L’infection chronique par Helicobacter pylori touche plus de la moitié de la population mondiale et est la principale cause connue de l’adénocarcinome gastrique. La metformine, un antidiabétique oral, est de plus en plus étudiée pour ses propriétés antitumorales dans de nombreux types de cancers. Cependant, ses effets potentiels ont très peu été étudiés dans le cancer gastrique. Des expériences réalisées sur des lignées cellulaires cancéreuses gastriques et des tumeurs de patients amplifiées par xénogreffe chez la souris (PDX), ont permis de confirmer les propriétés antitumorales de la metformine. La metformine, en traitement préventif et curatif, diminue la capacité de formation des tumorsphères, l’expression des marqueurs de CSC gastriques, et la capacité d’auto-renouvellement propre aux CSC. Dans un second temps, nous avons montré que la metformine est capable d’inhiber la croissance bactérienne de H. pylori invitro et in vivo. Enfin, les effets de l’infection par H. pylori ont été étudiés sur la voie de signalisation mTOR par la réalisation d’une analyse transcriptomique et de western-blots sur des lignées cellulaires gastriques. Ceci a permis de démontrer que H. pylori inhibe le complexe mTORC1.Pour conclure, ce travail de thèse a permis i) de démontrer la capacité de la metformine à cibler les CSC gastriques, ii) de découvrir une nouvelle propriété antibactérienne de la metformine vis-à-vis de H. pylori, iii) de démontrer que H. pylori inhibe la voie de signalisation mTOR. / Chronic infection with Helicobacter pylori affects more than half of the world's population and is the main known cause of gastric adenocarcinoma. Metformin is an oral antidiabetic drug used to treat type 2 diabetes patients, and is being increasingly studied for its antitumoral properties in several cancer types. However, its potential effects in gastric cancer have not been thoroughly studied. Experiments performed on gastric cancer cell lines and patient-derived gastric carcinoma xenografts (PDX), have confirmed the antitumoral properties of metformin. Metformin, in preventive and curative treatment, decreases the tumorsphere formation, the expression of gastric CSC markers and the self-renewal capacity of CSC. In a second time, we have shown that metformin is able to inhibit the bacterial growth of H. pylori in vitro and in vivo. Finally, the effects of the H. pylori infection have been studied on the mTOR signaling pathway using a transcriptomic analysis and western blots, performed on gastric cancer cell lines. These show the ability of H. pylori to inhibit mTORC1.To conclude, this thesis work allowed i) to demonstrate the ability of metformin to target gastric CSCs, ii) to discover a new antimicrobial property of metformin against H. pylori, iii) to demonstrate that H. pylori inhibits the mTOR signaling pathway.

[ES] En esta tesis, buscamos profundizar en el estudio del microambiente inmunitario del tumor (TME), lo que resultaría en una mejor caracterización del contexto inmunológico de los pacientes y la búsqueda de nuevos biomarcadores en el cáncer de pulmón. Se emplearon cultivos derivados de pacientes con cáncer de pulmón, y líneas celulares comerciales para ensayos de formación de tumoresferas y condiciones adherentes como control. Se analizó la expresión génica de diversos factores inmunorreguladores, observándose una mayor expresión de la mayoría de ellos en las tumoresferas en comparación con las células adherentes. Junto con la secreción, la Galectina-3 (GAL3 o LGALS3 cuando se referencian la proteína o el gen, respectivamente) se seleccionó como la molécula que podría tener una fuerte implicación en la modulación del TME. Los análisis proteicos confirmaron que la GAL3 aumentaba en las tumoresferas de cultivos de adenocarcinoma (ADC) y mostraba patrones de localización y expresión diferencial. Las vesículas extracelulares procedentes de tumoresferas exhibieron niveles altos de LGALS3. Además, revelamos que la GAL3 podría desempeñar un papel crucial como molécula inmunomoduladora en el TME, modulando la inmunosupresión a través de las células T reguladoras (TREGS). Esto se confirmó en muestras tumorales de pacientes, dónde los niveles de expresión altos de LGALS3, se correlacionaron con mayores niveles de TREGS, sugiriendo que los tumores pueden reclutar esta población a través de la GAL3. Posteriormente, se evaluaron los roles pronósticos y diagnósticos de la GAL3 soluble (sGAL3) y otros factores inmunorreguladores (sICOSL, sFGL1, sGAL1, sMICA, sMICB, sCD276) en una cohorte de 94 pacientes con cáncer de pulmón en estadios tempranos resecables (cohorte test). sFGL1, sGAL3 y su combinación mostraron una eficacia diagnóstica óptima para nuestros pacientes. El análisis de supervivencia demostró que, en la sub-cohorte de ADC, los pacientes con niveles altos de sGAL3 experimentaron una supervivencia libre de recaída (SLR) (p=0,048) y una supervivencia global (SG) más corta (p=0,021), mientras que no se observó ninguna asociación en la sub-cohorte de pacientes con carcinoma de células escamosas. El análisis multivariante indicó que sGAL3 podría ser un biomarcador pronóstico independiente para SLR y SG. La expresión génica de nuestro panel de factores inmunoreguladores también se analizó en un grupo independiente de 661 pacientes de TCGA (cohorte de validación), confirmando el valor pronóstico independiente de LGALS3 en la sub-cohorte de ADC para SLR (p=0,021) y SG (p=0,004). El papel diagnóstico, predictivo y pronóstico de estos factores se evaluó en muestras de plasma en el momento basal (PRE) y en la evaluación de la primera respuesta (FR) en una cohorte de 52 pacientes con cáncer de pulmón en estadio avanzado tratados en primera línea con pembrolizumab. sFGL1, sGAL3 y su combinación de nuevo ofrecieron una eficacia diagnóstica óptima para esta cohorte de pacientes. Los niveles de sGAL3 en FR y sMICB en PRE y FR se asociaron con un beneficio clínico en toda la cohorte y en la subcohorte de ADC. sCD276 también se asoció con la respuesta global en toda la cohorte y en la sub-cohorte de ADC. sMICB en FR se identificó como un biomarcador independiente para la supervivencia libre de progresión (SLP) en toda la cohorte y para SLP y SG en la sub-cohorte de ADC. Además, sGAL3 en PRE se encontró como un biomarcador independiente para SLP y SG en toda la cohorte y en FR se identificó como biomarcador independiente para SG en la sub-cohorte ADC. Una disminución en los niveles de sGAL3 en los pacientes en tratamiento se asoció con una reducción en la SG en toda la cohorte. En conclusión, nuestros hallazgos proporcionan información diagnóstica, pronóstica y predictiva relevante del rol de la GAL3 y otros factores inmunoreguladores para los pacientes con cáncer de pulmón y sirven como base para el desarrollo de nuevos biomarcadores y terapias. / [CA] En aquest estudi, busquem profunditzar en l'estudi del microambient immunològic del tumor (TME), el que resultaria en una millor caracterització del context immunològic dels pacients i la recerca de nous biomarcadors en el càncer de pulmó. S'utilitzaren cultius de llarg termini establits a partir de pacients amb càncer de pulmó en etapa primerenca, i línies cel·lulars comercials per a assajos de formació de tumorsferes per a l'enriquiment de cèl·lules mares canceroses i condicions adherents com a control. S'analitzà l'expressió gènica de diversos factors immunoreguladors, i es va observar una major expressió de la majoria d'ells en les tumorsferes en comparació amb les cèl·lules adherents. Juntament la secreció, la Galectina-3 (GAL3 o LGALS3 quan es fa referència a la proteïna o al gen, respectivament) es va seleccionar com la molècula que podria tindre una forta implicació en la modulación del TME. Els anàlisis proteics van confirmar que la GAL3 augmentava consistentment en les tumorsferes de cultius d'adenocarcinoma de pulmó (ADC) i mostrava patrons de localització i expressió diferencial. Les vesícules extracel·lulars precedents de les tumorspheres també van exhibir nivells alts de LGALS3. Vam revelar que la GAL3 podria jugar un paper crucial com a molècula immunomoduladora expressada i secreta en el TME, modulant la immunosupressió a través de les cèl·lules