Introdução: Tumores adrenocorticais (TAC) são raros, correspondendo somente a 0,2% de todas as neoplasias pediátricas, sendo que a maioria dos casos são diagnosticados no Brasil e estão associados com a mutação TP53 p.R337H. A cirurgia é o único tratamento efetivo conhecido para os TAC, sendo os tumores em estadios avançados frequentemente fatais. A família das Aurora-quinases é formada por três membros (Aurora-A, -B e -C) os quais atuam em diversas fases do ciclo celular, como alinhamento dos cromossomos, formação do fuso mitótico e citocinese. Diferentes trabalhos mostraram a expressão alterada de membros desta família em vários tipos de tumores e a inibição da atividade destas proteínas tem sido considerada uma potencial abordagem para o tratamento do câncer. Objetivo: A partir da análise da expressão dos genes Aurora-A e Aurora-B em amostras de TAC pediátrico, foram investigados os efeitos do AMG 900, um pan-inibidor de aurora quinases, na proliferação, apoptose, síntese hormonal e perfil transcricional da linhagem H295A. Além disso, foram avaliados os efeitos do AMG 900 combinado com diferentes quimioterápicos. Metodologia: Os níveis de expressão dos genes Aurora-A e Aurora-B foram analisados em 60 crianças com TAC através das técnicas de RT-qPCR e imuno-histoquímica. A proliferação celular foi avaliada por coloração com Giemsa e a apoptose foi realizada por citometria de fluxo. A análise de combinação de drogas foi feita com base no método de Chou-Talalay e o ensaio de microarray foi realizado utilizando a plataforma da Agilent. Resultados: A expressão dos genes Aurora-A e Aurora-B foi associada com estadios avançados da doença e a expressão do Aurora-A foi associada com a presença da mutação TP53 p.R337H. O tratamento com o AMG900 causou a inibição da proliferação, aumento da apoptose e sensibilizou as células para os inibidores de topoisomerase II (doxorrubicina e etoposídeo). Adicionalmente, o AMG 900 levou à redução da síntese de hormônios bem como modulou a expressão de genes envolvidos com esta atividade. A inibição das aurora-quinases alterou a expressão de genes associados com a regulação da fase G1 do ciclo celular e afetou a expressão de genes da via de sinalização Notch. Conclusão: A inibição das aurora-quinases pelo AMG 900 pode ser uma alternativa para o tratamento dos tumores adrenocorticais. / Introduction: Pediatric adrenocortical tumors (ACT) are rare malignancies representing only 0.2 % of all pediatric cancers. Most cases are diagnosed in Brazil and are associated with TP53 p.R337H mutation. Surgery is the only effective treatment known for the ACT however this approach has a small impact on survival in advanced disease. The Aurora kinase family is comprised of three members (Aurora-A, -B and -C) which act at different phases of the cell cycle, such as chromosomes alignment, mitotic spindle formation and cytokinesis. Several studies have demonstrated altered expression of members of this family in various types of tumors and the functional inhibition of the aurora kinases have been considered as a potential approach to cancer treatment. Aim: On the basis of analysis of Aurora-A and Aurora-B gene expression in the samples from pediatric ACT, we investigated the effects of AMG 900, a pan-aurora kinase inhibitor, on proliferation, apoptosis rate, hormone synthesis and transcriptional profile of H295A cell line. Furthermore, we evaluated the effects of AMG 900 combined with different chemotherapeutic agents. Methods: The mRNA expression levels of Aurora-A and Aurora-B genes were analyzed in 60 children with ACT by RT-qPCR and immunohistochemistry. Cell proliferation was assessed by Giemsa staining and apoptosis was performed by flow cytometry. Drug combination analysis was made on the basis of Chou- Talalay method. Microarray experiments were carried out using the Agilent human microarray. Results: Aurora-A and Aurora-B overexpression was associated with advanced disease. Patients carrying the TP53 p.R337H mutation presented significantly higher expression values of Aurora-A. Treatment with AMG900 caused inhibition of proliferation, increased apoptosis and sensitized the cells to topoisomerase II inhibitors (doxorubicin and etoposide). Additionally, the AMG 900 led to decreased synthesis of hormones and modulated the expression of genes involved in this activity. Finally, Aurora kinases inhibition altered the expression of genes associated with G1 cell cycle phase regulation and affected the Notch signaling pathway target genes. Conclusion: These data suggest that Aurora kinase inhibition by AMG900 may be a new therapeutic approach to adrenocortical carcinoma treatment.

