HINTERGRUND: Eine inadäquate Aktivierung von Typ-1-IFN kann in der Entstehung von Autoimmunität und Autoinflammation resultieren. Die einer solchen dysregulierten Typ-1-IFN-Achse zu Grunde liegenden Störungen werden primär über das angeborene Immunsystem vermittelt. Krankheitsbilder, die durch eine chronische Typ-1-IFN-Aktivierung bedingt sind, werden daher unter dem Begriff Typ-1-Interferonopathien zusammengefasst. Diese Gruppe seltener, genetisch bedingter Erkrankungen zeichnet sich durch eine große symptomatische Bandbreite aus, wobei vor allem neurologische und kutane Manifestationen im Vordergrund stehen. Bisher aufgeklärte Pathomechanismen dieser systemisch-entzündlichen Erkrankungen haben einen Einblick in neue zellintrinsische Mechanismen gegeben, die zu einer Typ-1-IFN-Aktivierung führen und auf Störungen im Metabolismus und der immunologischen Erkennung intrazellulärer Nukleinsäuren beruhen. Daraus ergeben sich auch Erkenntnisse hinsichtlich des Einsatzes einer immunmodulatorischen Therapie zur kausalen Behandlung von Typ-1-Interferonopathien. FRAGESTELLUNG: Typ-1-Interferonopathien gehören zu den genetisch bedingten, seltenen Erkrankungen. Eine Diagnosestellung ist jedoch aufgrund mangelnder Kenntnisse über die Krankheitsursache häufig nicht möglich, sodass kausale Therapieansätze für viele Patienten nicht existieren. Die Aufklärung der genetischen Ursache solcher Erkrankungen ist demnach von essentieller Bedeutung. Auch die hier untersuchten Familien leiden an bisher nicht molekulargenetisch diagnostizierten Krankheiten, deren Phänotyp jedoch eine Typ-1-Interferonopathie vermuten lässt. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel dieser Arbeit, bisher unbekannte Gene zu identifizieren und zu charakterisieren, welche Krankheitsbilder mit chronischer Typ-1-IFN-Aktivierung verursachen. MATERIAL UND METHODEN: Anhand klinischer Daten wurden zunächst die Krankheitsbilder der zwei betroffenen Familien charakterisiert und hinsichtlich der Gemeinsamkeiten mit bekannten Typ-1-Interferonopathien untersucht. Zudem wurde das Vorliegen einer chronischen Typ-1-IFN-Aktivierung bei den erkrankten Familienmitgliedern untersucht. Mit Hilfe von Exomanalysen und anschließenden bioinformatischen Analysen wurde nach dem ursächlichen Krankheitsgen gesucht. Die in diesem Rahmen in der Familie 1 nachgewiesene STING-Mutation wurde unter Verwendung von molekularbiologischen sowie zellbiologischen Analysen eingehend untersucht und zudem ihre Konsequenzen auf die IFN-Achse und die Stabilität des STING-Dimers mittels Strukturmodellierungen charakterisiert. Hinsichtlich der Aufklärung der genetischen Ursache der Erkrankung der Familie 2 wurde ebenfalls eine Exomanalyse durchgeführt. Da dabei jedoch keine Mutation identifiziert werden konnte, erfolgte eine Analyse differentiell exprimierter Transkripte mit Hilfe von Transkriptomdaten von Fibroblasten gesunder Kontrollen im Vergleich zu erkrankten Familienmitgliedern der Familie 2. ERGEBNISSE: Im Verlauf dieser Arbeit konnte in der Familie 1 mit einem familiären Chilblain Lupus eine kausale heterozygote Mutation im STING-Gen identifiziert werden. Diese bisher nicht beschriebene Mutation bedingt den Aminosäureaustausch Gly166Glu (G166E) im hochkonservierten Dimerinterface des STING-Proteins. Strukturmodelle ergaben Hinweise auf strukturverändernde Eigenschaften der Mutation G166E, die das STING-Dimer konstitutiv aktivieren. Dies konnte experimentell bestätigt werden, da in den peripheren Blutzellen der Patienten eine erhöhte IFN-Signatur nachgewiesen werden konnte und Patientenfibroblasten eine erhöhte Produktion von IFN-β sowie eine vermehrte Phosphorylierung von IRF3 zeigten. Um den Einfluss einer therapeutischen Immunmodulation über eine JAK-Inhibition zu untersuchen, wurden zwei Erkrankte der Familie 1 mit dem JAK-Inhibitor Tofacitinib über einen Zeitraum von 17 Tagen behandelt. Es konnte dabei in vivo eine signifikant reduzierte IFN-Signatur nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Exomanalyse