T reguladores (TREGS). Això es va confirmar en mostres tumorals de pacients amb nivells d'expressió elevats de GAL3, que a més tenien majors nivells de TREGS. Posteriorment, es van avaluar els rols pronòstics i diagnòstics de la GAL3 soluble (sGAL3) i altres factors immunoreguladors (sICOSL, sFGL1, sGAL1, sMICA, sMICB, sCD276) en una cohort de 94 pacients amb càncer de pulmó en estadi primerenc (cohort de test). sFGL1, sGAL3 i la seua combinació van mostrar una eficàcia diagnòstica òptima en la nostra cohort. A més, l'anàlisi de supervivència de Kaplan-Meier va demostrar en la subcohort de ADC en estadi primerenc, que els pacients amb nivells alts de sGAL3 van experimentar una supervivència lliure de recaiguda (SLR) (p=0,048) i una supervivència global (SG) més curta (p=0,021), però no en la de carcinoma de cèl·lules escamoses. L'anàlisi multivariant va indicar que sGAL3 podria ser un biomarcador independent del pronòstic per a SG i SLR. L'expressió gènica de tots aquests factors immunoreguladors també es va analitzar en un grup independent de 661 pacients de TCGA (cohort de validació), confirmant el valor pronòstic independent de LGALS3 en la subcohort de ADC per a SLR (p=0,021) i SG (p=0,004). El paper diagnòstic, predictiu i pronòstic d'aquests factors immunoreguladors també es va avaluar en el moment basal (PRE) i en l'avaluació de la primera resposta (FR) en una cohort de 52 pacients amb cáncer de pulmó en estadi avançat tractats en primera línia amb pembrolizumab. sFGL1, sGAL3 i la seua combinació de nou van oferir una eficàcia diagnòstica òptima per als pacients d'aquesta cohort. Els nivells de sGAL3 en FR i sMICB en PRE i FR estaven associats amb un benefici clínic durador en tota la cohort i en la subcohort de LUAD. sCD276 també es va associar amb la resposta global en tota la cohort i en la subcohort de ADC. Un anàlisi de regressió de Cox va identificar sMICB en FR com a biomarcador independent per a la supervivència lliure de progressió (SLP) en tota la cohort i per a SLP i SG en la subcohort de ADC. sGAL3 en PRE es va trobar com a biomarcador independent per a SLP i SG en tota la cohort, i sGAL3 en FR es va identificar com a biomarcador independent per a SG en la subcohort de ADC. Una disminució en FR dels nivells de sGAL3 es va associar amb una reducció en la SG en tota la cohort. En conclusió, els nostres descobriments proporcionen informació rellevant sobre el rol diagnòstic y el pronòstic de la GAL3 y altres factor inmunoreguladors per als pacients amb càncer de pulmó i serveixen com a base per al desenvolupament de nous biomarcadors i teràpies. / [EN] The complex field of immuno-oncology is constantly evolving, driven by cancer heterogeneity and the plasticity of the immune cells participating in this process. In this study we aim to delve deeper into the study of immune tumor microenvironment (TME), which will result in an improved characterization of patient`s immune contexture and the search for new biomarkers in lung cancer. In this thesis, long term patient derived lung cancer cell (PDLCC) and commercial cell lines cultures were employed for sphere-forming assays for cancer stem cells enrichment and adherent conditions for the control counterparts. Gene expression of immune-mediators was analyzed showing that expression levels of most selected genes were higher in tumorspheres compared with the adherent cells counterparts. Together with secretion, Galectin-3 (GAL3 or LGALS3 when protein or gene are referenced, respectively) was selected as the molecule that could have a strong implication in the modulation of TME. Immunoblot, flow cytometry and immunofluorescence analyses confirmed that GAL3 was consistently increased in tumorspheres from lung adenocarcinoma (LUAD) and showed differential localization and expression patterns. Extracelullar vesicles from tumorspheres also exhibited high levels of LGALS3. Next, we revealed that GAL3 could play a crucial role as an immunomodulatory molecule expressed and secreted in the TME, modulating immunosuppression through regulatory T cells (TREGS). This was confirmed in patient's tumor