Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive (TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité ou borderline (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN U133 d’Affymetrix a révélé que la SERPINA1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. La validation par Q-PCR nous a confirmé que cette antiprotéase est majoritairement surexprimée dans les tumeurs LMP, par rapport aux tumeurs bénignes (BOV) et aux tumeurs TOV. Nous avons donc surexprimé la SERPINA1 dans les lignées cellulaires invasives TOV 112D et TOV 1946 du cancer de l’ovaire et dérivé des clones stables. Les résultats obtenus nous indiquent que la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la capacité d’invasion et de migration cellulaire et non au niveau de la croissance cellulaire et la formation de structures tridimensionnelles. Les résultats issus de l’étude in vivo dans les souris SCID nous permettront de déterminer si la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la tumorigénèse ovarienne. Ainsi, la SERPINA1 demeure à notre avis un candidat d’intérêt pour tenter de mieux comprendre les différences biologiques entre les tumeurs LMP et TOV, ainsi que le rôle des protéases et de leurs inhibiteurs dans la progression tumorale du cancer de l’ovaire. / Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic cancer with a five-year survival rate of 30-40% in patients diagnosed with high-grade invasive disease (TOV). This is in stark contrast to the 95% five-year survival in patients diagnosed with low malignant potential (LMP) disease. It is therefore important to understand the biological differences between LMP and TOV. We have previously identified differential expression of SERPINA1 between serous LMP and TOV tumors through gene expression analysis using Affymetrix U133 DNA microarrays. Expression of this protease inhibitor in the majority of LMP tumors was confirmed and validated by Q-PCR. To study the effects of its overexpression on the invasive potential of ovarian cancer cell lines, SERPINA1 was cloned in the pcDNA3.1+ plasmid and stable clones were derived from two invasive ovarian cancer cell lines, TOV 112D and TOV 1946. Comparisons between clones and controls have shown no SERPINA1-dependent difference in cellular growth or spheroid formation. However, effects on cellular migration and invasion are observed in cells overexpressing SERPINA1. Results from an in vivo xenograft study in SCID mice will allow us to determine if SERPINA1 overexpression affects ovarian tumorigenesis. SERPINA1 remains an interesting candidate gene whose further characterization may lead to insights into its role, and the role of proteases and their inhibitors, in ovarian cancer disease progression.

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive(TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN HuFL d’Affymetrix a révélé que Cks1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. En effet, ce régulateur du cycle cellulaire est surexprimé dans les tumeurs TOV par rapport aux tumeurs LMP. Nous avons donc déplété Cks1 dans des lignées cellulaires tumorales invasives du cancer de l’ovaire dérivées au laboratoire, soit la TOV112D et la TOV1946, en utilisant des shRNAs sous le contrôle d’un répresseur inductible à la tétracycline. Puis, nous avons dérivé des clones stables inductibles à la tétracycline. Les résultats obtenus nous indiquent que la déplétion de Cks1 n’a pas d’effet sur la prolifération et la migration cellulaires, ni sur la formation de structures tridimensionnelles in vitro. Ainsi, nous pouvons conclure que Cks1 ne joue pas un rôle clé dans la progression tumorale par rapport aux paramètres testés. Or, des études supplémentaires seraient nécessaires pour expliquer les différences biologiques observées entre les deux types de tumeurs étudiées, et justifier cette variation observée de l’expression de Cks1. / Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic cancer with a five-year survival rate of only 30-40% in patients diagnosed with high-grade invasive disease (TOV). This contrasts with the 95% five-year survival in patients diagnosed with the low malignant potential (LMP)disease. Previously, we have identified differential expression of Cks1 between serous LMP and TOV tumors through gene expression analysis using Affymetrix HuFL DNA microarrays. Overexpression of this cell cycle regulator was observed in the TOV tumors, but not in the LMP samples. To study its role on the invasive potential of ovarian cancer cell lines, Cks1 was depleted in two tumoral invasive ovarian cancer cell lines established in our laboratory, TOV112D and TOV1946, using an inducible shRNA strategy. Then, tetracycline-inducible stable clones were derived and studied further. Comparisons between clones and controls have shown no Cks1-dependent effect on cellular growth, neither in migration capacity nor spheroid formation. Thus, we can conclude that Cks1 does not play a crucial role in the tested parameters for cancer progression, but further experiments could elucidate the biological differences observed between the two kinds of tumors studied.

