Cellular responses to outer stimuli are the basis for all biological processes. Signal integration is achieved by protein cascades, recognizing and processing molecules from the environment. Factors released by pathogens or inflammation usually induce an inflammatory response, a signal often transduced by Tumour Necrosis Factor alpha (TNF). TNFα receptors TNF-R1 and TNF-R2 can in turn lead to apoptosis or proliferation via NF-B. These processes are closely regulated by membrane compartimentalization, protein interactions and trafficking. Fluorescence microscopy offers a reliable and non-invasive method to probe these cellular events. However, some processes on a native membrane are not resolvable, as they are well below the diffraction limit of microscopy. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy methods enables the observation of these cellular players well below this limit: by localizing, tracking and counting molecules with high spatial and temporal resolution, these new fluorescence microscopy methods offer a previously unknown insight into protein interactions at the near-molecular level. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) utilizes the reversible, stochastic blinking events of small commercially available fluorescent dyes, while photoactivated localization microscopy (PALM) utilizes phototransformation of genetically encoded fluorescent proteins. By photoactivating only a small fraction of the present fluorophores in each observation interval, single emitters can be localized with high precision and a super-resolved image can be reconstructed. Quantum Dot Triexciton imaging (QDTI) utilizes the three-photon absorption (triexcitonic) properties of quantum dots (QD) and to achieve a twofold resolution increase using conventional confocal microscopes. In this thesis, experimental approaches were implemented to achieve super-resolution microscopy in fixed and live-cells to study the spatial and temporal dynamics of TNF and other cellular signaling events. We introduce QDTI to study the three-dimensional cellular distribution of biological targets, offering an easy method to achieve resolution enhancement in combination with optical sectioning, allowing the preliminary quantification of labeled proteins. As QDs are electron dense, QDTI can be used for correlative fluorescence and transmission electron microscopy, proving the versatility of QD probes. Utilizing the phototransformation properties of fluorescent proteins, single-receptor tracking on live cells was achieved, applying the concept of single particle tracking PALM (sptPALM) to track the dynamics of a TNF-R1-tdEos chimera on the membrane. Lateral receptor dynamics can be tracked with high precision and the influences of ligand addition or lipid disruption on TNF-R1 mobility was observed. The results reveal complex receptor dynamics, implying internalization processes in response to TNFα stimulation and a role for membrane domains with reduced fluidity, so-called lipid raft domains, in TNF-R1 compartimentalization prior or post ligand induction. Comparisons with previously published FCS data show a good accordance, but stressing the increased data depth available in sptPALM experiments. Additionally, the active transport of NF-κB-tdEos fusions was observed in live neurons under chemical stimulation and/or inhibition. Contrary to phototransformable proteins that need no special buffers to exhibit photoconversion or photoactivation, dSTORM has previously been unsuitable for in vivo applications, as organic dyes relied on introducing the probes via immunostaining in concert with a reductive, oxygen-free medium for proper photoswitching behaviour. ATTO655 had been previously shown to be suitable for live-cell applications, as its switching behavior can be catalyzed by the reductive environment of the cytoplasm. By introducing the cell-permeant organic dye via a chemical tag system, a high specificity and low background was achieved. Here, the labeled histone H2B complex and thus single nucleosome movements in a live cell can be observed over long time periods and with ~20 nm resolution. Implementing these new approaches for imaging biological processes with high temporal and spatial resolution provides new insights into the dynamics and spatial heterogeneities of proteins, further elucidating their function in the organism and revealing properties that are usually only detectable in vitro. / Zelluläre Antworten auf externe Stimuli sind die Basis aller biologischer Prozesse. Die Integration dieser Signale wird dabei von Proteinkaskaden ausgeführt, welche Moleküle aus der Umgebung