samples, where higher levels of LGALS3 correlated with increased TREGS, suggesting that tumors may be recruiting this population through GAL3. The prognostic and diagnostic roles of soluble GAL3 (sGAL3) and other immune-mediators (sICOSL, sFGL1, sGAL1, sMICA, sMICB, sCD276) were evaluated in a cohort of 94 early-stage lung cancer (test cohort). sFGL1, sGAL3 and its combination yielded optimal diagnostic efficacy in our patient's cohort. A Cox regression analysis revealed an association between sGAL3 and prognosis. Kaplan-Meier plots show that, in the early-stage LUAD subcohort, patients with high levels of sGAL3 experienced shorter relapse-free survival (RFS) (p=0.048) and overall survival (OS) (p=0.021), while no such association was observed in the lung squamous cell carcinoma subcohort. Multivariate analysis indicated that sGAL3 could be an independent biomarker of prognosis for OS and RFS. Gene expression of our panel of immunoregulatory mediators was also analyzed in an independent group of 661 patients from TCGA (validation cohort), confirming the independent prognostic value of LGALS3 in the LUAD subcohort for PFS (p=0.021) and OS (p=0.004). The diagnostic, predictive and prognostic role of these immune-mediators was also evaluated in plasma samples at baseline (PRE) and at first response assessment (FR) in a cohort of 52 advanced-stage lung cancer patients treated in first-line with pembrolizumab. sFGL1, sGAL3 and its combination were also found to have a diagnostic value in this clinical setting. The Mann-Whitney test revealed that sGAL3 at FR and sMICB at PRE and FR were associated with clinical benefit in the entire cohort and in the LUAD subcohort. sCD276 was also associated with objective response in the entire cohort and in the LUAD subcohort. A Cox regression analysis identified sMICB at FR as an independent biomarker for progression-free survival (PFS) in the entire cohort and for PFS and OS in the LUAD subcohort. Furthermore, sGAL3 at PRE was found to be an independent biomarker for PFS and OS in the entire cohort, and sGAL3 at FR was identified as an independent biomarker for OS in the LUAD subcohort. A decreased in the levels of sGAL3 on treatment was associated with reduction of OS in the entire cohort. In conclusion, our findings provide relevant prognostic and predictive information on the role of GAL3 and other immune-mediators for lung cancer patients and served as the basis for developing new biomarkers and therapies. / This thesis was supported by the following Spanish institutions: Centro de Investigación Biomédica en Red Cáncer (Project CB16/12/00350); Fondo de Investigación Sanitaria-Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Projects PI15/00209, PI15/00753, PI18/00266 and IFEQ21/00194); Fundación Arnal Planelles; Generalitat Valenciana y Fondo Social Europeo (Project ACIF/2018/275): ERA-NET EURONANOMED III (Project METASTARG JTC 2018-045) / Torres Martínez, S. (2024). Characterization of Tumor Cells and Immune Microenvironment Interactions in Non Small Cell Lung Cancer. Translational implications [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203659

[ES] A pesar de los nuevos avances en el tratamiento del cáncer de pulmón, su tasa de incidencia y mortalidad siguen en cabeza en todo mundo. Concretamente, el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa casi el 85% de todos los cánceres de pulmón, siendo su supervivencia a 5 años muy reducida. En base a dicho escenario, el objetivo principal de este trabajo es el de caracterizar de manera exhaustiva los exosomas secretados por las células del CPNM. Se sabe que estas microvesículas están involucradas en números procesos celulares, por lo que pueden contener gran cantidad de información acerca de las características moleculares del tumor. Para ello se han empleado cultivos primarios y líneas comerciales crecidas en diferentes condiciones, así como muestras de sangre periférica obtenida de los pacientes con CPNM. Un primer screening llevado a cabo en los exosomas secretados in vitro, ha permitido obtener un gran número de mRNAs y miRNAs