O preá (Galea spixii),é um roedor da família Caviidae que vive na Caatinga do Nordeste brasileiro e vêm sendo criados em cativeiro, para sua utilização como fonte alternativa de alimento, preservação da espécie e utilização como modelo biológico em pesquisas. Poucos trabalhos são focados no estudo detalhado da morfologia dos diferentes tipos celulares e expressão enzimática em cada uma das zonas do córtex adrenal, sobretudo em espécies de mamíferos silvestres. As glândulas adrenais fetais de 20 dias de gestação apresentaram córtex indiferenciado. O início de formação da zona fasciculada foi observado nos fetos de 25 dias de gestação e a zona reticulada surgiu nos fetos aos 40 dias de gestação. As zonas descritas anteriormente persistiram nos fetos aos 50 dias de gestação, nos animais de 15 e 30 dias pós-natais e nos animais púberes. A expressão das enzimas citocromo P450c17 e da citocromo b5 nas zonas glomerular, fasciculada e reticulada de embriões e fetos de preás não estão somente relacionadas à produção, respectivamente, de mineralocorticoides, glicocorticoides e esteroides sexuais, pois a citocromo b5 é responsável pela diferenciação cortical em diferentes fases de desenvolvimento da adrenal e a imunoexpressão da citocromo P450c17 na fase final da gestação estão relacionadas com o processo de maturação da glândula adrenal e podem estar relacionadas coma síntese de esteroides sexuais devido a proximidade da puberdade. A imunomarcação da enzima citocromo b5 nas células cromafins das medulas das adrenais de 50 dias de gestação e adulta, podem estar relacionadas à síntese de adrenalina e noradrenalina devido a fatores de estresse. O aumento da duração da gestação para 50 dias ou mais, pode estar relacionado com deficiências na síntese de cortisol/corticosterona pelas enzimas esteroidogênicas / The Spixs yellow-toothed cavy (Galea spixii), is a Caviidae family rodent living in the Brazilian Northeast Caatinga and have been bred in captivity for use as an alternative food source, species preservation and use as animal model research. Few studies are focused on a detailed study of the morphology and ultrastructure of different cell types and expression of enzyme in each of the zones of the adrenal cortex, particularly in wild mammalian species. The fetal adrenal glands 20 days of gestation showed undifferentiated cortex. The early formation of the zona fasciculata was observed in fetuses of 25 days of pregnancy and the reticulated area emerged in fetuses at 40 days of gestation. The areas described above persisted in fetuses at 50 days of gestation, animals at 15 and 30 postnatal days and pubertal animals. The expression of P450c17 enzyme cytochrome b5 and cytochrome in glomerular areas fasciculata and guinea pigs crosslinked embryos and fetuses are not only related to production, respectively, mineralocorticoids and glucocorticoids, sex steroids, as the cytochrome b5 is responsible for cortical differentiation different stages of development and adrenal cytochrome P450c17 immunoreactivity of the final stage of pregnancy are associated with the adrenal gland maturation process and may be associated with the synthesis of sex steroids due to the proximity of puberty. The immunostaining of the enzyme cytochrome b5 in the chromaffin cells of the adrenal marrow 50 days of gestation and adult, may be related to the synthesis of adrenaline and noradrenaline due to stress factors. The increased length of gestation for 50 days or more, may be related to impaired cortisol synthesis / corticosterone by steroidogenic enzymes

O preá (Galea spixii),é um roedor da família Caviidae que vive na Caatinga do Nordeste brasileiro e vêm sendo criados em cativeiro, para sua utilização como fonte alternativa de alimento, preservação da espécie e utilização como modelo biológico em pesquisas. Poucos trabalhos são focados no estudo detalhado da morfologia dos diferentes tipos celulares e expressão enzimática em cada uma das zonas do córtex adrenal, sobretudo em espécies de mamíferos silvestres. As glândulas adrenais fetais de 20 dias de gestação apresentaram córtex indiferenciado. O início de formação da zona fasciculada foi observado nos fetos de 25 dias de gestação e a zona reticulada surgiu nos fetos aos 40 dias de gestação. As zonas descritas anteriormente persistiram nos fetos aos 50 dias de gestação, nos animais de 15 e 30 dias pós-natais e nos animais púberes. A expressão das enzimas citocromo P450c17 e da citocromo b5 nas zonas glomerular, fasciculada e reticulada de embriões e fetos de preás não estão somente relacionadas à produção, respectivamente, de mineralocorticoides, glicocorticoides e esteroides sexuais, pois a citocromo b5 é responsável pela diferenciação cortical em diferentes fases de desenvolvimento da adrenal e a imunoexpressão da citocromo P450c17 na fase final da gestação estão relacionadas com o processo de maturação da glândula adrenal e podem estar relacionadas coma síntese de esteroides sexuais devido a proximidade da puberdade. A imunomarcação da enzima citocromo b5 nas células cromafins das medulas das adrenais de 50 dias de gestação e adulta, podem estar relacionadas à síntese de adrenalina e noradrenalina devido a fatores de estresse. O aumento da duração da gestação para 50 dias ou mais, pode estar relacionado com deficiências na síntese de cortisol/corticosterona pelas enzimas