Les carcinomes mammaires invasifs sont des tumeurs solides, au sein desquelles le fort pouvoir de prolifération des cellules cancéreuses entraîne la formation de zones hypoxiques. Les mécanismes cellulaires d’adaptation à la diminution des apports en oxygène sont principalement déterminés par des facteurs de transcription hétérodimériques induits par l’hypoxie (HIF-1 et HIF-2, hypoxia inducible factor). Le monomère alpha de ces complexes est déstabilisé en situation de normoxie. Les récepteurs aux facteurs de croissance épidermique (EGFR) peuvent également augmenter la traduction de l’ARNm codant ces monomères indépendamment de l’oxygène. La première partie de la thèse repose sur le développement de deux clones cellulaires fluorescents stables et inductibles par l’hypoxie, à partir d’une lignée de carcinome mammaire invasif triple négatif surexprimant le récepteur EGFR (MDA- MB-231). Le modèle CA9-GFP permet de restituer l’activité transcriptionnelle des complexes HIFs et le modèle GFP-P564 traduit la stabilité de leur sous-unité alpha. La fluorescence des deux modèles cellulaires est fortement induite en situation d’hypoxie (1% O2) et en présence d’agents mimétiques de l’hypoxie (cobalt, desferrioxamine et diméthyl-oxalyl glycine). Ces modèles ont ensuite été utilisés pour évaluer l’effet de trois thérapies anti-EGFR sur les voies de réponses à l’hypoxie. Le cétuximab et le lapatinib n’ont aucun effet sur la fluorescence des cellules alors que le géfitinib diminue l’intensité du signal en situation d’hypoxie. Ces différences sont associées à un impact similaire sur la migration et la viabilité cellulaire traduisant ainsi une sensibilité différentielle à ces trois composés anti-EGFR. La deuxième partie de la thèse s’est ensuite orientée vers la quantification par RT-qPCR de 45 gènes inductibles par l’hypoxie et impliqués dans le développement du cancer du sein sur une série rétrospective portant sur 32 exérèses de carcinomes mammaires invasifs précoces. Une analyse comparative des données a été effectuée en fonction des critères anatomo-pathologiques (stade, grade, statut en récepteur HER2, rechute). Une surexpression coordonnée de l’ensemble des gènes est observée dans les tumeurs de haut grade, HER2+ et pour les sujets ayant récidivé. La comparaison des groupes « rechute » versus « non rechute » a permis de sélectionner six marqueurs de référence s’exprimant de manière significative. Elle permet en outre la réalisation d’un algorithme basique de classement des individus en fonction du risque de récidive. Celui-ci a été validé par la construction de courbes de survie (méthode de Kaplan-Meier et test du Mantel-Haenszel). L’utilisation combinée des deux modèles cellulaires fluorescents permet l’identification et la caractérisation dynamique de molécules agissant directement ou indirectement sur les réponses cellulaires à l’hypoxie tumorale. L’analyse de l’expression de gènes connus pour leur profil agressif et régulés par le microenvironnement tumoral, constitue un outil clinique d’aide au pronostic des cancers du sein. / The invasive breast cancers are solid tumors, wherein the proliferation of cells causes the formation of hypoxic zones. Cellular adaptive responses to reduced oxygen concentrations are mainly determined by heterodimeric transcription factors induced by hypoxia (HIF-1 & HIF-2, Hypoxia Inducible Factors). The alpha subunits of HIF are rapidly degraded under normoxic conditions. HIF complexes are also regulated by activation of epidermal growth-factor receptor (EGFR) signaling pathways in an oxygen-independent manner. The first part of this work was to develop stable fluorescent clones for examining responses to hypoxia from a metastatic triple-negative breast cancer cell line overexpressing EGFR (MDA-MB-231). The Ca9-GFP and GFP-P564 cell models allow to assess HIF activity and alpha subunits stability, respectively. In both models, fluorescence signals were strongly increased with hypoxia-mimicking reagents (cobalt, desferrioxamine and dimethyl-oxalyl glycine) and under hypoxia (1% O2). The impact of three EGFR inhibitors on HIF activity and stability was assessed. Cetuximab and lapatinib did not affect the signal induced by hypoxia, whereas gefitinib sharply reduced its intensity in both models. The differential effect of these three EGFR-targeted therapies on hypoxia responses was correlated with a similar impact on viability and cell migration. The second part of this work focused on the relative quantification using qPCR analysis of 45 genes involved in hypoxia responses and in the development of breast cancer, from a retrospective series of 32 tumor samples from patients with early- stage invasive breast cancer. A comparative analysis was performed according to anatomo-pathological criteria (stage, grade, HER2 status, and relapse). A coordinated overexpression of all genes was observed in high-grade and HER2+ tumors and in the group of patients that relapsed. The comparison of gene expression between "relapse" and "no relapse" groups was used to identify six reference markers. It also allowed to develop a basic algorithm to classify patients according to the risk of relapse. This algorithm was validated by constructing survival curves (Kaplan-Meier method and Mantel-Haenszel test). Combined use of two fluorescent cell models allows identification and dynamic characterization of compounds able to directly or indirectly inhibit cellular responses to tumor hypoxia. Analysis of gene expression known for their aggressive character and regulated by the tumor microenvironment is a clinical tool for assessing breast cancer prognosis.