relacionados con diferentes procesos biológicos y vías de señalización. Además, algunos genes como FDFT1 y SNAI1 han destacado por su sobreexpresión en exosomas procedentes de las células crecidas en formación de tumoresferas (modelos 3D), las cuales están enriquecidas en población de células madre tumorales. A su vez, otros marcadores presentes en el interior de estas microvesículas, se han mostrado relacionados con dos de los subtipos histológicos más frecuentes: adenocarcinoma (LUAD) y carcinoma escamoso (LUSC). Posteriormente, para validar los hallazgos obtenidos en exosomas, los marcadores más significativos fueron analizados in silico en una cohorte de muestras de tejido, compuesta por 661 pacientes con CPNM (TCGA database). Estos resultados han revelado una asociación entre la expresión del gen SNAI1 y la supervivencia de estos pacientes (OS y RFS p<0.05). Además, los genes XAGE1B, SEPP1 y TTF-1 (previamente determinados en exosomas), mantienen una relación significativa con el grupo de pacientes LUAD; mientras que CABYR, RIOK3 y CAPRIN1 se mantienen sobrexpresados en LUSC (Mann-Whitney test p<0.05). Estos marcadores también se han analizado en una cohorte de 186 pacientes con CPNM procedentes del Hospital General Universitario de Valencia, donde se corroboró la asociación de SNAI1 con la supervivencia de los pacientes en estadios tempranos (RFS en pacientes LUAD, p<0.05), así como la sobreexpresión de CABYR y RIOK3 en pacientes LUSC, y de XAGE1B y TTF-1 en LUAD. Por otra parte, el aislamiento de los exosomas presentes en la sangre periférica de pacientes en estadios avanzados, ha permitido identificar otros marcadores asociados a caracterísiticas clínico-patológicas relevantes. A su vez, el contenido de estas microvesículas ha sido empleado para la detección de mutaciones génicas ligadas al manejo clínico del CPNM. En resumen, los resultados obtenidos en este trabajo ponen de manifiesto el potencial de los exosomas como fuente de biomarcadores para el estudio de las diferentes etapas de desarrollo del CPNM. Estas microvesículas ofrecen una visión completa y en tiempo real, de las características de la enfermedad, pudiendo ser aisladas de forma repetida y mediante técnicas mínimamente invasivas. / [CA] A pesar dels avanços recents en el tractament del càncer de pulmó, les seues taxes d'incidència i mortalitat continuen sent altes a nivell mundial. Concretament, el càncer de pulmó de cèl·lules no petites (CPNM) representa gairebé el 85% de tots els càncers de pulmó, amb una taxa de supervivència a 5 anys molt limitada. Donat aquest escenari, l'objectiu principal d'aquest estudi és caracteritzar de manera exhaustiva els exosomes secretats per les cèl·lules de CPNM. Aquestes microvesícules estan involucrades en nombrosos processos tumorals i poden contenir una gran quantitat d'informació sobre les característiques moleculars de la malaltia. Per aconseguir-ho, es van utilitzar cultius primaris i línies cel·lulars (cultiu en diferents condicions), juntament amb mostres de sang perifèrica obtingudes de pacients amb CPNM. Un cribratge inicial en exosomes secrets in vitro va permetre identificar una quantitat significativa de mARNs i miARNs relacionats amb diversos processos biològics i vies de senyalització. A més, alguns gens com FDFT1 i SNAI1 van destacar per la seua sobreexpressió en exosomes derivats de cèl·lules crescuts en formació de tumorsferes (models 3D), que estan enriquides en poblacions de cèl·lules mare tumorals. A més, s'han trobat marcadors en aquestes microvesícules associats amb dos dels subtipus histològics més comuns: adenocarcinoma (LUAD) i carcinoma escamós (LUSC). Posteriorment, per validar els resultats obtinguts en exosomes, es van analitzar in silico els marcadors més significatius en una cohort de teixit de CPNM de la base de dades TCGA. Aquests resultats van revelar una associació entre l'expressió del gen SNAI1 i la supervivència dels pacients (OS i RFS, p <0,05). A més, l'expressió dels gens XAGE1B, SEPP1 i TTF-1 (prèviament identificats en exosomes) va mantenir una relació significativa amb el grup LUAD, mentre que