esteroidogênicas / The Spixs yellow-toothed cavy (Galea spixii), is a Caviidae family rodent living in the Brazilian Northeast Caatinga and have been bred in captivity for use as an alternative food source, species preservation and use as animal model research. Few studies are focused on a detailed study of the morphology and ultrastructure of different cell types and expression of enzyme in each of the zones of the adrenal cortex, particularly in wild mammalian species. The fetal adrenal glands 20 days of gestation showed undifferentiated cortex. The early formation of the zona fasciculata was observed in fetuses of 25 days of pregnancy and the reticulated area emerged in fetuses at 40 days of gestation. The areas described above persisted in fetuses at 50 days of gestation, animals at 15 and 30 postnatal days and pubertal animals. The expression of P450c17 enzyme cytochrome b5 and cytochrome in glomerular areas fasciculata and guinea pigs crosslinked embryos and fetuses are not only related to production, respectively, mineralocorticoids and glucocorticoids, sex steroids, as the cytochrome b5 is responsible for cortical differentiation different stages of development and adrenal cytochrome P450c17 immunoreactivity of the final stage of pregnancy are associated with the adrenal gland maturation process and may be associated with the synthesis of sex steroids due to the proximity of puberty. The immunostaining of the enzyme cytochrome b5 in the chromaffin cells of the adrenal marrow 50 days of gestation and adult, may be related to the synthesis of adrenaline and noradrenaline due to stress factors. The increased length of gestation for 50 days or more, may be related to impaired cortisol synthesis / corticosterone by steroidogenic enzymes

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-20T12:12:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_SylvioAndreGarciaVieira.pdf: 3455615 bytes, checksum: 2826b01774c4732fb20d76dd1dde7a09 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-20T12:12:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_SylvioAndreGarciaVieira.pdf: 3455615 bytes, checksum: 2826b01774c4732fb20d76dd1dde7a09 (MD5) Previous issue date: 2016-08-23 / The analysis of the biological formations through computer programs has been turning the interpretation of information quicker, more practical, and more reliable. There are a great number of data stored in specialized databases all over the world, that need to be analyzed and interpreted. On the biological databases, there are data obtained from a variety of ways of research in organisms affected by illnesses such as adenoma and carcinoma. There are also data related to the processes of maintenance of the organism in various levels, called pathways. These pathways act in the organism in a different way in every stage, such as in its normality or in the presence of some genetic disease. This study aims at using graphs in order to develop a model of pathway interaction network that incorporate the maintenance of the genome and other activities of the organism conveyed in adenoma and carcinoma of the adrenal cortex, identifying those who are active in the organism in the presence of gene mutation. In order to determine which pathways are modified in the presence of each disease was used a calculus of relative activity of the route associated to the statistical test Z. To visualize the results, graphs were used, whose junctions represent the pathways and whose edges represent the interactions. Through the computer program developed, it was possible to identify the differences that the organism presents in these conditions, allowing the suggestion of employment of this technique to identify modifications that the organism may present when a new nanoencapsulated drug is used. / A análise de informações biológicas por meios computacionais vem tornando as atividades de interpretação das informações mais rápida, prática e confiável. Existem muitos dados depositados em bancos especializados ao redor do mundo, que precisam ser avaliados e interpretados. Nestes bancos de dados de informações biológicas há informações resultantes de várias formas de pesquisas em organismos acometidos de doenças, como adenomas e carcinomas. A evolução dessas doenças ocorre através da ativação de vias muito específicas. Estas vias atuam no organismo de forma diferente em cada estado, como na sua normalidade ou na presença de alguma doença genética. Este trabalho tem por objetivo utilizar grafos para desenvolver um modelo de redes de interação de vias que envolvam a manutenção do genoma e outras atividades do organismo expressas em adenoma e carcinoma de córtex adrenal, identificando as vias expressas no organismo na presença de mutações. Para determinar quais vias estariam com a sua expressão alterada na presença de cada doença, foi utilizado o cálculo de atividade relativa da via associado ao teste estatístico Z. Para visualização dos resultados foram utilizados grafos, cujos nós representam as vias e as arestas representam as interações. Por meio do sistema computacional desenvolvido foi possível identificar as diferenças que o organismo apresenta nestas condições, permitido a sugestão de utilização desta técnica para a identificação das modificações que o organismo possa apresentar quando da utilização de um novo fármaco nanoencapsulado.