wahrnehmen und verarbeiten. Faktoren, welche von Pathogenen oder während einer Entzündung freigesetzt werden, induzieren für gewöhnlich eine Entzündungsantwort, eine Reaktion, die oft vom Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) vermittelt wird. Die TNFα Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 vermitteln nach Ligandenbinding Apoptose oder Zellproliferation durch NF-kB. Diese Prozesse sind engmaschig durch Membrankompartimentierung, Proteininteraktionen und -transport reguliert. Fluoreszenzmikroskopie bietet eine zuverlässige, nicht-invasive Methode um diese zellulären Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind einige Prozesse innerhalb einer nativen Membran nicht auflösbar, da sie weit unterhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie stattfinden. Die jüngste Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethoden erlaubt die Beobachtung dieser zellulären Abläufe auf molekularer Ebene: durch das Lokalisieren, Verfolgen und Zählen von Molekülen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung bieten diese neuen Fluoreszenzmethoden bisher unbekannte Einblicke in Proteininteraktionen. Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) nutzt die reversiblen, stochastischen Ereignisse von kleinen blinkenden, kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen, während die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) die Phototransformation fluoreszierenden Proteinen nutzt. Durch das Photoaktivieren lediglich eines kleinen Bruchteils der Fluorophore innerhalb eines Zeitintervalls können einzelne Emitter mit hoher Genauigkeit lokalisiert und ein hochaufgelöstes Bild daraus rekonstruiert werden. Quantum Dot Triexciton Imaging (QDTI) nutzt die Drei-Photonen-Absorption von Quantenpunkten um eine zweifache Auflösungserhöhung mittels eines Konfokalmikroskopes zu erreichen. In dieser Arbeit wurden experimentelle Ansätze zur hochauflösenden Mikroskopie an fixierten und lebenden Zellen implementiert, um die räumliche und zeitliche Dynamik von TNF und anderen zellulären Signalwegen zu untersuchen. Zur Analyse der dreidimensionalen, zellulären Verteilung von biologischen Zielen stellen wir QDTI vor, welches eine einfache Methode zur Verbesserung der Auflösung an Konfokalmikroskopen in Kombination mit optischen Schnitten darstellt. Dies ermöglicht die vorläufige Quantifizierung von markierten Proteinen. Da QDs eine hohe Elektronendichte besitzen kann QDTI auch für korrelative Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie genutzt werden, was die Vielseitigkeit der QD-Sonden verdeutlicht. Mit Hilfe des single-particle tracking PALM (sptPALM) Konzepts konnten einzelne Rezeptormoleküle verfolgt werden, um die Dynamiken einer TNF-R1-tdEos Chimäre auf der Membran zu beobachten. Die laterale Rezeptordynamik kann hier mit hoher Präzision gemessen, und die Einflüsse auf die TNF-R1-Mobilität konnte nach Ligandenzugabe oder die Störung der Membranzusammensetzung analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine komplexe Rezeptordynamik und lassen sowohl auf Internalisierungsprozesse in Reaktion auf TNFα-Stimulation, als auch auf eine wichtige Rolle von Membrandomänen mit eingeschränkter Fluidität in der TNF-R1 Kompartimentierung während der Ligandenbindung schließen. Zusätzlich wurde der aktive Transport von NF-kB-tdEos Fusionsproteinen in lebenden Neuronen unter chemischer Stimulierung bzw. Inhibierung untersucht. Im Gegensatz zu phototransformierbaren Proteinen, die keine speziellen Puffer zur Photokonversion oder Photoaktivierung benötigen, war dSTORM bisher für in vivo Anwendungen ungeeignet, da organische Farbstoffe auf die Einführung über Immunfärbung in Kombination mit einem reduktiven, Sauerstoff-freiem Medium für korrektes Photoschalten angewiesen waren. ATTO655 wurde zuvor als geeignet für die Anwendung in lebenden Zellen eingestuft, da das Schaltverhalten durch die reduktive Umgebung des Zytoplasmas katalysiert werden kann. Durch die Einführung von membranpermeablen organischen Farbstoffen über ein chemisches Markierungssystem konnte eine hohe Spezifität und ein geringer Hintergrund erreicht werden. Hier konnte durch die Markierung des Histon H2B Komplexes die Bewegung einzelner Nukleosome in lebenden Zellen über lange Zeiträume mit einer Auflösung von ~20 nm beobachtet werden. Die Umsetzung dieser neuen Ansätze für die Darstellung biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung liefert neue Einblicke in die Dynamiken und die räumliche Heterogenität von Proteinen und enthüllt Funktionen im Organismus und beleuchtet Eigenschaften, die sonst nur in vitro nachweisbar wären.