konnte in der konsanguinen Familie 2 mit einem AGS-ähnlichen Phänotyp keine kausale Mutation identifiziert werden. Es zeigte sich zudem, dass in den Patientenzellen keine erhöhte IFN-Signatur sowie keine erhöhte IFN-β Produktion nachweisbar waren. Die vergleichende Transkriptomanalyse ergab keine auffällige differentielle Expression von Genen des Aminosäure-Metabolismus, der Seneszenz, des Zellzyklus, der DNA-Schadensantwort und DNA-Reparatur sowie von Genen immunologischer Prozesse. Allerdings wurde die vollständig fehlende Expression der Gene COL6A1 und COL6A2 in den Patientenzellen nachgewiesen. SCHLUSSFOLGERUNG: Die identifizierte STING-Mutation der Familie 1 führt zu einer chronischen Aktivierung der Typ-1-IFN-Achse und ist folglich als Gain-of-function Mutation anzusehen. Die Behandlung mit dem immunmodulierenden JAK-Inhibitor Tofacitinib führt zu einer Verminderung der IFN-Signatur und bietet somit einen vielversprechenden Ansatz für eine kausale Therapie. Weiterführende Untersuchungen, vor allem bezüglich der Langzeiteffekte, sind hier jedoch noch erforderlich. Die Erkrankung der Familie 2 ist dagegen vermutlich nicht den Typ-1-Interferonopathien zuzuordnen. Vielmehr scheint es zum jetzigen Zeitpunkt wahrscheinlich, dass eine Mutation innerhalb eines regulatorischen Elements, das die Expression der Gene COL6A1 und COL6A2 reguliert, für den Phänotyp der Erkrankten verantwortlich ist. Weiterführende Untersuchungen sind hier zukünftig von großem Interesse.

HINTERGRUND: Eine inadäquate Aktivierung von Typ-1-IFN kann in der Entstehung von Autoimmunität und Autoinflammation resultieren. Die einer solchen dysregulierten Typ-1-IFN-Achse zu Grunde liegenden Störungen werden primär über das angeborene Immunsystem vermittelt. Krankheitsbilder, die durch eine chronische Typ-1-IFN-Aktivierung bedingt sind, werden daher unter dem Begriff Typ-1-Interferonopathien zusammengefasst. Diese Gruppe seltener, genetisch bedingter Erkrankungen zeichnet sich durch eine große symptomatische Bandbreite aus, wobei vor allem neurologische und kutane Manifestationen im Vordergrund stehen. Bisher aufgeklärte Pathomechanismen dieser systemisch-entzündlichen Erkrankungen haben einen Einblick in neue zellintrinsische Mechanismen gegeben, die zu einer Typ-1-IFN-Aktivierung führen und auf Störungen im Metabolismus und der immunologischen Erkennung intrazellulärer Nukleinsäuren beruhen. Daraus ergeben sich auch Erkenntnisse hinsichtlich des Einsatzes einer immunmodulatorischen Therapie zur kausalen Behandlung von Typ-1-Interferonopathien. FRAGESTELLUNG: Typ-1-Interferonopathien gehören zu den genetisch bedingten, seltenen Erkrankungen. Eine Diagnosestellung ist jedoch aufgrund mangelnder Kenntnisse über die Krankheitsursache häufig nicht möglich, sodass kausale Therapieansätze für viele Patienten nicht existieren. Die Aufklärung der genetischen Ursache solcher Erkrankungen ist demnach von essentieller Bedeutung. Auch die hier untersuchten Familien leiden an bisher nicht molekulargenetisch diagnostizierten Krankheiten, deren Phänotyp jedoch eine Typ-1-Interferonopathie vermuten lässt. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel dieser Arbeit, bisher unbekannte Gene zu identifizieren und zu charakterisieren, welche Krankheitsbilder mit chronischer Typ-1-IFN-Aktivierung verursachen. MATERIAL UND METHODEN: Anhand klinischer Daten wurden zunächst die Krankheitsbilder der zwei betroffenen Familien charakterisiert und hinsichtlich der Gemeinsamkeiten mit bekannten Typ-1-Interferonopathien untersucht. Zudem wurde das Vorliegen einer chronischen Typ-1-IFN-Aktivierung bei den erkrankten Familienmitgliedern untersucht. Mit Hilfe von Exomanalysen und anschließenden bioinformatischen Analysen wurde nach dem ursächlichen Krankheitsgen gesucht. Die in diesem Rahmen in der Familie 1 nachgewiesene STING-Mutation wurde unter Verwendung von molekularbiologischen sowie zellbiologischen Analysen eingehend untersucht und zudem ihre Konsequenzen auf die IFN-Achse und die Stabilität des