As massas adrenocorticais são majoritariamente (70-80%) adenomas adrenocorticais (ACA). Os carcinomas adrenocorticais (ACC) são mais raros e de prognóstico restrito, com incidência de 1-2 casos por milhão, com alta taxa de reincidência (70-80%). Apesar dos tumores adrenocorticais (ACT) serem raros, no Brasil a incidência desses tumores em crianças é cerca de 10 vezes superior ao do restante do mundo, devido a uma mutação do gene TP53. Atualmente, o diagnóstico de massas adrenocorticais é realizado através dos critérios de Weiss, que possuem limitações, e por isso é intensa a busca de novos marcadores moleculares que facilite o diagnóstico de ACTs. POD-1/ TCF21 é um fator de transcrição do tipo helix-loop-helix básica (bHLH) expresso nos sítios de interação mesênquima-epitélio durante o desenvolvimento embrionário. Em ACTs, POD-1 regula a expressão endógena de SF-1 através da ligação na sequencia E-box da região promotora de SF-1, e nesses tumores parece estar relacionado negativamente com genes reguladores do ciclo celular, como BUB1B. BUB1B é um gene que codifica uma quinase com funções importantes durante o checkpoint mitótico. A expressão de BUB1B é considerada fator de prognóstico em diferentes tipos de tumores, inclusive em ACTs humanos, nos quais a expressão combinada de BUB1B e PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) mostrou-se um bom marcador de sobrevida em pacientes com ACC. PINK1, quinase 1 induzida por PTEN, é regulada principalmente pela mitocôndria, e em ACTs sua expressão está reduzida em ACC mais agressivos. Temos como hipótese que a expressão de POD-1 pode ter valor diferencial no diagnóstico de massas adrenocorticais, e que a análise da expressão combinada de POD-1, BUB1B e PINK1 pode ter valor diferencial para prognóstico de pacientes com ACT. Nesse trabalho foram analisados, por reação de qPCR com sondas Taqman, o cDNA obtido de 130 amostras de tumores: 79 adultos (44 ACAs e 35 ACCs), 35 crianças com menos de 5 anos de idade (27 ACAs e 8 ACCs) e 16 crianças de 5 a 18 anos de idade (6 ACAs e 10 ACCs). Nossos resultados mostram que POD-1 e BUB1B tem valor diferencial em ACT adulto e que a expressão combinada de POD-1 e BUB1B pode ser um marcador de prognóstico em pacientes com carcinoma adulto. Enquanto que, a expressão combinada de POD-1 e SF-1 pode ter valor de diagnóstico em pacientes pediátricos com menos de 5 anos. Em resumo, concluímos que estudos experimentais devem ser realizados para comprovar a relação entre os genes estudados, para que os resultados sejam sólidos o suficiente para serem utilizados no diagnóstico e prognóstico dos tumores adrenocorticais. / The adrenocortical masses are mostly (70-80%) adrenocortical adenomas (ACA). Adrenocortical carcinomas (ACC) are scarce and have limited prognosis, with an incidence of 1-2 cases per million and high recurrence rate (70-80%). Despite adrenocortical tumors (ACT) are rare in Brazil the incidence of these tumors in children is about 10 times higher than the rest of the world, due to a mutation of the TP53 gene. Currently, the diagnosis of adrenocortical mass is carried through Weiss criteria that have limitations, so it is intensive the search for new molecular markers that facilitate the diagnostic of ACTs. TCF21/POD-1 is a transcription factor helix-loop-helix type expressed in mesenchymal-epithelial sites of interaction during embryonic development. In ACTs, POD-1 regulates the expression of endogenous SF-1 through binding the E-box sequence of SF-1 promoter region, and seems to be negatively relates with cell cycle regulatory genes such as BUB1B. BUB1B is a gene encoding a kinase-with important function during mitotic checkpoint. The expression of BUB1B is considered a prognostic factor in different types of tumors, including ACTs. Combined expression of BUB1B and PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) has been shown to be a good marker of survival in adults with ACC, whereas the PINK1 expression is reduced in the most aggressive ACC. We hypothesized that the POD-1 expression may have differential value in the diagnosis of adrenocortical masses, and that the analysis of the combined expression of POD-1, BUB1B and PINK1 may have differential value for the prognosis of patients with ACT. In this work were analyzed by PCRq Taqman probes the cDNA obtained from 130 tumor samples: 79 adults (44 ACAs and 35 ACCs), 35 children under 5 years old (27 ACAs and 8 ACCs) and 16 children 5-18 years of age (6 ACAs and 10 ACCs). Our results show that POD-1 and BUB1B has differential value in adult ACT, and the combined expression of POD-1 and BUB1B may have a prognostic value in patients with adult carcinoma. In addition, the combined expression of POD-1 and SF-1 might have diagnostic value in pediatric patients younger than 5 years. In summary, we conclude that experimental studies should be conducted to confirm the relationship between the genes studied, so that the results are solid enough to be used in the diagnosis and prognosis of adrenocortical tumors.