CABYR, RIOK3 i CAPRIN1 van continuar sobreexpressats en els pacients de LUSC (prova de Mann-Whitney, p <0,05). Aquests marcadors també es van analitzar en una cohort de 186 pacients amb CPNM de l'Hospital General Universitari de València, on es va confirmar l'associació de l'expressió de SNAI1 i la supervivència dels pacients en estadi precoç (RFS en pacients de LUAD, p <0,05), així com la sobreexpressió de CABYR i RIOK3 en pacients de LUSC, i de XAGE1B i TTF-1 en LUAD. D'altra banda, els exosomes presents en mostres de sang de la cohort d'estadis avançats van permetre la identificació d'altres biomarcadors associats a característiques clíniques rellevants dels pacients. A més, la càrrega exosomàtica també es va utilitzar per detectar mutacions genètiques relacionades amb el tractament clínic del CPNM. En resum, els resultats obtinguts en aquesta tesi destaquen el potencial dels exosomes com a font de biomarcadors per a l'estudi de les diferents etapes del desenvolupament del CPNM. Aquestes microvesícules ofereixen una visió completa i en temps real de les característiques moleculars de la malaltia i poden ser obtingudes de manera repetida i amb una mínima invasió. / [EN] Despite recent advancements in lung cancer treatment, its incidence and mortality rates remain high worldwide. Specifically, non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for nearly 85% of all lung cancers, with a 5-year survival rate of 20%. Given this scenario, the primary objective of this study is to comprehensively characterize the exosomes secreted by NSCLC cells. These microvesicles are known to be involved in numerous tumoral processes, potentially containing a wealth of information about the molecular characteristics of the disease. To achieve this, primary cultures and cell lines, along with peripheral blood samples obtained from NSCLC patients were used. An initial screening in exosomes secreted in vitro allowed the identification of a significant number of mRNAs and miRNAs, related to various biological processes and signaling pathways. Moreover, some genes such as FDFT1 and SNAI1 stood out due to their overexpression in exosomes derived from cells grown in tumorspheres formation (3D models), which are enriched in cancer stem cell population. Additionally, markers found within these microvesicles were associated with two of the most common histological subtypes: adenocarcinoma (LUAD) and squamous cell carcinoma (LUSC). Subsequently, to validate the findings seen in exosomes, the most significant markers were analyzed in silico in an NSCLC tissue cohort from the TCGA database. These results revealed an association between the expression of SNAI1 and patient survival (OS and RFS, p<0.05). Furthermore, XAGE1B, SEPP1, and TTF-1 expression (previously identified in exosomes) maintained a significant relationship with the LUAD group, while CABYR, RIOK3, and CAPRIN1 remained overexpressed in LUSC patients (Mann-Whitney test, p<0.05). These markers were also analyzed in a cohort of 186 NSCLC patients from the University General Hospital of Valencia. The association of SNAI1 expression and the survival of early-stage patients (RFS in LUAD patients, p<0.05) was confirmed, as well as the overexpression of CABYR and RIOK3 in LUSC patients, and of XAGE1B and TTF-1 in LUAD. Furthermore, exosomes present in blood samples of the advanced-stage cohort, allowed the identification of other biomarkers associated with clinically relevant characteristics of the patients. Moreover, exosomal cargo was also used to detect gene mutations related to the clinical management of NSCLC. In summary, the results obtained in this thesis highlight the potential of exosomes as a source of biomarkers for the study of the different stages of NSCLC development. These microvesicles offer a comprehensive and real-time view of the disease's molecular features and can be obtained repeatedly and in a minimally invasive way. / Duréndez Sáez, ME. (2024). Liquid Biopsy in non-small cell lung cancer: exosomes as a tool for the study of biomarkers [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203438