, die im Proventrikel der Tsetsefliege zu finden sind. Das Herunterregulieren der Proteine in vorangehenden Stadien, führt zu markanten Veränderungen, die mit denjenigen, die in Parasiten im Proventrikel zu finden sind, vergleichbar sind: z. B. Verlängerung der Zelle, Zellzyklusarrest und Lokalisierung des Zellkerns in eine posteriore Position. Im Gegenteil dazu findet die Umpositionierung des Zellkerns nicht statt, wenn ALBA3 während der Entwicklung des Parasiten in der Tsetsefliege überexprimiert wird. Ein vergleichbarer Effekt wird mit ALBA4 Überexpression nicht erreicht, welches die Entwicklung nicht negativ zu beeinflussen scheint. Wenn Trypanosomen Hungerstress ausgesetzt sind, reichern sich beide ALBA Proteine zusammen mit DHH1, einem anerkannten RNA bindenden Protein, in zytoplasmatischen Aggregaten an, die nur teilweise mit denjenigen kolokalisieren, die durch polyA+ RNA in diesen Bedingungen verursacht werden. Diese Arbeit zeigt, dass ALBA Proteine eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Trypanosomen spielen und legt nahe, dass sie an der entwicklungsbedingten Kontrolle eines Teils der mRNA Expression beteiligt sind. Der zweite Teil dieser Arbeit handelt von der Identifizierung neuer flagellarer Proteine, die eine sensorische Funktion haben könnten. Hierfür wurden mehrere Proteinkandidaten aus einer durchgeführten Proteomanalyse intakter Flagellen gewählt. Die vorliegende Arbeit bestätigt die flagellare Lokalisierung der Proteine mit großem Erfolg (85% der untersuchten Proteine) und zeigt, dass sie unterschiedliche Verteilungsmuster vorweisen. Zwei der Proteine werden während der Infektion des Parasiten in der Tsetsefliege untersucht, was aufdeckt, dass eines davon in den Stadien im Proventrikel herunterreguliert ist. Die Funktionsstudie eines neu identifizierten flagellaren Membranproteins weist seine schnelle Dynamik im Flagellum auf, führt jedoch zu keinem sichtbaren Phänotyp in Laborbedingungen. Diese Beobachtung passt zu der Annahme, dass Proteine mit sensorischer Funktion in stabilen Laborverhältnissen nicht essentiell sind aber eine wichtige Rolle während der Entwicklung des Parasiten in natürlichen Bedingungen spielen. Zusammenfassend fügt diese Arbeit Teile zum Puzzle der Identifizierung molekularer Schalter, die in Trypanosomenstadien in der Tsetsefliege an der mRNA Kontrolle und der Erkennung der Umwelt beteiligt sind.