Introdução: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) e a via Wnt controlam o desenvolvimento de células progenitoras/tronco adrenais. NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3 estão envolvidos na manutenção de células-tronco e têm papel em vários cânceres de diferentes tecidos. Ainda não está claro se esses fatores de transcrição interagem para promover a tumorigênese adrenocortical. Objetivo: Nos tumores adrenocorticais (TAC): avaliar o ganho de material genômico e a expressão de RNAm e proteica de DAX1 e SF1; avaliar a expressão de RNAm e proteica de marcadores de células-tronco (NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3). No desenvolvimento do córtex adrenal: avaliar a expressão proteica desses genes. In vitro: avaliar a interação entre a via Wnt/Beta-catenina e a expressão de NANOG. Pacientes e Métodos: Painel de 30 córtices adrenais fetais humanos (20-38 semanas de gestação) e 14 pós-natais. Pacientes com TAC: 96 crianças/adolescentes (81% do sexo feminino, idade mediana de 1,6 anos [0,4 a 15,6 anos]) e 18 adultos (10 adenomas e 8 carcinomas, 89% do sexo feminino e idade mediana de 42,5 anos [21-66 anos]). Tecidos adrenais normais (controles para qPCR e MLPA): 13 crianças (idade mediana de 3 anos) e 13 adultos (mediana de idade de 48 anos). A expressão proteica de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 foi avaliada por imunohistoquímica nos TAC e nos córtices adrenais fetais e pós-natais. A expressão de RNAm de NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG e POU5F1 (OCT4) foi avaliada por qPCR nos TAC. Ganho ou perda de material genômico de NR0B1 e NR5A1 foi avaliada por MLPA nos TAC. In vitro, a expressão de NANOG (qPCR) foi avaliada em células adrenais H295 antes e após inibição da via Wnt/Beta-catenina com a substância PNU-74654. Resultados: Em adrenais fetais com 20 e 25 semanas de gestação detectou-se marcação intensa de SF1, DAX1, SOX2 e OCT4 na região subcapsular e marcação leve a moderada e difusa de STAT3 e NANOG. Após as 31 semanas e no período pós-natal, a marcação intensa de SF1 persistiu, porém a marcação de DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 diminuiu ou desapareceu. Nos TAC, a marcação nuclear de SF1 foi positiva em 67% das amostras pediátricas e em 19% das amostras de adultos. Ganho de material genômico do NR5A1 foi observado em 71% dos TAC pediátricos e 33% de TAC adultos. Porém observou-se hipoexpressão do RNAm do NR5A1 em 84% dos TAC pediátricos. Nenhum ganho de material genômico ou aumento da expressão do RNAm do NR0B1 foi observado nos TAC pediátricos. Porém em 45% desses tumores detectou-se marcação nuclear. Nos TAC de pacientes adultos, houve aumento da expressão de RNAm de NR0B1 em 89% das amostras. Não se observou marcação de STAT3 nos TAC pediátricos e adultos. Porém nos pacientes adultos, a expressão do RNAm de STAT3 foi significativamente maior nos adenomas do que nos carcinomas. Por sua vez, a marcação nuclear do OCT4 associou-se significativamente com a ocorrência de metástases nos pacientes pediátricos. Nos TAC com a mutação p.S45P no gene da Beta-catenina detectou-se expressão significativamente aumentada do RNAm do NANOG. Além disso, após a inibição in vitro da via Wnt/Beta-catenina nas células tumorais adrenais houve redução significativa na expressão do RNAm de NANOG. Conclusão: Existe um padrão temporal na expressão de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 durante o desenvolvimento do córtex adrenal fetal, porém apenas a expressão de SF1 permanece no final da gestação e após o nascimento. TAC pediátricos exibem ganho de material gênico, aumento da expressão proteica e aparentemente redução paradoxal do RNAm do SF1 (NR5A1). Marcação nuclear de OCT4 se associa a fenótipo tumoral mais agressivo nos pacientes pediátricos. Parece exisitir interação entre a via Wnt/Beta-catenina e células-tronco, por meio do fator de transcrição NANOG, na tumorigênese adrenocortical. / Background: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) and the Wnt pathway control adrenal stem/progenitor cells development. NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3 are involved in the maintenance of stem cells and have role in various types of cancers in different tissues. It is still unclear whether these transcription factors interact to promote adrenocortical tumorigenesis. Objective: In adrenocortical tumors (ACT): to evaluate the gain of genomic material and the expression of mRNA and protein of DAX1 and SF1; to evaluate the mRNA and protein expression of stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3). In the development of the adrenal cortex: to evaluate the protein expression of these genes. In vitro: to evaluate the interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and NANOG expression. Patients & Methods: Panel of 30 fetal human adrenal cortices (20-38 gestational weeks) and 14 postnatal human adrenal cortices. ACT Patients: 96 children/ teenagers (81% female; median age of 1.6 years; 0.4-15.6 years) and 18 adults (10 adenomas and 8 carcinomas; 89% female; median age of 42.5 years; 21-66 years). Normal adrenal tissues (qPCR and MLPA controls): 13 children (median age of 3 years) and 