Les récepteurs des cytokines à structure α-hélicoïdale sont pour la plupart composés de deux sous-unités transmembranaires associées aux protéine tyrosine kinases de la famille Janus (Tyk2, Jak1, Jak2 et Jak3). La fixation de la cytokine à son récepteur induit une dimérisation des sous-unités ce qui entraîne l'activation des Jak par transphosphorylation. Les Jaks ainsi activées phosphorylent les facteurs de transcription STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) qui transloquent dans le noyau. Les tyrosine kinases Jak présentent en position N-terminale un domaine FERM (4.1-ezrin-radixin-moesin), suivi par un domaine dit 'SH2-like' et deux domaines kinases: un domaine dit 'kinase-like' (KL) à fonction régulatrice et un domaine catalytique de type tyrosine kinase en position C-terminale. L'association au récepteur se fait par la région N-terminale. Le laboratoire s'intéresse particulièrement au récepteur de l'interféron de type I (IFNα/β) composé de deux chaînes, IFNAR1 et IFNAR2, et aux kinases Tyk2 et Jak1 auxquels elles s'associent respectivement. La première partie de ma thèse a porté sur l'étude d'un nouveau partenaire de Tyk2, la protéine Pot1 (Partner of Tyk2) et de son rôle potentiel dans la voie de signalisation de l'IFNα. Plusieurs ADNc partiels de Pot1 avaient été isolés dans le laboratoire par criblage double-hybride utilisant comme appât le domaine FERM de Tyk2. Un ADNc complet de Pot1 avait été reconstruit donnant lieu à une protéine de 1003 acides aminés (aa). L'interaction entre cette protéine et les domaines FERM de Tyk2 et de Jak1 avait été confirmée par des expériences in vitro. L'analyse par northern blot de Pot1 montre une expression faible dans plusieurs tissus. L'étude de la localisation de la protéine Pot1 surexprimée avait montré une localisation cytoplasmique au niveau de vésicules non identifiées. Un des aspects de mon travail sur Pot1 a été de déterminer si l'ADNc reconstruit dans le laboratoire, appelé 'lab cDNA', correspond à un vrai transcrit. En effet, les banques de données recensent plusieurs autres transcrits issus du gène Pot1, avec une portion 3' commune et identique au 'lab cDNA', mais une région 5' divergente. Ces transcrits donnent lieu à deux isoformes ne possédant pas les 200 aa ou 250 aa en position N-terminale par rapport à la protéine de référence codée par le 'lab cDNA'. De plus, l'unique protéine murine (mPot1) recensée dans les banques de données ne possède pas les 100 aa en N-terminal par rapport à la protéine humaine de référence. Pour analyser l'expression de différents transcrits, j'ai amplifié l'ADNc de cellules humaines HEK293T avec des primers me permettant de 12 distinguer les différents transcrits. Ces expériences ont permis de confirmer l'expression du transcrit correspondant au 'lab cDNA' et codant pour une isoforme de 1003 aa (112 kDa). Par la suite j'ai étudié la localisation de la protéine Pot1 murine dans les cellules surexprimant mPot1. J'ai observé que mPot1 se trouve dans des vésicules cytoplasmiques, tout comme la protéine humaine, et semble être associée à la membrane de ces vésicules. Toutefois, nous ne pouvons pas écarter la possibilité de localisation inadéquate dû à la forte surexpression de mPot1. Il sera nécessaire de confirmer cette observation par l'analyse de la localisation de la protéine endogène. A ce jour les anticorps disponibles ne permettent pas sa détection. Afin d'évaluer le rôle de Pot1 dans la voie de signalisation de l'IFNα, j'ai mesuré la réponse à l'IFNα de cellules déplétées en Pot1 par interférence à l'ARN. J'ai mesuré la phosphorylation des protéines STAT et l'induction d'un gène rapporteur. Ces expériences ont montré que, dans ce système, la diminution de l'expression de Pot1 n'a pas d'effet sur la signalisation par l'IFNα. Afin d'éclairer la fonction de Pot1, de nouveaux interacteurs de Pot1 ont été recherchés par criblage double-hybride. Parmi les 