Introdução: Tumores adrenocorticais (TAC) são raros, correspondendo somente a 0,2% de todas as neoplasias pediátricas, sendo que a maioria dos casos são diagnosticados no Brasil e estão associados com a mutação TP53 p.R337H. A cirurgia é o único tratamento efetivo conhecido para os TAC, sendo os tumores em estadios avançados frequentemente fatais. A família das Aurora-quinases é formada por três membros (Aurora-A, -B e -C) os quais atuam em diversas fases do ciclo celular, como alinhamento dos cromossomos, formação do fuso mitótico e citocinese. Diferentes trabalhos mostraram a expressão alterada de membros desta família em vários tipos de tumores e a inibição da atividade destas proteínas tem sido considerada uma potencial abordagem para o tratamento do câncer. Objetivo: A partir da análise da expressão dos genes Aurora-A e Aurora-B em amostras de TAC pediátrico, foram investigados os efeitos do AMG 900, um pan-inibidor de aurora quinases, na proliferação, apoptose, síntese hormonal e perfil transcricional da linhagem H295A. Além disso, foram avaliados os efeitos do AMG 900 combinado com diferentes quimioterápicos. Metodologia: Os níveis de expressão dos genes Aurora-A e Aurora-B foram analisados em 60 crianças com TAC através das técnicas de RT-qPCR e imuno-histoquímica. A proliferação celular foi avaliada por coloração com Giemsa e a apoptose foi realizada por citometria de fluxo. A análise de combinação de drogas foi feita com base no método de Chou-Talalay e o ensaio de microarray foi realizado utilizando a plataforma da Agilent. Resultados: A expressão dos genes Aurora-A e Aurora-B foi associada com estadios avançados da doença e a expressão do Aurora-A foi associada com a presença da mutação TP53 p.R337H. O tratamento com o AMG900 causou a inibição da proliferação, aumento da apoptose e sensibilizou as células para os inibidores de topoisomerase II (doxorrubicina e etoposídeo). Adicionalmente, o AMG 900 levou à redução da síntese de hormônios bem como modulou a expressão de genes envolvidos com esta atividade. A inibição das aurora-quinases alterou a expressão de genes associados com a regulação da fase G1 do ciclo celular e afetou a expressão de genes da via de sinalização Notch. Conclusão: A inibição das aurora-quinases pelo AMG 900 pode ser uma alternativa para o tratamento dos tumores adrenocorticais. / Introduction: Pediatric adrenocortical tumors (ACT) are rare malignancies representing only 0.2 % of all pediatric cancers. Most cases are diagnosed in Brazil and are associated with TP53 p.R337H mutation. Surgery is the only effective treatment known for the ACT however this approach has a small impact on survival in advanced disease. The Aurora kinase family is comprised of three members (Aurora-A, -B and -C) which act at different phases of the cell cycle, such as chromosomes alignment, mitotic spindle formation and cytokinesis. Several studies have demonstrated altered expression of members of this family in various types of tumors and the functional inhibition of the aurora kinases have been considered as a potential approach to cancer treatment. Aim: On the basis of analysis of Aurora-A and Aurora-B gene expression in the samples from pediatric ACT, we investigated the effects of AMG 900, a pan-aurora kinase inhibitor, on proliferation, apoptosis rate, hormone synthesis and transcriptional profile of H295A cell line. Furthermore, we evaluated the effects of AMG 900 combined with different chemotherapeutic agents. Methods: The mRNA expression levels of Aurora-A and Aurora-B genes were analyzed in 60 children with ACT by RT-qPCR and immunohistochemistry. Cell proliferation was assessed by Giemsa staining and apoptosis was performed by flow cytometry. Drug combination analysis was made on the basis of Chou- Talalay method. Microarray experiments were carried out using the Agilent human microarray. Results: Aurora-A and Aurora-B overexpression was associated with advanced disease. Patients carrying the TP53 p.R337H mutation presented significantly higher expression values of Aurora-A. Treatment with AMG900 caused inhibition of proliferation, increased apoptosis and sensitized the cells to topoisomerase II inhibitors (doxorubicin and etoposide). Additionally, the AMG 900 led to decreased synthesis of hormones and modulated the expression of genes involved in this activity. Finally, Aurora kinases inhibition altered the expression of genes associated with G1 cell cycle phase regulation and affected the Notch signaling pathway target genes. Conclusion: These data suggest that Aurora kinase inhibition by AMG900 may be a new therapeutic approach to adrenocortical carcinoma treatment.