13 adults (median age of 48 years). Protein expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 was assessed by immunohistochemistry in ACT, fetal and postnatal adrenal cortices. The mRNA expression of NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG and POU5F1 (OCT4) was assessed by qPCR in ACT. Gain or loss of NR0B1 and NR5A1 genomic material was assessed by MLPA in ACT. In vitro, NANOG expression (qPCR) was evaluated in H295 adrenal cells before and after inhibition of the Wnt/Beta-catenin pathway with PNU-74654. Results: In the adrenal glands at 20 and 25 gestational weeks, intense staining of SF1, DAX1, SOX2 and OCT4 was detected in the subcapsular region and a diffuse pattern mild to moderate staining of STAT3 and NANOG. After 31 weeks and in the postnatal period, intense SF1 staining persisted, but the staining of DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 decreased or disappeared. In the ACT, the nuclear staining of SF1 was positive in 67% of pediatric samples and in 19% of adult samples. Gain of NR5A1 genomic material was observed in 71% of pediatric ACT and 33% of adult ACT. However, hypoexpression of NR5A1 mRNA was observed in 84% of pediatric ACT. No gain of genomic material or increase in mRNA expression of NR0B1 was observed in pediatric ACT. However, in 45% of these tumors nuclear staining was detected. In adult ACT, there was an increase in NR0B1 mRNA expression in 89% of the samples. No STAT3 staining was found in pediatric and adult ACT. However, in adult ACT, the STAT3 mRNA expression was significantly higher in adenomas than in carcinomas. In turn, the nuclear marking of OCT4 was significantly associated with the occurrence of metastases in pediatric patients. In the TACs with the p.S45P mutation in the Beta-catenin gene significantly increased NANOG mRNA expression was detected. In addition, after in vitro inhibition of the Wnt / Beta-catenin pathway in adrenal tumor cells there was a significant reduction in NANOG mRNA expression. Conclusion: There is a temporal pattern in the expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 during the development of the fetal adrenal cortex, but only SF1 expression remains at the end of gestation and after birth. Pediatric ACT show gain in NR5A1 gene material, increase in its protein expression but an apparent paradoxical reduction of mRNA. Nuclear staining of OCT4 is associated with more aggressive tumor phenotype in pediatric patients. There appears to be an interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and stem cells via NANOG, in adrenocortical tumorigenesis.

Introdução: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) e a via Wnt controlam o desenvolvimento de células progenitoras/tronco adrenais. NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3 estão envolvidos na manutenção de células-tronco e têm papel em vários cânceres de diferentes tecidos. Ainda não está claro se esses fatores de transcrição interagem para promover a tumorigênese adrenocortical. Objetivo: Nos tumores adrenocorticais (TAC): avaliar o ganho de material genômico e a expressão de RNAm e proteica de DAX1 e SF1; avaliar a expressão de RNAm e proteica de marcadores de células-tronco (NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3). No desenvolvimento do córtex adrenal: avaliar a expressão proteica desses genes. In vitro: avaliar a interação entre a via Wnt/Beta-catenina e a expressão de NANOG. Pacientes e Métodos: Painel de 30 córtices adrenais fetais humanos (20-38 semanas de gestação) e 14 pós-natais. Pacientes com TAC: 96 crianças/adolescentes (81% do sexo feminino, idade mediana de 1,6 anos [0,4 a 15,6 anos]) e 18 adultos (10 adenomas e 8 carcinomas, 89% do sexo feminino e idade mediana de 42,5 anos [21-66 anos]). Tecidos adrenais normais (controles para qPCR e MLPA): 13 crianças (idade mediana de 3 anos) e 13 adultos (mediana de idade de 48 anos). A expressão proteica de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 foi avaliada por imunohistoquímica nos TAC e nos córtices adrenais fetais e pós-natais. A expressão de RNAm de NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG e POU5F1 (OCT4) foi avaliada por qPCR nos TAC. Ganho ou perda de material genômico de NR0B1 e NR5A1 foi avaliada por MLPA nos TAC. In vitro, a expressão de NANOG (qPCR) foi avaliada em células adrenais H295 antes e após inibição da via Wnt/Beta-catenina com a substância PNU-74654. Resultados: Em adrenais fetais com 20 e 25 semanas de gestação detectou-se marcação intensa de SF1, DAX1, SOX2 e OCT4 na região subcapsular e marcação leve a moderada e difusa de STAT3 e NANOG. Após as 31 semanas e no período pós-natal, a marcação intensa de SF1 persistiu, porém a marcação de DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 diminuiu ou desapareceu. Nos TAC, a marcação nuclear de SF1 foi positiva em 67% das amostras pediátricas e em 19% das amostras de adultos. Ganho de material genômico do NR5A1 foi observado em 71% dos TAC pediátricos e 33% de TAC adultos. Porém observou-se hipoexpressão do RNAm do NR5A1 em 84% dos TAC pediátricos. Nenhum ganho de material genômico ou aumento da expressão do RNAm do NR0B1 foi observado nos TAC pediátricos. Porém