Frankfurt (Main), Universiẗat, Diss., 2008. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2006.

Ulm, Univ. Diss., 2006.

Freiburg i. Br., Univ., Diss., 2008.

Heidelberg, Universiẗat, Diss., 2007.

Am Modell des tumorinduzierten Schmerzes der Maus wurden sowohl das Schmerzverhalten der Tiere als auch spezifische morphologische Veränderungen im Hinterhorn des Rückenmarks (Aktivierung von Astrozyten) und im tumorbefallenen Knochen analysiert. Durch Analyse von Mäusen mit Defizienz für TNF-Rezeptor 1, TNF-Rezeptor 2 oder für beide Rezeptoren konnte die Rolle von TNF-α seiner Rezeptoren bei der Entstehung von tumorinduziertem Schmerz untersucht werden. Im Unterschied zu neuropathischen Schmerzmodellen konnte gezeigt werden, dass beide TNF-Rezeptoren ausgeschaltet werden müssen, um eine signifikante Schmerzreduktion zu erzielen. Die systemische Behandlung mit dem TNF-neutralisierenden Fusionsprotein Etanercept konnte die im genetischen Modell gezeigte Reduktion der mechanischen Allodynie teilweise, aber nicht vollständig reproduzieren. Eine Hemmung der Mikrogliaaktivierung mittels Minocyclin erbrachte im Tumor-schmerzmodell keinen Effekt auf das Schmerzverhalten der Tiere. Die histologische Analyse der tumoraffizierten Knochen zeigte eine signifikante Zunahme der Osteoklastenaktivität in tumortragenden Tieren. Die Behandlung mit Minocyclin war ohne erkennbaren Effekt auf die Differenzierung und die Aktivität der Osteoklasten. Es ergaben sich jedoch Hinweise, dass TNF-α einen hemmenden Einfluss auf die Osteoklastenaktivität im Knochentumormodell hat, da sowohl in den TNFR-KO-Tieren als auch unter Gabe von Etanercept eine Steigerung der Osteoklastenaktivität nachgewiesen werden konnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass TNF-α eine wichtige Rolle, sowohl in der Entstehung, als auch in der Aufrechterhaltung von tumorinduziertem Schmerz spielt. Hier liegt der Ansatzpunkt für weitere Studien mit dem Ziel, eine spezifische Pharmakotherapie zu entwickeln mit wirksamer TNF-α Blockade auch bei Patienten mit Tumorschmerzen. Nach den Erkenntnissen dieser Arbeit mit Etanercept sollte ein spezielles Augenmerk auf die ZNS-Gängigkeit dieser Substanzen gelegt werden und die Gefahr der Möglichkeit eines vermehrten Tumorwachstum bedacht werden. / Bone-cancer-related pain is one of the most disabling factors in patients suffering from primary bone cancer or bone metastases. Recent studies point toward an important role of proinflammatory cytokines, example tumor necrosis factor-alpha (TNF), for tumor growth and bone-cancer-associated pain. Mechanisms by which TNF, through its receptor subtypes, TNF receptor 1 (TNFR1) and -2 (TNFR2), elicits altered sensation and pain behavior, are still incompletely understood. To look for a potential role of TNF in bone cancer pain, cancer-related pain was analyzed in fibrosarcoma-bearing C57Bl/6J wild type mice after systemic antagonism of TNF. To further clarify the role of TNF receptor (TNFR) in bone-cancer pain, naive and fibrosarcoma-bearing C57Bl/ 6J wild type and transgenic mice with a deficiency of TNFR1 (TNFR1ko), TNFR2 (TNFR2ko), and TNFR1+2 (TNFR1+2ko) were compared regarding cancer-related pain and hyperalgesia, tumor growth, osteoclast activation, and spinal astrogliosis. Systemic antagonism of TNF significantly alleviated tactile hypersensitivity and spontaneous bone-cancer-related pain behavior. Most interestingly, combined deletion of the TNFR1 and TNFR2, but not of either gene alone, almost completely inhibited the development of tactile hypersensitivity, whereas spontaneous pain behavior was transiently increased. Accordingly, spinal astrogliosis was markedly reduced, whereas tumor growth was significantly increased in TNFR1+2ko mice. In contrast, deletion of the TNFR1 or TNFR2 gene alone did not change tumor growth or spinal astrogliosis. Our findings suggest that the combined absence of TNFR1 and TNFR2 is necessary for the attenuation of cancer-related tactile hypersensitivity and concomitant spinal astrogliosis, whereas tumor growth seems to be inhibited by combined TNFR activation. These findings support the hypothesis of cytokine-dependent pain development in cancer pain. Differential targeting of TNFR activation could be an interesting strategy in bone-cancer-related pain conditions.