As massas adrenocorticais são majoritariamente (70-80%) adenomas adrenocorticais (ACA). Os carcinomas adrenocorticais (ACC) são mais raros e de prognóstico restrito, com incidência de 1-2 casos por milhão, com alta taxa de reincidência (70-80%). Apesar dos tumores adrenocorticais (ACT) serem raros, no Brasil a incidência desses tumores em crianças é cerca de 10 vezes superior ao do restante do mundo, devido a uma mutação do gene TP53. Atualmente, o diagnóstico de massas adrenocorticais é realizado através dos critérios de Weiss, que possuem limitações, e por isso é intensa a busca de novos marcadores moleculares que facilite o diagnóstico de ACTs. POD-1/ TCF21 é um fator de transcrição do tipo helix-loop-helix básica (bHLH) expresso nos sítios de interação mesênquima-epitélio durante o desenvolvimento embrionário. Em ACTs, POD-1 regula a expressão endógena de SF-1 através da ligação na sequencia E-box da região promotora de SF-1, e nesses tumores parece estar relacionado negativamente com genes reguladores do ciclo celular, como BUB1B. BUB1B é um gene que codifica uma quinase com funções importantes durante o checkpoint mitótico. A expressão de BUB1B é considerada fator de prognóstico em diferentes tipos de tumores, inclusive em ACTs humanos, nos quais a expressão combinada de BUB1B e PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) mostrou-se um bom marcador de sobrevida em pacientes com ACC. PINK1, quinase 1 induzida por PTEN, é regulada principalmente pela mitocôndria, e em ACTs sua expressão está reduzida em ACC mais agressivos. Temos como hipótese que a expressão de POD-1 pode ter valor diferencial no diagnóstico de massas adrenocorticais, e que a análise da expressão combinada de POD-1, BUB1B e PINK1 pode ter valor diferencial para prognóstico de pacientes com ACT. Nesse trabalho foram analisados, por reação de qPCR com sondas Taqman, o cDNA obtido de 130 amostras de tumores: 79 adultos (44 ACAs e 35 ACCs), 35 crianças com menos de 5 anos de idade (27 ACAs e 8 ACCs) e 16 crianças de 5 a 18 anos de idade (6 ACAs e 10 ACCs). Nossos resultados mostram que POD-1 e BUB1B tem valor diferencial em ACT adulto e que a expressão combinada de POD-1 e BUB1B pode ser um marcador de prognóstico em pacientes com carcinoma adulto. Enquanto que, a expressão combinada de POD-1 e SF-1 pode ter valor de diagnóstico em pacientes pediátricos com menos de 5 anos. Em resumo, concluímos que estudos experimentais devem ser realizados para comprovar a relação entre os genes estudados, para que os resultados sejam sólidos o suficiente para serem utilizados no diagnóstico e prognóstico dos tumores adrenocorticais. / The adrenocortical masses are mostly (70-80%) adrenocortical adenomas (ACA). Adrenocortical carcinomas (ACC) are scarce and have limited prognosis, with an incidence of 1-2 cases per million and high recurrence rate (70-80%). Despite adrenocortical tumors (ACT) are rare in Brazil the incidence of these tumors in children is about 10 times higher than the rest of the world, due to a mutation of the TP53 gene. Currently, the diagnosis of adrenocortical mass is carried through Weiss criteria that have limitations, so it is intensive the search for new molecular markers that facilitate the diagnostic of ACTs. TCF21/POD-1 is a transcription factor helix-loop-helix type expressed in mesenchymal-epithelial sites of interaction during embryonic development. In ACTs, POD-1 regulates the expression of endogenous SF-1 through binding the E-box sequence of SF-1 promoter region, and seems to be negatively relates with cell cycle regulatory genes such as BUB1B. BUB1B is a gene encoding a kinase-with important function during mitotic checkpoint. The expression of BUB1B is considered a prognostic factor in different types of tumors, including ACTs. Combined expression of BUB1B and PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) has been shown to be a good marker of survival in adults with ACC, whereas the PINK1 expression is reduced in the most aggressive ACC. We hypothesized that the POD-1 expression may have differential value in the diagnosis of adrenocortical masses, and that the analysis of the combined expression of POD-1, BUB1B and PINK1 may have differential value for the prognosis of patients with ACT. In this work were analyzed by PCRq Taqman probes the cDNA obtained from 130 tumor samples: 79 adults (44 ACAs and 35 ACCs), 35 children under 5 years old (27 ACAs and 8 ACCs) and 16 children 5-18 years of age (6 ACAs and 10 ACCs). Our results show that POD-1 and BUB1B has differential value in adult ACT, and the combined expression of POD-1 and BUB1B may have a prognostic value in patients with adult carcinoma. In addition, the combined expression of POD-1 and SF-1 might have diagnostic value in pediatric patients younger than 5 years. In summary, we conclude that experimental studies should be conducted to confirm the relationship between the genes studied, so that the results are solid enough to be used in the diagnosis and prognosis of adrenocortical tumors.