em 45% desses tumores detectou-se marcação nuclear. Nos TAC de pacientes adultos, houve aumento da expressão de RNAm de NR0B1 em 89% das amostras. Não se observou marcação de STAT3 nos TAC pediátricos e adultos. Porém nos pacientes adultos, a expressão do RNAm de STAT3 foi significativamente maior nos adenomas do que nos carcinomas. Por sua vez, a marcação nuclear do OCT4 associou-se significativamente com a ocorrência de metástases nos pacientes pediátricos. Nos TAC com a mutação p.S45P no gene da Beta-catenina detectou-se expressão significativamente aumentada do RNAm do NANOG. Além disso, após a inibição in vitro da via Wnt/Beta-catenina nas células tumorais adrenais houve redução significativa na expressão do RNAm de NANOG. Conclusão: Existe um padrão temporal na expressão de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 durante o desenvolvimento do córtex adrenal fetal, porém apenas a expressão de SF1 permanece no final da gestação e após o nascimento. TAC pediátricos exibem ganho de material gênico, aumento da expressão proteica e aparentemente redução paradoxal do RNAm do SF1 (NR5A1). Marcação nuclear de OCT4 se associa a fenótipo tumoral mais agressivo nos pacientes pediátricos. Parece exisitir interação entre a via Wnt/Beta-catenina e células-tronco, por meio do fator de transcrição NANOG, na tumorigênese adrenocortical. / Background: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) and the Wnt pathway control adrenal stem/progenitor cells development. NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3 are involved in the maintenance of stem cells and have role in various types of cancers in different tissues. It is still unclear whether these transcription factors interact to promote adrenocortical tumorigenesis. Objective: In adrenocortical tumors (ACT): to evaluate the gain of genomic material and the expression of mRNA and protein of DAX1 and SF1; to evaluate the mRNA and protein expression of stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3). In the development of the adrenal cortex: to evaluate the protein expression of these genes. In vitro: to evaluate the interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and NANOG expression. Patients & Methods: Panel of 30 fetal human adrenal cortices (20-38 gestational weeks) and 14 postnatal human adrenal cortices. ACT Patients: 96 children/ teenagers (81% female; median age of 1.6 years; 0.4-15.6 years) and 18 adults (10 adenomas and 8 carcinomas; 89% female; median age of 42.5 years; 21-66 years). Normal adrenal tissues (qPCR and MLPA controls): 13 children (median age of 3 years) and 13 adults (median age of 48 years). Protein expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 was assessed by immunohistochemistry in ACT, fetal and postnatal adrenal cortices. The mRNA expression of NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG and POU5F1 (OCT4) was assessed by qPCR in ACT. Gain or loss of NR0B1 and NR5A1 genomic material was assessed by MLPA in ACT. In vitro, NANOG expression (qPCR) was evaluated in H295 adrenal cells before and after inhibition of the Wnt/Beta-catenin pathway with PNU-74654. Results: In the adrenal glands at 20 and 25 gestational weeks, intense staining of SF1, DAX1, SOX2 and OCT4 was detected in the subcapsular region and a diffuse pattern mild to moderate staining of STAT3 and NANOG. After 31 weeks and in the postnatal period, intense SF1 staining persisted, but the staining of DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 decreased or disappeared. In the ACT, the nuclear staining of SF1 was positive in 67% of pediatric samples and in 19% of adult samples. Gain of NR5A1 genomic material was observed in 71% of pediatric ACT and 33% of adult ACT. However, hypoexpression of NR5A1 mRNA was observed in 84% of pediatric ACT. No gain of genomic material or increase in mRNA expression of NR0B1 was observed in pediatric ACT. However, in 45% of these tumors nuclear staining was detected. In adult ACT, there was an increase in NR0B1 mRNA expression in 89% of the samples. No STAT3 staining was found in pediatric and adult ACT. However, in adult ACT, the STAT3 mRNA expression was significantly higher in adenomas than in carcinomas. In turn, the nuclear marking of OCT4 was significantly associated with the occurrence of metastases in pediatric patients. In the TACs with the p.S45P mutation in the Beta-catenin gene significantly increased NANOG mRNA expression was detected. In addition, after in vitro inhibition of the Wnt / Beta-catenin pathway in adrenal tumor cells there was a significant reduction in NANOG mRNA expression. Conclusion: There is a temporal pattern in the expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 during the development of the fetal adrenal cortex, but only SF1 expression remains at the end of gestation and after birth. Pediatric ACT show gain in NR5A1 gene material, increase in its protein expression but an apparent paradoxical reduction of mRNA. Nuclear staining of OCT4 is associated with more aggressive tumor phenotype in pediatric patients. There appears to be an interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and stem cells via NANOG, in adrenocortical tumorigenesis.