14 protéines identifiées à haut niveau de confiance, nous nous sommes particulièrement intéressés à GIT1 (G protein-coupled receptor kinase interactor), une protéine adaptatrice impliquée dans de nombreux processus cellulaires, tels que l'internalisation de récepteurs, la signalisation induite par l'EGF (epidermal growth factor) et l'angiotensine II ainsi que la migration cellulaire. Afin d'analyser le rôle éventuel de GIT1 dans la signalisation par l'IFNα, j'ai mesuré plusieurs paramètres (internalisation des sous-unités du récepteur, phosphorylation des STAT, induction d'un gène rapporteur) dans des cellules surexprimant ou déplétées en GIT1. Les résultats obtenus ont écarté l'hypothèse d'une implication de GIT1 dans la réponse transcriptionnelle à l'IFNα. La deuxième partie de mon travail a porté sur l'étude de la mutation V678F introduite dans la protéine Tyk2.Cette substitution est située dans le domaine KL et correspond à la mutation V617F de Jak2, décrite comme étant à l'origine de la Polycythemia vera. La P. vera, ou maladie de Vaquez, est une maladie myéloproliférative caractérisée par une hyperproduction d'érythrocytes et leur hypersensibilité à l'érythropoiétine (Epo). Il a été montré que la mutation V617F induit une augmentation de l'activité kinase de base de Jak2. De même, Jak2V617F induit une prolifération indépendante de facteurs de croissance des cellules murines BaF3, confirmant son potentiel transformant. Toutefois, il a été montré que 13 Jak2V617F nécessite la coexpression d'un récepteur homodimérique, tel que récepteur à l'Epo, pour exercer une activité transformante maximale. Les questions que nous nous sommes posées sont les suivantes: 1) quel est l'effet de la substitution V678F sur l'activité catalytique de Tyk2? 2) quel est l'effet du mutant Tyk2V678F sur la signalisation par l'IFNα? 3) le mutant Tyk2V678F aurait-il un effet plus marquant ou délétère s'il est placé dans un contexte de récepteur homodimérique? A cet effet, nous avons établi, à partir de cellules Tyk2-déficientes, des clones stables exprimant la protéine sauvage ou mutante. Nos résultats montrent que la mutation V678F augmente in vivo et in vitro la capacité de Tyk2 à s'auto-phosphoryler. Par la suite, j'ai mesuré la phosphorylation sur tyrosine des protéines STAT en réponse à l'IFNα. Aucune différence de niveau de phosphorylation de STAT1/2/5 n'a pu être décélée entre les cellules exprimant la protéine sauvage et les cellules exprimant le mutant Tyk2V678F. Par contre, j'ai mis en évidence une phosphorylation basale de STAT3 augmentée en présence de Tyk2V678F. Pour déterminer si cette phosphorylation basale de STAT3 corrèle avec une augmentation de son activité transcriptionnelle, j'ai analysé l'activité transcriptionelle de STAT3 à l'aide d'un gène rapporteur. Les résultats montrent que, dans les cellules exprimant le mutant Tyk2V678F, STAT3 possède une activité transcriptionelle augmentée. Afin d'étudier l'effet du mutant Tyk2V678F placé dans un contexte de récepteur homodimérique, j'ai utilisé des cellules exprimant un récepteur chimérique comprenant l'ectodomaine du récepteur à l'Epo fusionné aux régions transmembranaire et cytoplasmique de la chaîne IFNAR1 (EpoR/R1). A l'aide de ces cellules, j'ai pu confirmer que l'expression du mutant Tyk2V678F engendre une phosphorylation basale de STAT3. De plus, dans ce contexte de récepteur homodimérique, suite à stimulation par le ligand Epo, le mutant Tyk2V678F induit une augmentation ultérieure de la phosphorylation de STAT1, STAT3 et STAT5. Nous avons aussi voulu comparer directement le niveau de phosphorylation de Tyk2V678F et de STAT3 dans différents contextes de récepteurs. Les résultats obtenus montrent que la protéine Tyk2V678F est plus phosphorylée basalement dans les cellules exprimant le récepteur homodimérique EpoR/R1. Ceci est probablement la conséquence d'une transphosphorylation plus efficace de deux kinases mutantes juxtaposées. Par contre, la phosphorylation de STAT3 ne corrèle pas directement avec le niveau d'expression du mutant Tyk2V678F, ce qui suggère une absence de corrélation linéaire entre l'activation de Tyk2 et et de STAT3. 