As massas adrenocorticais são majoritariamente (70-80%) adenomas adrenocorticais (ACA). Os carcinomas adrenocorticais (ACC) são mais raros e de prognóstico restrito, com incidência de 1-2 casos por milhão, com alta taxa de reincidência (70-80%). Apesar dos tumores adrenocorticais (ACT) serem raros, no Brasil a incidência desses tumores em crianças é cerca de 10 vezes superior ao do restante do mundo, devido a uma mutação do gene TP53. Atualmente, o diagnóstico de massas adrenocorticais é realizado através dos critérios de Weiss, que possuem limitações, e por isso é intensa a busca de novos marcadores moleculares que facilite o diagnóstico de ACTs. POD-1/ TCF21 é um fator de transcrição do tipo helix-loop-helix básica (bHLH) expresso nos sítios de interação mesênquima-epitélio durante o desenvolvimento embrionário. Em ACTs, POD-1 regula a expressão endógena de SF-1 através da ligação na sequencia E-box da região promotora de SF-1, e nesses tumores parece estar relacionado negativamente com genes reguladores do ciclo celular, como BUB1B. BUB1B é um gene que codifica uma quinase com funções importantes durante o checkpoint mitótico. A expressão de BUB1B é considerada fator de prognóstico em diferentes tipos de tumores, inclusive em ACTs humanos, nos quais a expressão combinada de BUB1B e PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) mostrou-se um bom marcador de sobrevida em pacientes com ACC. PINK1, quinase 1 induzida por PTEN, é regulada principalmente pela mitocôndria, e em ACTs sua expressão está reduzida em ACC mais agressivos. Temos como hipótese que a expressão de POD-1 pode ter valor diferencial no diagnóstico de massas adrenocorticais, e que a análise da expressão combinada de POD-1, BUB1B e PINK1 pode ter valor diferencial para prognóstico de pacientes com ACT. Nesse trabalho foram analisados, por reação de qPCR com sondas Taqman, o cDNA obtido de 130 amostras de tumores: 79 adultos (44 ACAs e 35 ACCs), 35 crianças com menos de 5 anos de idade (27 ACAs e 8 ACCs) e 16 crianças de 5 a 18 anos de idade (6 ACAs e 10 ACCs). Nossos resultados mostram que POD-1 e BUB1B tem valor diferencial em ACT adulto e que a expressão combinada de POD-1 e BUB1B pode ser um marcador de prognóstico em pacientes com carcinoma adulto. Enquanto que, a expressão combinada de POD-1 e SF-1 pode ter valor de diagnóstico em pacientes pediátricos com menos de 5 anos. Em resumo, concluímos que estudos experimentais devem ser realizados para comprovar a relação entre os genes estudados, para que os resultados sejam sólidos o suficiente para serem utilizados no diagnóstico e prognóstico dos tumores adrenocorticais. / The adrenocortical masses are mostly (70-80%) adrenocortical adenomas (ACA). Adrenocortical carcinomas (ACC) are scarce and have limited prognosis, with an incidence of 1-2 cases per million and high recurrence rate (70-80%). Despite adrenocortical tumors (ACT) are rare in Brazil the incidence of these tumors in children is about 10 times higher than the rest of the world, due to a mutation of the TP53 gene. Currently, the diagnosis of adrenocortical mass is carried through Weiss criteria that have limitations, so it is intensive the search for new molecular markers that facilitate the diagnostic of ACTs. TCF21/POD-1 is a transcription factor helix-loop-helix type expressed in mesenchymal-epithelial sites of interaction during embryonic development. In ACTs, POD-1 regulates the expression of endogenous SF-1 through binding the E-box sequence of SF-1 promoter region, and seems to be negatively relates with cell cycle regulatory genes such as BUB1B. BUB1B is a gene encoding a kinase-with important function during mitotic checkpoint. The expression of BUB1B is considered a prognostic factor in different types of tumors, including ACTs. Combined expression of BUB1B and PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) has been shown to be a good marker of survival in adults with ACC, whereas the PINK1 expression is reduced in the most aggressive ACC. We hypothesized that the POD-1 expression may have differential value in the diagnosis of adrenocortical masses, and that the analysis of the combined expression of POD-1, BUB1B and PINK1 may have differential value for the prognosis of patients with ACT. In this work were analyzed by PCRq Taqman probes the cDNA obtained from 130 tumor samples: 79 adults (44 ACAs and 35 ACCs), 35 children under 5 years old (27 ACAs and 8 ACCs) and 16 children 5-18 years of age (6 ACAs and 10 ACCs). Our results show that POD-1 and BUB1B has differential value in adult ACT, and the combined expression of POD-1 and BUB1B may have a prognostic value in patients with adult carcinoma. In addition, the combined expression of POD-1 and SF-1 might have diagnostic value in pediatric patients younger than 5 years. In summary, we conclude that experimental studies should be conducted to confirm the relationship between the genes studied, so that the results are solid enough to be used in the diagnosis and prognosis of adrenocortical tumors.