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive (TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité ou borderline (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN U133 d’Affymetrix a révélé que la SERPINA1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. La validation par Q-PCR nous a confirmé que cette antiprotéase est majoritairement surexprimée dans les tumeurs LMP, par rapport aux tumeurs bénignes (BOV) et aux tumeurs TOV. Nous avons donc surexprimé la SERPINA1 dans les lignées cellulaires invasives TOV 112D et TOV 1946 du cancer de l’ovaire et dérivé des clones stables. Les résultats obtenus nous indiquent que la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la capacité d’invasion et de migration cellulaire et non au niveau de la croissance cellulaire et la formation de structures tridimensionnelles. Les résultats issus de l’étude in vivo dans les souris SCID nous permettront de déterminer si la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la tumorigénèse ovarienne. Ainsi, la SERPINA1 demeure à notre avis un candidat d’intérêt pour tenter de mieux comprendre les différences biologiques entre les tumeurs LMP et TOV, ainsi que le rôle des protéases et de leurs inhibiteurs dans la progression tumorale du cancer de l’ovaire. / Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic cancer with a five-year survival rate of 30-40% in patients diagnosed with high-grade invasive disease (TOV). This is in stark contrast to the 95% five-year survival in patients diagnosed with low malignant potential (LMP) disease. It is therefore important to understand the biological differences between LMP and TOV. We have previously identified differential expression of SERPINA1 between serous LMP and TOV tumors through gene expression analysis using Affymetrix U133 DNA microarrays. Expression of this protease inhibitor in the majority of LMP tumors was confirmed and validated by Q-PCR. To study the effects of its overexpression on the invasive potential of ovarian cancer cell lines, SERPINA1 was cloned in the pcDNA3.1+ plasmid and stable clones were derived from two invasive ovarian cancer cell lines, TOV 112D and TOV 1946. Comparisons between clones and controls have shown no SERPINA1-dependent difference in cellular growth or spheroid formation. However, effects on cellular migration and invasion are observed in cells overexpressing SERPINA1. Results from an in vivo xenograft study in SCID mice will allow us to determine if SERPINA1 overexpression affects ovarian tumorigenesis. SERPINA1 remains an interesting candidate gene whose further characterization may lead to insights into its role, and the role of proteases and their inhibitors, in ovarian cancer disease progression.

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive(TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN HuFL d’Affymetrix a révélé que Cks1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. En effet, ce régulateur du cycle cellulaire est surexprimé dans les tumeurs TOV par rapport aux tumeurs LMP. Nous avons donc déplété Cks1 dans des lignées cellulaires tumorales invasives du cancer de l’ovaire dérivées au laboratoire, soit la TOV112D et la TOV1946, en utilisant des shRNAs sous le contrôle d’un répresseur inductible à la tétracycline. Puis, nous avons dérivé des clones stables inductibles à la tétracycline. Les résultats obtenus nous indiquent que la déplétion de Cks1 n’a pas d’effet sur la prolifération et la migration cellulaires, ni sur la formation de structures tridimensionnelles in vitro. Ainsi, nous pouvons conclure que Cks1 ne joue pas un rôle clé dans la progression tumorale par rapport aux paramètres testés. Or, des études supplémentaires seraient nécessaires pour expliquer les différences biologiques observées entre les deux types de tumeurs étudiées, et justifier cette variation observée de l’expression de Cks1. / Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic cancer with a five-year survival rate of only 30-40% in patients diagnosed with high-grade invasive disease (TOV). This contrasts with the 95% five-year survival in patients diagnosed with the low malignant potential (LMP)disease. Previously, we have identified differential expression of Cks1 between serous LMP and TOV tumors through gene expression analysis using Affymetrix HuFL DNA microarrays. Overexpression of this cell cycle regulator was observed in the TOV tumors, but not in the LMP samples. To study its role on the invasive potential of ovarian cancer cell lines, Cks1 was depleted in two tumoral invasive ovarian cancer cell lines established in our laboratory, TOV112D and TOV1946, using an inducible shRNA strategy. Then, tetracycline-inducible stable clones were derived and studied further. Comparisons between clones and controls have shown no Cks1-dependent effect on cellular growth, neither in migration capacity nor spheroid formation. Thus, we can conclude that Cks1 does not play a crucial role in the tested parameters for cancer progression, but further experiments could elucidate the biological differences observed between the two kinds of tumors studied.