A terapia antiangiogênica surgiu como uma alternativa promissora para o tratamento do câncer. No entanto, evidências recentes mostram que as células endoteliais isoladas diretamente de um tumor maligno são mais resistentes a diferentes drogas do que as células endoteliais presentes no mesmo tecido normal. Essas diferenças podem ser atribuídas em parte à adaptação das células endoteliais ao microambiente tumoral. Uma característica singular do microambiente tumoral é a consistente acidificação do meio extracelular, cujos efeitos nas células endoteliais não são conhecidos. Acidez extracelular pode alterar múltiplas funções biológicas, causar estresse do retículo endoplasmático (RE) e ativação da Unfolded Protein Response (UPR). Células endoteliais humanas primárias de derme (HDMEC) cultivadas em pH 6.4, ajustado tanto com ácido lático tanto com ácido clorídrico, apresentaram aumento da expressão de proteínas relacionadas à UPR, como GRP78, ATF4, elf2α fosforilada e aumento na clivagem do mRNA de XBP1. Nessas condições massiva morte celular ocorreu após 48 horas. Em contrapartida, quando as células endoteliais eram expostas à acidez crônica não-letal com pH 7.0 durante sete dias, essas foram capazes de se adaptar coincidentemente com um aumento da expressão da proteína GRP78 Após sete dias sob pH 7.0, as células HDMEC apresentaram maior resistência à morte celular quando tratadas com as drogas Etoposide, Adriamicina e Sunitinib em doses que variavam entre 0.0025μM a 100μM. O silenciamento do gene GRP78 com ShRNA reverteu esse fenótipo resistente. Para determinar os níveis de UPR in vivo utilizou-se captura por microdissecção à laser de células endoteliais em lâminas histológicas de 14 carcinomas espinocelulares bucais. Observou-se um aumento significativo dos níveis de mRNA de GRP78, ATF4 e CHOP em células endoteliais dos tumores quando comparadas a células endoteliais primárias (HDMEC). Além do mais, células endoteliais tumorais apresentaram intensa imunomarcação para GRP78 comparativamente a células endoteliais de mucosa bucal normal. A acidez, uma importante fonte de estresse no microambiente tumoral, pode ativar uma UPR adaptativa em células endoteliais. Aumento da expressão de GRP78 em células endoteliais é associado com maior resistência a drogas quimioterápicas. Os resultados sugerem que a resistência mediada pela UPR pode contribuir com o insucesso terapêutico na resposta a drogas antitumorais. / Antiangiogenic therapy has emerged as a promising alternative for cancer treatment. However, growing evidence has shown that endothelial cells isolated directly from malignant tumors are more resistant to different drugs than endothelial cells from normal tissues. These differences may due to the adaptation of endothelial cells to the tumor microenvironment. A unique feature of tumor microenvironment is the consistent acidification of the extracellular environment, whose effects on endothelial cells are not known. Extracellular acidity can alter multiple biological functions, including endoplasmic reticulum stress and activation of the Unfolded Protein Response (UPR). Primary human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) cultured at medium pH 6.4, adjusted with either lactic acid or either hydrochloric acid, showed strong up-regulation of the UPR-related proteins: GRP78, ATF4, phospho-elf2α and increased XBP1 mRNA splicing. However massive cell death occurred after 48 hours. In contrast, when endothelial cells were exposed to chronic nonlethal acidic stress at pH 7.0 for up to seven days, cells were able to adapt, coincidental with a marked increase in GRP78 protein expression. After 7 days at pH 7.0, HDMEC cells showed increased resistance to cell death when exposed to Etoposide, Adriamycin and Sunitinib at doses ranging from 0.0025μM to 100μM. Knockdown of GRP78 by shRNA reversed the resistance phenotype. To determine the levels of UPR in vivo, laser capture microdissection of endothelial cells from oral squamous cell carcinomas biopsies was done. There is a significant increase in mRNA levels of GRP78, ATF4 and CHOP on endothelial cells of tumors compared to untreated primary endothelial cells (HDMEC). Moreover, tumor 16 endothelial cells showed strong GRP78 immunostaining compared to endothelial cells from normal oral mucosa. Low pH, an important source of cellular stress in the tumor microenvironment, can activate an adaptive UPR response in endothelial cells. Increased expression of GRP78 in endothelial cells is associated with chemoresistance. The results suggest that UPR-mediated resistance may contribute to therapeutic failures in response to anticancer drugs.