14 En conclusion, nous avons montré que la mutation V678F augmente l'activité catalytique de Tyk2. De plus, le mutant acquiert la capacité de phosphoryler STAT3 et ceci en absence du ligand. Cependant, le mutant Tyk2V678F n'affecte pas la réponse à l'IFNα en terme de phosphorylation de Jak1, STAT1 et STAT2. Ces résultats démontrent une interaction fonctionnelle étroite entre Tyk2 et STAT3. Etant donné que STAT3 constitutivement actif exerce des propriétés oncogéniques et que STAT3 est phosphorylé dans de nombreux cancers, il est possible de prédire aussi un rôle oncogénique pour Tyk2 constitutivement active. Récemment, il a été suggéré qu'un polymorphisme de Tyk2, P1104A, pourrait être associé à la présence de tumeurs. Cette substitution est située dans le domaine tyrosine kinase au sein d'une hélice α présente uniquement dans les membres de la famille Jak. Nous avons introduit cette mutation dans Tyk2 et analysé son effet sur l'activité kinase. Les résultats montrent que le mutant Tyk2P1104A est incapable de s'autophosphoryler in vitro. Toutefois, en réponse à l'IFNα, aucune différence du niveau de phosphorylation de STAT1/2 /3 n'est décélée dans les cellules exprimant Tyk2P1104A par rapport aux cellules exprimant la protéine sauvage. Ces résultats suggèrent que la mutation P1104A abolit la capacité autophosphorylante de l'enzyme, mais n'affecte pas l'activité enzymatique induite par l' l'IFNα envers d'autres substrats in vivo. Ces résultats préliminaires devront être renforcés par des études plus approfondies de l'effet de la mutation P1104A sur la fonction que Tyk2 exerce au sein du récepteur de l'IFNα/β ainsi qu'au sein d'autres récepteurs de cytokines de la réponse immune.

Obesity results from an excess of adipose tissue and is a major risk factor for type 2 diabetes, cardiovascular disease, and cancer. Adipose tissue exists in two main forms: white adipose tissue (WAT), which stores energy as triglycerides, and brown adipose tissue (BAT), which dissipates stored energy as heat. White adipose tissue is composed of several subcutaneous and visceral depots, each possessing distinct molecular and functional characteristics. Brown-like adipocytes can emerge in WAT depots in response to cold or beta-adrenergic stimulation. These cells have been called “beige” or “brite” (brown-in-white) cells. The reduction of obesity in mice treated with beta-adrenergic agonists is correlated with the emergence of beige cells. Beige cell development occurs most readily in subcutaneous depots, and to the least extent in visceral depots. Understanding the molecular mechanisms underlying beige cell development in different WAT depots may be important in discovering new therapies against obesity and related diseases. Our lab has previously discovered that Tyrosine Kinase 2 (Tyk2), an important mediator of cytokine signaling, promotes the development of classical brown adipose tissue. Due to the lack of functional BAT, Tyk2-knockout (Tyk2-/-) mice become grossly obese with age and develop several symptoms of the metabolic syndrome. In the present study, we have found a potential role of Tyk2 in the development of beige cells. Here, we show that mRNA expression of BAT-selective genes (UCP1, Cidea, Cox8b, and Elovl3) is significantly reduced in subcutaneous WAT of Tyk2-knockout (Tyk2-/-) mice compared to wild-type mice. Surprisingly, BAT-selective genes are induced in Tyk2-/- subcutaneous WAT by acute starvation. These findings suggest that Tyk2 is required for the development of beige cells under ambient conditions, and that the need for Tyk2 in beige cell development is bypassed during nutritional stress, a stimulus of the sympathetic response.