TNF wird zunächst als TypII-Transmembranprotein (mTNF) gebildet und erst anschließend durch spezifische Spaltung durch die Metalloprotease TACE zum löslichen Zytokin sTNF prozessiert. Da mTNF der alleinige Hauptaktivator des TNFR2 ist und sich bisherige Untersuchungen zum TNF-Signaling weitgehend auf sTNF konzentrierten, ist vergleichsweise wenig über TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bekannt. An TNFR1 sind dagegen beide TNF-Varianten bioaktiv. Trotz intensiver Untersuchung des TNFR1-Signaling sind jedoch auch hier viele Fragen noch unbeantwortet. Derzeit existieren deshalb zum TNFR1-Signaling zwei verschiedene Modellvorstellungen nebeneinander. Im ersten Modell, dem Modell der Kompartmentalisation, bindet TRADD erst nach Rezeptorinternalisierung an TNFR1, genauso wie FADD und Caspase-8. Die Rezeptorinternalisierung nach Ligandenbindung gilt hier daher als Voraussetzung für die TRADD-Rekrutierung und für die Apoptoseinduktion. Im zweiten Modell, dem Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe, bindet TRADD dagegen bereits im membrangebundenen Signalkomplex an TNFR1. Anschließend dissoziiert TRADD vom Rezeptor, um im Zytoplasma einen zweiten, apoptoseinduzierenden Komplex mit FADD und Caspase-8 zu formen. Um mehr über TNFR2 zu erfahren und um das TNFR1-Signaling besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Signaltransduktion und die Geninduktion über TNFR1 und TNFR2 nach Stimulation mit mTNF untersucht. Ziel war es letztlich, eine Methode zu etablieren, die es erlaubt, membrangebundene TNFR1- und TNFR2-Signalkomplexe getrennt zu isolieren. Dazu wurden zunächst nicht zu sTNF spaltbare TNFR1- bzw. TNFR2-spezifische mTNF-Varianten mit GST-Tag hinsichtlich Rezeptorbindung und Rezeptoraktivierung näher charakterisiert. Die selektive Bindung dieser mTNF-Varianten an TNFR1 bzw. TNFR2 konnte gezeigt werden. Auch der Nachweis ihre Funktionalität in Versuchen zur IL8-Induktion war möglich. Mit Hilfe der TNFR1-spezifischen mTNF-Variante gelang im GST-Fishing die Koimmunopräzipitation von TNFR1, TRADD und TRAF2 und damit die Isolierung des membrangebundenen Signalkomplexes des TNFR1. Mit Hilfe einer TNFR2-spezifischen Variante konnten dagegen TNFR2 und TRAF2 koimmunopräzipitiert werden, TRADD dagegen nicht. Somit ließen sich mit den rezeptorspezifischen Varianten von mTNF die Rezeptorsignalkomplexe des TNFR1 und TNFR2 getrennt isolieren. Interessant war dabei insbesondere die TRADD-Rekrutierung an TNFR1 im membrangebundenen TNFR1-Signalkomplex. Da die Internalisierung von TNFR1 nach mTNF-Stimulation schwer vorstellbar ist, bindet TRADD offensichtlich an TNFR1, ohne dass eine Rezeptorinternalisierung Voraussetzung wäre. Damit erscheint das Modell der Kompartmentalisation zumindest für mTNF wenig plausibel. Dagegen sind die bisher für mTNF erhobenen Daten mit einer TRADD-Dissoziation vom Rezeptor vereinbar, weshalb ein Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe durchaus auch für mTNF Gültigkeit besitzen könnte. / In this dissertation, membrane bound TNF and its receptor selective muteins are shown to induce gene expression and to selectively bind to TNFR1 and TNFR2. Furthermore, in GST-Fishing experiments membrane bound TNF induced signal transduction leading to NFkB and apoptosis induction was further investigated. Two existing different models of TNFalpha induced apoptosis in the literature were compared, the model of two sequential signaling complexes and the model of compartmentalisation. In this dissertation, it was shown that the model of two sequential signaling complexes is more likely to be able to explain membrane bound TNF induced apoptosis.