O Adenoma adrenocortical é frequente em adultos, já o carcinoma é raro e agressivo. Mesmo com critérios padronizados, ainda há dificuldade para diferenciar esses tumores, sendo necessário o estudo de marcadores eficientes na detecção e diferenciação. Por serem raros e com diversas manifestações clínicas, culturas in vitro pode ser uma ferramenta para o estudo de processos que envolvem a doença. Foi realizada a caracterização molecular e funcional de culturas de células de tumores de pacientes. Resultados de PCR Array não mostraram um padrão que diferenciasse as culturas em função dos diagnósticos. Desta análise, 7 oncogenes apresentaram maior expressão e 9 supressores de tumor apresentaram baixa expressão nas culturas. WWOX, FHIT e TP73 foram validados por qPCR e a sugestiva interação entre esses fatores nos tumores adrenocorticais merecem futuras investigações. O potencial funcional das culturas T83-ACC, T36-REC e T7-ACA(P) foram evidenciados, e mostraram que podem ser bons modelos para estudo da ação de hormônios e seus mecanismos. / The adrenocortical adenoma is common in adults, since carcinoma is rare and aggressive. Even with standardized scores, it is still difficult to differentiate these tumors, the study of efficient markers in the detection and differentiation is necessary. Because they are rare and diverse clinical manifestations in vitro cultures can be a tool for the study of disease processes that involve. Molecular and functional characterization of cultured tumor cells of patients was conducted. PCR Array results did not show a pattern that differentiates cultures on the basis of diagnoses. This analysis showed higher expression 7 oncogenes and tumor suppressors 9 showed low expression in cultures. WWOX, FHIT and TP73 were validated by qPCR and suggestive interaction between these factors in adrenocortical tumors deserve further investigation. The functional potential of T83-ACC, T36-REC and T7-ACA(P) cell cultures were found, and shown confirm that they can be good models for studying the action of hormones and their mechanisms.

O Adenoma adrenocortical é frequente em adultos, já o carcinoma é raro e agressivo. Mesmo com critérios padronizados, ainda há dificuldade para diferenciar esses tumores, sendo necessário o estudo de marcadores eficientes na detecção e diferenciação. Por serem raros e com diversas manifestações clínicas, culturas in vitro pode ser uma ferramenta para o estudo de processos que envolvem a doença. Foi realizada a caracterização molecular e funcional de culturas de células de tumores de pacientes. Resultados de PCR Array não mostraram um padrão que diferenciasse as culturas em função dos diagnósticos. Desta análise, 7 oncogenes apresentaram maior expressão e 9 supressores de tumor apresentaram baixa expressão nas culturas. WWOX, FHIT e TP73 foram validados por qPCR e a sugestiva interação entre esses fatores nos tumores adrenocorticais merecem futuras investigações. O potencial funcional das culturas T83-ACC, T36-REC e T7-ACA(P) foram evidenciados, e mostraram que podem ser bons modelos para estudo da ação de hormônios e seus mecanismos. / The adrenocortical adenoma is common in adults, since carcinoma is rare and aggressive. Even with standardized scores, it is still difficult to differentiate these tumors, the study of efficient markers in the detection and differentiation is necessary. Because they are rare and diverse clinical manifestations in vitro cultures can be a tool for the study of disease processes that involve. Molecular and functional characterization of cultured tumor cells of patients was conducted. PCR Array results did not show a pattern that differentiates cultures on the basis of diagnoses. This analysis showed higher expression 7 oncogenes and tumor suppressors 9 showed low expression in cultures. WWOX, FHIT and TP73 were validated by qPCR and suggestive interaction between these factors in adrenocortical tumors deserve further investigation. The functional potential of T83-ACC, T36-REC and T7-ACA(P) cell cultures were found, and shown confirm that they can be good models for studying the action of hormones and their mechanisms.