A terapia antiangiogênica surgiu como uma alternativa promissora para o tratamento do câncer. No entanto, evidências recentes mostram que as células endoteliais isoladas diretamente de um tumor maligno são mais resistentes a diferentes drogas do que as células endoteliais presentes no mesmo tecido normal. Essas diferenças podem ser atribuídas em parte à adaptação das células endoteliais ao microambiente tumoral. Uma característica singular do microambiente tumoral é a consistente acidificação do meio extracelular, cujos efeitos nas células endoteliais não são conhecidos. Acidez extracelular pode alterar múltiplas funções biológicas, causar estresse do retículo endoplasmático (RE) e ativação da Unfolded Protein Response (UPR). Células endoteliais humanas primárias de derme (HDMEC) cultivadas em pH 6.4, ajustado tanto com ácido lático tanto com ácido clorídrico, apresentaram aumento da expressão de proteínas relacionadas à UPR, como GRP78, ATF4, elf2α fosforilada e aumento na clivagem do mRNA de XBP1. Nessas condições massiva morte celular ocorreu após 48 horas. Em contrapartida, quando as células endoteliais eram expostas à acidez crônica não-letal com pH 7.0 durante sete dias, essas foram capazes de se adaptar coincidentemente com um aumento da expressão da proteína GRP78 Após sete dias sob pH 7.0, as células HDMEC apresentaram maior resistência à morte celular quando tratadas com as drogas Etoposide, Adriamicina e Sunitinib em doses que variavam entre 0.0025μM a 100μM. O silenciamento do gene GRP78 com ShRNA reverteu esse fenótipo resistente. Para determinar os níveis de UPR in vivo utilizou-se captura por microdissecção à laser de células endoteliais em lâminas histológicas de 14 carcinomas espinocelulares bucais. Observou-se um aumento significativo dos níveis de mRNA de GRP78, ATF4 e CHOP em células endoteliais dos tumores quando comparadas a células endoteliais primárias (HDMEC). Além do mais, células endoteliais tumorais apresentaram intensa imunomarcação para GRP78 comparativamente a células endoteliais de mucosa bucal normal. A acidez, uma importante fonte de estresse no microambiente tumoral, pode ativar uma UPR adaptativa em células endoteliais. Aumento da expressão de GRP78 em células endoteliais é associado com maior resistência a drogas quimioterápicas. Os resultados sugerem que a resistência mediada pela UPR pode contribuir com o insucesso terapêutico na resposta a drogas antitumorais. / Antiangiogenic therapy has emerged as a promising alternative for cancer treatment. However, growing evidence has shown that endothelial cells isolated directly from malignant tumors are more resistant to different drugs than endothelial cells from normal tissues. These differences may due to the adaptation of endothelial cells to the tumor microenvironment. A unique feature of tumor microenvironment is the consistent acidification of the extracellular environment, whose effects on endothelial cells are not known. Extracellular acidity can alter multiple biological functions, including endoplasmic reticulum stress and activation of the Unfolded Protein Response (UPR). Primary human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) cultured at medium pH 6.4, adjusted with either lactic acid or either hydrochloric acid, showed strong up-regulation of the UPR-related proteins: GRP78, ATF4, phospho-elf2α and increased XBP1 mRNA splicing. However massive cell death occurred after 48 hours. In contrast, when endothelial cells were exposed to chronic nonlethal acidic stress at pH 7.0 for up to seven days, cells were able to adapt, coincidental with a marked increase in GRP78 protein expression. After 7 days at pH 7.0, HDMEC cells showed increased resistance to cell death when exposed to Etoposide, Adriamycin and Sunitinib at doses ranging from 0.0025μM to 100μM. Knockdown of GRP78 by shRNA reversed the resistance phenotype. To determine the levels of UPR in vivo, laser capture microdissection of endothelial cells from oral squamous cell carcinomas biopsies was done. There is a significant increase in mRNA levels of GRP78, ATF4 and CHOP on endothelial cells of tumors compared to untreated primary endothelial cells (HDMEC). Moreover, tumor 16 endothelial cells showed strong GRP78 immunostaining compared to endothelial cells from normal oral mucosa. Low pH, an important source of cellular stress in the tumor microenvironment, can activate an adaptive UPR response in endothelial cells. Increased expression of GRP78 in endothelial cells is associated with chemoresistance. The results suggest that UPR-mediated resistance may contribute to therapeutic failures in response to anticancer drugs.