Die proinflammatorischen Cytokine TNF-alpha und IL-1 beta werden im Myokard bei akuter und chronischer Herzinsuffizienz sezerniert. Ihr negativer Einfluß auf Inotropie und Kontraktionsökonomie des Myokards wurde in zahlreichen In-Vitro und Tiermodellen nachgewiesen. Bisherige Versuche einer therapeutischen Intervention in klinischen Studien waren trotz guter Erfolge in Tiermodellen bislang erfolglos. Um diese Diskrepanz zu untersuchen wurden erstmals Messungen der Kontraktilität und Kontraktionsökonomie an humanem Myokard durchgeführt. Weiterhin wurden Untersuchungen bezüglich der postulierten Signaltransduktion mittels der Sphingomyelinaseaktivität Ergebnisse Sowohl TNF-alpha; als auch IL-1 zeigen übereinstimmend mit In-Vitro Versuchen an nicht-humanem Myokard eine deutlich Minderung der Kontraktilität und Steigerung des kontraktionsabhängigen Sauerstoffverbrauchs. IL-beta führt darüber hinaus zu einer erhöhten diastolischen Kraft. Die Relaxationsgeschwindigkeit wird nicht beeinträchtigt. Glutathion vermindert diese Effekte in 10 molarer Konzentration fast vollständig. Eine Steigerung der Aktivität der neutralen oder sauren Sphingomyelinase kann nicht als Bestandteil der Signaltransduktion bestätigt werden. Schlussfolgerung Alleinig auf TNF-alpha zielende Therapieansätze inhibieren die negativen Einflüsse von Cytokinen im ischämischen und postischämischen Myokard nicht ausreichend. Glutathionapplikation kann TNF-alpha und IL-beta Effekte auf das Myokard inhibieren. / The proinflammatory cytokines TNF-a and IL-1b impair economy of contraction in human myocardium TNF-alpha and IL-1beta impair myocardial function in different animal species and in human myocardium. Prospective clinical trials studying TNF-a antagonists in patients with chronic heart failure failed to show a benefit. Therefore reasons for this possibly species-related discrepancy are to be examined. In the present study TNF-alpha and IL-1beta not only reveal an immediate negative inotropic effect but increase specific oxygen demand in human right atrial myocardium. Enhanced oxygen consumption was not caused by an elevated basal metabolism but an impaired economy of contraction. Furthermore, glutathione is able to inhibit the effect of both cytokines. The results suggest that proinflammatory cytokines have a considerable effect on myocardial mechano-energetic parameters in human myocardium as well. The sole inhibition of TNF-a as it was done in recent clinical trials does not seem prospectful.

Univ., Diss., 2006--Giessen

Ulm, Univ., Diss., 2008.