The production of Nitric Oxide (NO) under physiological conditions has beneficial roles in acting as a key signaling component of many biological processes as well as having an anti-microbial effect. However its effects following excess production by the inducible NO pathway is potentially detrimental in the pathogenesis of chronic inflammation including sepsis and several other inflammatory diseases. Understanding the mechanisms that regulate the expression of the inducible nitric oxide synthase (iNOS) responsible for producing the excessive amounts of NO in disease states is therefore critical. In this regards, experiments were carried out to identify the signaling pathways that may mediate this process, focusing specifically on the JAK/STAT cascade. The reason for selecting the latter is because our research group, amongst others, has carried out extensive work investigating other signaling pathways, including the mitogen activated kinases (MAPK). Moreover, studies have also been carried out in an attempt to identify the critical role of JAK/STAT signaling for iNOS induction. These studies however failed to conclusively demonstrate whether, as with the MAPKs, the JAK/STATs may also play an essential role. Furthermore there is indeed controversy in the literature with researchers unable to agree whether expression of iNOS does require JAK/STAT activation. Thus, the aim of the project described in this thesis was to establish unequivocally whether activation of the JAK/STATs preceeds induction of iNOS. The studies were extended to L-arginine transport as well because the latter is widely reported to be induced in parallel with iNOS and substrate supply to iNOS may be critical for sustained NO production. Changes in transporter activity as well as their expression profiles were assessed. All experiments were carried out in either rat aortic smooth muscle cells (RASMCs) or in the J774 macrophage cell line. These cell types were selected because RASMCs are one of the prime targets for induced NO production in vascular inflammation and the macrophages are involved in host defence, acting in part through NO production. To establish the role of JAK/STATs, pharmacological and molecular approaches were used. Pharmacologically, two inhibitors were used and these were AG490 and JAK inhibitor I. The former is reported to be a selective JAK2 inhibitor and the other blocks all known JAK proteins. The potential of the GTPases to regulate the induction of iNOS was also examined using selective inhibitor known to regulate these proteins. In addition to these drugs, siRNA targeting JAK2 was also exploited and western blotting was extensively used to detect expression of various proteins including iNOS, native and phosphorylated JAK2 and TYK2. Changes in iNOS activity was monitored by determining nitrite production using the Griess assay and L-arginine transport was monitored using tritiated arginine (L-[3H]arginine). RASMCs were treated with a combination of LPS (100 µg/ml) and IFN- (100 U/ml) and the macrophages with LPS (1 µg/ml) to induce iNOS and transporter activity. Consistent with previous reports, the above treatment of both cell types resulted in the expression of iNOS, production of NO and enhanced transport of L-arginine. These effects were not affected by AG490 but blocked by JAK inhibitor I. Furthermore, although both cell types expressed the key JAKs (JAK2 and TYK2), neither of these proteins were phosphorylated under conditions of induced NO production. Moreover, siRNA experiments showed that JAK2 expression could be abolished without any significant change in NO production, confirming that at least JAK2 may not be required for this process. Whether TYK2 is involved still remains to be resolved as the phosphor-protein could not be detected. However the conclusive siRNA knockdown studies could not be carried out due to time and cost constraints. Apart from iNOS and NO production, changes in induced L-arginine transport were also not significantly affected under the experimental conditions described above suggesting that like with iNOS, induction of L-arginine transport is independent of at least JAK2. Interestingly however, STAT-1 was phosphorylated and this was blocked by JAK inhibitor I but not AG490. Thus, STAT-1 activation may be essential but its activation may be independent of the JAKs. One possible alternate upstream activator of STAT-1 may be the GTPases. Indeed these proteins have been indicated to phosphorylate STAT-1 independent of the JAKs. However, in this project, inhibition of the GTPase pathway enhanced NO production and L-arginine transport suggesting that the GTPases downregulate these processes. In conclusion, the studies carried out in this thesis have shown that induction of iNOS, NO production and L-arginine transport in both RASMCs and J774 macrophages are independent of JAK2 but require STAT-1 activation which may be phosphorylated independently of the JAKs. The role of other JAKs such as TYK2 although unlikely, will need to be resolved using a more specific approach such as siRNA.