A terapia antiangiogênica surgiu como uma alternativa promissora para o tratamento do câncer. No entanto, evidências recentes mostram que as células endoteliais isoladas diretamente de um tumor maligno são mais resistentes a diferentes drogas do que as células endoteliais presentes no mesmo tecido normal. Essas diferenças podem ser atribuídas em parte à adaptação das células endoteliais ao microambiente tumoral. Uma característica singular do microambiente tumoral é a consistente acidificação do meio extracelular, cujos efeitos nas células endoteliais não são conhecidos. Acidez extracelular pode alterar múltiplas funções biológicas, causar estresse do retículo endoplasmático (RE) e ativação da Unfolded Protein Response (UPR). Células endoteliais humanas primárias de derme (HDMEC) cultivadas em pH 6.4, ajustado tanto com ácido lático tanto com ácido clorídrico, apresentaram aumento da expressão de proteínas relacionadas à UPR, como GRP78, ATF4, elf2α fosforilada e aumento na clivagem do mRNA de XBP1. Nessas condições massiva morte celular ocorreu após 48 horas. Em contrapartida, quando as células endoteliais eram expostas à acidez crônica não-letal com pH 7.0 durante sete dias, essas foram capazes de se adaptar coincidentemente com um aumento da expressão da proteína GRP78 Após sete dias sob pH 7.0, as células HDMEC apresentaram maior resistência à morte celular quando tratadas com as drogas Etoposide, Adriamicina e Sunitinib em doses que variavam entre 0.0025μM a 100μM. O silenciamento do gene GRP78 com ShRNA reverteu esse fenótipo resistente. Para determinar os níveis de UPR in vivo utilizou-se captura por microdissecção à laser de células endoteliais em lâminas histológicas de 14 carcinomas espinocelulares bucais. Observou-se um aumento significativo dos níveis de mRNA de GRP78, ATF4 e CHOP em células endoteliais dos tumores quando comparadas a células endoteliais primárias (HDMEC). Além do mais, células endoteliais tumorais apresentaram intensa imunomarcação para GRP78 comparativamente a células endoteliais de mucosa bucal normal. A acidez, uma importante fonte de estresse no microambiente tumoral, pode ativar uma UPR adaptativa em células endoteliais. Aumento da expressão de GRP78 em células endoteliais é associado com maior resistência a drogas quimioterápicas. Os resultados sugerem que a resistência mediada pela UPR pode contribuir com o insucesso terapêutico na resposta a drogas antitumorais. / Antiangiogenic therapy has emerged as a promising alternative for cancer treatment. However, growing evidence has shown that endothelial cells isolated directly from malignant tumors are more resistant to different drugs than endothelial cells from normal tissues. These differences may due to the adaptation of endothelial cells to the tumor microenvironment. A unique feature of tumor microenvironment is the consistent acidification of the extracellular environment, whose effects on endothelial cells are not known. Extracellular acidity can alter multiple biological functions, including endoplasmic reticulum stress and activation of the Unfolded Protein Response (UPR). Primary human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) cultured at medium pH 6.4, adjusted with either lactic acid or either hydrochloric acid, showed strong up-regulation of the UPR-related proteins: GRP78, ATF4, phospho-elf2α and increased XBP1 mRNA splicing. However massive cell death occurred after 48 hours. In contrast, when endothelial cells were exposed to chronic nonlethal acidic stress at pH 7.0 for up to seven days, cells were able to adapt, coincidental with a marked increase in GRP78 protein expression. After 7 days at pH 7.0, HDMEC cells showed increased resistance to cell death when exposed to Etoposide, Adriamycin and Sunitinib at doses ranging from 0.0025μM to 100μM. Knockdown of GRP78 by shRNA reversed the resistance phenotype. To determine the levels of UPR in vivo, laser capture microdissection of endothelial cells from oral squamous cell carcinomas biopsies was done. There is a significant increase in mRNA levels of GRP78, ATF4 and CHOP on endothelial cells of tumors compared to untreated primary endothelial cells (HDMEC). Moreover, tumor 16 endothelial cells showed strong GRP78 immunostaining compared to endothelial cells from normal oral mucosa. Low pH, an important source of cellular stress in the tumor microenvironment, can activate an adaptive UPR response in endothelial cells. Increased expression of GRP78 in endothelial cells is associated with chemoresistance. The results suggest that UPR-mediated resistance may contribute to therapeutic failures in response to anticancer drugs.

Les glioblastomes sont des tumeurs primaires du cerveau les plus malignes. L’identification des cellules souches cancéreuses de glioblastome (CSGs) a transformé notre vision globale des glioblastomes en révélant une hiérarchie cellulaire au sein de ces tumeurs. Les CSGs sont douées de propriétés d’auto-renouvellement, de différenciation et peuvent entrer en quiescence. Elles sont considérées comme les cellules entretenant les tumeurs, responsables de leur dissémination et des rechutes après traitement. La découverte des CSGs a conduit à un changement de paradigme dans le développement des thérapies anticancéreuses, avec la nécessité de cibler dans le traitement non seulement les cellules de la masse tumorale, mais aussi les CSGs. Un criblage différentiel de la chimiothèque Prestwick réalisé au laboratoire a permis d’identifier le bisacodyl comme une molécule présentant une cytotoxicité spécifique sur les CSGs en quiescence.Cette thèse présente un travail sur la caractérisation des CSGs, la compréhension du mode d’action du bisacodyl, ainsi que l’évaluation de son potentiel thérapeutique sur un modèle 3D in intro et des modèles in vivo. / Glioblastomas are the most malignant primary brain tumors. The identification of glioblastoma stemcells (GSCs) has transformed our comprehension of those tumors by revealing a hierarchical organization. GSCs can self-renew, differentiate and enter into a quiescent state. They are considered as cells which fuel and as the main culprits of tumor relapse. The discovery of GSCs triggered a change in paradigm for cancer therapy. Indeed to gain in efficacy, therapies need to target, not only the cells forming the bulk of the tumor, but also GSCs particularly resistant and endowed with a high tumorigenic potential. Chemical screening of the Prestwick chemical library in our laboratory, unveiled bisacodyl with a specific activity on quiescent GSCs.This thesis presents work on the characterization of GSCs, study of the mode of action of bisacodyl on GSCs, as well as a preclinical evaluation of bisacodyl on a 3D model in vitro and animal models in vivo.