As massas adrenocorticais são majoritariamente (70-80%) adenomas adrenocorticais (ACA). Os carcinomas adrenocorticais (ACC) são mais raros e de prognóstico restrito, com incidência de 1-2 casos por milhão, com alta taxa de reincidência (70-80%). Apesar dos tumores adrenocorticais (ACT) serem raros, no Brasil a incidência desses tumores em crianças é cerca de 10 vezes superior ao do restante do mundo, devido a uma mutação do gene TP53. Atualmente, o diagnóstico de massas adrenocorticais é realizado através dos critérios de Weiss, que possuem limitações, e por isso é intensa a busca de novos marcadores moleculares que facilite o diagnóstico de ACTs. POD-1/ TCF21 é um fator de transcrição do tipo helix-loop-helix básica (bHLH) expresso nos sítios de interação mesênquima-epitélio durante o desenvolvimento embrionário. Em ACTs, POD-1 regula a expressão endógena de SF-1 através da ligação na sequencia E-box da região promotora de SF-1, e nesses tumores parece estar relacionado negativamente com genes reguladores do ciclo celular, como BUB1B. BUB1B é um gene que codifica uma quinase com funções importantes durante o checkpoint mitótico. A expressão de BUB1B é considerada fator de prognóstico em diferentes tipos de tumores, inclusive em ACTs humanos, nos quais a expressão combinada de BUB1B e PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) mostrou-se um bom marcador de sobrevida em pacientes com ACC. PINK1, quinase 1 induzida por PTEN, é regulada principalmente pela mitocôndria, e em ACTs sua expressão está reduzida em ACC mais agressivos. Temos como hipótese que a expressão de POD-1 pode ter valor diferencial no diagnóstico de massas adrenocorticais, e que a análise da expressão combinada de POD-1, BUB1B e PINK1 pode ter valor diferencial para prognóstico de pacientes com ACT. Nesse trabalho foram analisados, por reação de qPCR com sondas Taqman, o cDNA obtido de 130 amostras de tumores: 79 adultos (44 ACAs e 35 ACCs), 35 crianças com menos de 5 anos de idade (27 ACAs e 8 ACCs) e 16 crianças de 5 a 18 anos de idade (6 ACAs e 10 ACCs). Nossos resultados mostram que POD-1 e BUB1B tem valor diferencial em ACT adulto e que a expressão combinada de POD-1 e BUB1B pode ser um marcador de prognóstico em pacientes com carcinoma adulto. Enquanto que, a expressão combinada de POD-1 e SF-1 pode ter valor de diagnóstico em pacientes pediátricos com menos de 5 anos. Em resumo, concluímos que estudos experimentais devem ser realizados para comprovar a relação entre os genes estudados, para que os resultados sejam sólidos o suficiente para serem utilizados no diagnóstico e prognóstico dos tumores adrenocorticais. / The adrenocortical masses are mostly (70-80%) adrenocortical adenomas (ACA). Adrenocortical carcinomas (ACC) are scarce and have limited prognosis, with an incidence of 1-2 cases per million and high recurrence rate (70-80%). Despite adrenocortical tumors (ACT) are rare in Brazil the incidence of these tumors in children is about 10 times higher than the rest of the world, due to a mutation of the TP53 gene. Currently, the diagnosis of adrenocortical mass is carried through Weiss criteria that have limitations, so it is intensive the search for new molecular markers that facilitate the diagnostic of ACTs. TCF21/POD-1 is a transcription factor helix-loop-helix type expressed in mesenchymal-epithelial sites of interaction during embryonic development. In ACTs, POD-1 regulates the expression of endogenous SF-1 through binding the E-box sequence of SF-1 promoter region, and seems to be negatively relates with cell cycle regulatory genes such as BUB1B. BUB1B is a gene encoding a kinase-with important function during mitotic checkpoint. The expression of BUB1B is considered a prognostic factor in different types of tumors, including ACTs. Combined expression of BUB1B and PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) has been shown to be a good marker of survival in adults with ACC, whereas the PINK1 expression is reduced in the most aggressive ACC. We hypothesized that the POD-1 expression may have differential value in the diagnosis of adrenocortical masses, and that the analysis of the combined expression of POD-1, BUB1B and PINK1 may have differential value for the prognosis of patients with ACT. In this work were analyzed by PCRq Taqman probes the cDNA obtained from 130 tumor samples: 79 adults (44 ACAs and 35 ACCs), 35 children under 5 years old (27 ACAs and 8 ACCs) and 16 children 5-18 years of age (6 ACAs and 10 ACCs). Our results show that POD-1 and BUB1B has differential value in adult ACT, and the combined expression of POD-1 and BUB1B may have a prognostic value in patients with adult carcinoma. In addition, the combined expression of POD-1 and SF-1 might have diagnostic value in pediatric patients younger than 5 years. In summary, we conclude that experimental studies should be conducted to confirm the relationship between the genes studied, so that the results are solid enough to be used in the diagnosis and prognosis of adrenocortical tumors.

