Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung des Typ III-Sekretionssystem (T3SS) bei Bradyrhizobium japonicum USDA110. Im ersten Teil der Arbeit wird die Regulation der Gene des Typ III-Sekretionssystems in B. japonicum beschrieben. Dabei wurde die tts-Box, als neuartige Promotorsequenz für die Gene des T3SS und sekretierter Proteine charakterisiert. Mittels Expressionsanalysen konnte die Aktivität von 34 Genregionen downstream der tts-Boxen in Abhängigkeit von Flavonoiden gezeigt werden. Auch in Symbiose, in frühen Infektionsstadien und in reifen Knöllchen von verschiedenen Wirtspflanzen wurde die Expression ausgewählter Gene nachgewiesen. Der zweite Teil der Arbeit widmet sich der Analyse der sekretierten Proteine von B. japonicum. Über 100 Proteine wurden im Überstand von Kulturen nachgewiesen, wovon 68 Proteine durch Massenspektrometrie identifiziert werden konnten. Zusätzlich wurden 12 Proteine identifiziert, die in Abhängigkeit des T3SS sekretiert werden. Im dritten Teil der Arbeit wurden die sekretierten Proteine NopE1 und NopE2 näher untersucht und als bona-fide Effektoren nachgewiesen. Die rekombinant produzierten Effektoren NopE1 und NopE2 wurden biochemisch charakterisiert. Für die Domäne unbekannter Funktion (DUF1521) wurde eine spezifische Selbstspaltungsaktivität in Gegenwart von Calcium gezeigt. Nachweislich ist diese Aktivität relevant für die Symbiose. Somit konnte der Proteindomäne mit bisher unbekannter Funktion eine biochemische Funktion zugeordnet werden. Im letzten Teil der Arbeit wurden die Untersuchungen an dieser Domäne auf weitere Proteine ausgedehnt. Für das putative Effektorprotein VIC_001052 aus V. coralliilyticus, dem Verursacher der Korallenbleiche bei Pocilla damicornis, wurde ebenfalls die in vitro Calcium-induzierte Selbstspaltungsaktivität gezeigt. Aufgrund der konservierten Selbstspaltungsfunktion wurde die DUF1521-Domäne in metal-ion inducible autocleavage- (MIIA)- Domäne umbenannt.:I. Einleitung Rhizobien-Leguminosen-Interaktion Proteinsekretionssysteme II. Zusammenfassung der Forschungsergebnisse 1. Untersuchung der Expression des Typ III-Sekretionssystems in Knöllchen und Analyse des tts-Box-Promotors 2. Identifizierung sekretierter Proteine von Bradyrhizobium japonicum 3. Untersuchung der sekretierten Proteine NopE1 und NopE2 4. Untersuchung von konservierten MIIA-Domänen III. Diskussion IV. Zusammenfassung V. Literaturverzeichnis VI. Anhang VII. Publikationen

Das Typ III Sekretionssystem (T3SS) ist ein Proteinkomplex den Gramnegative Bakterien nutzen um in einem Schritt Effektorproteine (Effektoren) aus dem Zytosol über die Doppelmembran zu sekretieren. Für viele Bakterien ist das T3SS ein essenzieller Virulenzfaktor, der es ihnen erlaubt mit ihrem Wirt zu interagieren und diesen zu manipulieren. Charakteristisch für das T3SS ist die strukturelle Komponente, der Nadelkomplex. Dieser ähnelt strukturell einer Spritze, deren Basalkörper die bakteriellen Membranen und das Periplasma durchspannt und einer Nadel, die vom Basalkörper aus dem Bakterium ragt. Basierend auf dem Modell einer Spritze wird angenommen, dass Effektoren entfaltet und anschließend durch Basalkörper und Nadelkanal sekretiert werden. Trotz der kontinuierlichen Forschung an T3SS entbehrt dieses Modell einer experimentellen Grundlage und der Mechanismus ist nicht vollständig erklärt. Ziel der Arbeit war es, eine experimentelle Basis für den Sekretionsmechanismus des T3SS zu schaffen. Um zu verstehen, wie das T3SS Effektoren sekretiert, wurden zunächst Fusionsproteine konstruiert, welche aus einem Effektor und einem stabil gefalteten Knotenprotein bestehen. Aufgrund des Knotens in der Fusion ist davon auszugehen, dass dieser während der Sekretion nicht entfalten kann. Die Effektordomäne wird sekretiert während der Knoten im Kanal verbleibt und diesen verstopft. Nach unseremWissen ist diese Arbeit die erste Visualisierung von Effektorfusionen an isolierten Nadelkomplexen. Die Effektorfusion wird N-terminal voran durch den Kanal sekretiert, wobei der Kanal das Substrat umschließt und gegen Proteasen und chemische Modifikationen abschirmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern eine Grundidee der Funktionsweise des T3SS und liefern eine vielversprechende Strategie für in situ-Strukturanalysen. Dieser Ansatz lässt sich auch auf andere Proteinsekretionssysteme übertragen, bei welchen Substrate vor dem Transport entfaltet werden müssen. / The Type III Secretion System (T3SS) is a complex used by Gram-negative bacteria to secrete effector proteins from the cytoplasm across the bacterial envelope in a single step. For many pathogens, the T3SS is an essential virulence factor that enables the bacteria to interact with and manipulate their respective host. A characteristic structural feature of the T3SS is the needle complex (NC). The NC resembles a syringe with a basal body spanning both bacterial membranes and a long needle-like structure that protrudes from the bacterium. Based on the paradigm of a syringe-like mechanism, it is generally assumed that effectors are unfolded and secreted from the bacterial cytoplasm through the basal body and needle channel. Despite extensive research on T3SS, this hypothesis lacks experimental evidence and the mechanism of secretion is not fully understood. This work aimed to provide an experimental basis for the model of the T3SS mechanism. In order to elucidate details of the effector secretion mechanism, fusion proteins consisting of an effector and a bulky protein containing a knotted motif were generated. It is assumed that the knot cannot be unfolded during secretion of the chimera. Consequently, these fusions are accepted as T3SS substrates but remain inside the NC channel and obstruct the T3SS. This is, to our best knowledge, the first time effector fusions have been visualized together with isolated NCs and it demonstrates that effector proteins are secreted directly through the channel with their N-terminus first. The channel encloses the substrate and shields it from a protease and chemical modifications. These results corroborate an elementary understanding of how the T3SS works and provide a powerful tool for in situ-structural investigations. This approach might also be applicable to other protein secretion systems that require unfolding of their substrates prior to secretion.

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