A proliferação das células do córtex adrenal é um fenômeno que envolve genes e proteínas relacionados com o controle do ciclo celular. Um dos principais fatores envolvidos na proliferação do córtex adrenal é o ACTH (hormônio corticotrófico), mas outros fatores, como o peptídeo N-terminal da POMC, parece estar envolvido. Para contribuir com o entendimento dos mecanismos envolvidos na resposta proliferativa do córtex adrenal analisamos os efeitos desencadeados por ambos os peptídeos em ratos cujo eixo HPA foi inibido pela dexametasona. Foram utilizados os métodos de incorporação de BrdU; de análise da expressão proteica das ciclinas D, E e p27 através de imunistoquímica e immunoblotting e da expressão de genes relacionados ao controle do ciclo celular utilizando placas de qRT-PCR. Nossos resultados sugerem que ambos os peptídeos induzem efeito proliferativo mas zona-específico no córtex adrenal, e que esse efeito pode ser mediado pelo controle da expressão das ciclinas D2, D3 e E, e pelo inibidor de ciclo celular, a proteína p27kip1. / The proliferation of adrenal cortical cells involves genes and proteins related with the control of the cell cycle. The main factor involved in the proliferation of the adrenal cortex is the ACTH (corticotrophin), but other factor, such as the peptide N-terminal of POMC, seems to be involved. To contribute to the understanding of the mechanisms involved in the proliferative response of the adrenal cortex, we analyzed the effects triggered by both peptides in rats with the HPA axis inhibited by dexamethasone. The methods used were the incorporation of BrdU; analysis of protein cyclins D, E and p27 expression through immunohistochemistry and immunoblotting and expression of genes involved in cell cycle regulation by using qRT-PCR arrays. The results suggest that both peptides induced proliferative effect in adrenal cortex in a zone-specific manner. This effect may be mediated by the control of cyclins D2, D3 and E expression, and also by the cell cycle inhibitor, protein p27KIP1.

A proliferação das células do córtex adrenal é um fenômeno que envolve genes e proteínas relacionados com o controle do ciclo celular. Um dos principais fatores envolvidos na proliferação do córtex adrenal é o ACTH (hormônio corticotrófico), mas outros fatores, como o peptídeo N-terminal da POMC, parece estar envolvido. Para contribuir com o entendimento dos mecanismos envolvidos na resposta proliferativa do córtex adrenal analisamos os efeitos desencadeados por ambos os peptídeos em ratos cujo eixo HPA foi inibido pela dexametasona. Foram utilizados os métodos de incorporação de BrdU; de análise da expressão proteica das ciclinas D, E e p27 através de imunistoquímica e immunoblotting e da expressão de genes relacionados ao controle do ciclo celular utilizando placas de qRT-PCR. Nossos resultados sugerem que ambos os peptídeos induzem efeito proliferativo mas zona-específico no córtex adrenal, e que esse efeito pode ser mediado pelo controle da expressão das ciclinas D2, D3 e E, e pelo inibidor de ciclo celular, a proteína p27kip1. / The proliferation of adrenal cortical cells involves genes and proteins related with the control of the cell cycle. The main factor involved in the proliferation of the adrenal cortex is the ACTH (corticotrophin), but other factor, such as the peptide N-terminal of POMC, seems to be involved. To contribute to the understanding of the mechanisms involved in the proliferative response of the adrenal cortex, we analyzed the effects triggered by both peptides in rats with the HPA axis inhibited by dexamethasone. The methods used were the incorporation of BrdU; analysis of protein cyclins D, E and p27 expression through immunohistochemistry and immunoblotting and expression of genes involved in cell cycle regulation by using qRT-PCR arrays. The results suggest that both peptides induced proliferative effect in adrenal cortex in a zone-specific manner. This effect may be mediated by the control of cyclins D2, D3 and E expression, and also by the cell cycle inhibitor, protein p27KIP1.