STING-Dimers mittels Strukturmodellierungen charakterisiert. Hinsichtlich der Aufklärung der genetischen Ursache der Erkrankung der Familie 2 wurde ebenfalls eine Exomanalyse durchgeführt. Da dabei jedoch keine Mutation identifiziert werden konnte, erfolgte eine Analyse differentiell exprimierter Transkripte mit Hilfe von Transkriptomdaten von Fibroblasten gesunder Kontrollen im Vergleich zu erkrankten Familienmitgliedern der Familie 2. ERGEBNISSE: Im Verlauf dieser Arbeit konnte in der Familie 1 mit einem familiären Chilblain Lupus eine kausale heterozygote Mutation im STING-Gen identifiziert werden. Diese bisher nicht beschriebene Mutation bedingt den Aminosäureaustausch Gly166Glu (G166E) im hochkonservierten Dimerinterface des STING-Proteins. Strukturmodelle ergaben Hinweise auf strukturverändernde Eigenschaften der Mutation G166E, die das STING-Dimer konstitutiv aktivieren. Dies konnte experimentell bestätigt werden, da in den peripheren Blutzellen der Patienten eine erhöhte IFN-Signatur nachgewiesen werden konnte und Patientenfibroblasten eine erhöhte Produktion von IFN-β sowie eine vermehrte Phosphorylierung von IRF3 zeigten. Um den Einfluss einer therapeutischen Immunmodulation über eine JAK-Inhibition zu untersuchen, wurden zwei Erkrankte der Familie 1 mit dem JAK-Inhibitor Tofacitinib über einen Zeitraum von 17 Tagen behandelt. Es konnte dabei in vivo eine signifikant reduzierte IFN-Signatur nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Exomanalyse konnte in der konsanguinen Familie 2 mit einem AGS-ähnlichen Phänotyp keine kausale Mutation identifiziert werden. Es zeigte sich zudem, dass in den Patientenzellen keine erhöhte IFN-Signatur sowie keine erhöhte IFN-β Produktion nachweisbar waren. Die vergleichende Transkriptomanalyse ergab keine auffällige differentielle Expression von Genen des Aminosäure-Metabolismus, der Seneszenz, des Zellzyklus, der DNA-Schadensantwort und DNA-Reparatur sowie von Genen immunologischer Prozesse. Allerdings wurde die vollständig fehlende Expression der Gene COL6A1 und COL6A2 in den Patientenzellen nachgewiesen. SCHLUSSFOLGERUNG: Die identifizierte STING-Mutation der Familie 1 führt zu einer chronischen Aktivierung der Typ-1-IFN-Achse und ist folglich als Gain-of-function Mutation anzusehen. Die Behandlung mit dem immunmodulierenden JAK-Inhibitor Tofacitinib führt zu einer Verminderung der IFN-Signatur und bietet somit einen vielversprechenden Ansatz für eine kausale Therapie. Weiterführende Untersuchungen, vor allem bezüglich der Langzeiteffekte, sind hier jedoch noch erforderlich. Die Erkrankung der Familie 2 ist dagegen vermutlich nicht den Typ-1-Interferonopathien zuzuordnen. Vielmehr scheint es zum jetzigen Zeitpunkt wahrscheinlich, dass eine Mutation innerhalb eines regulatorischen Elements, das die Expression der Gene COL6A1 und COL6A2 reguliert, für den Phänotyp der Erkrankten verantwortlich ist. Weiterführende Untersuchungen sind hier zukünftig von großem Interesse.

Hintergrund Das Aicardi-Goutières Syndrom (AGS) ist eine genetisch bedingte Enzephalopathie, die durch Mutationen in neun verschiedenen Genen verursacht wird und zu einer Neurodegenration mit globaler Entwicklungsverzögerung führt. Die Mutationen führen zu einer Fehlregulation des Metabolismus und der immunologischen Erkennung intrazellulärer Nukleinsäuren sowie einer konstitutiven Aktivierung von Typ 1-Interferon (IFN). Bei AGS-Patienten sind Kalzifizierungen der Basalganglia sowie Demyelinisierungen der weißen Substanz charakteristisch. Fragestellung: Biallele Mutationen in den Genen, TREX1 und SAMHD1, sind Ursache des AGS Typ 1 und AGS Typ 5. Die DNA-Exonuklease TREX1 degradiert intrazelluläre Nukleinsäure-Metabolite, die während zellulärer Prozesse gebildet werden. Die Triphosphohydrolase SAMHD1 spielt vorrangig in der Regulation des intrazellulären dNTP-Pools und des RNA-Metabolismus eine wichtige Rolle. Die Möglichkeit induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zu generieren und damit aus somatischen Zellen embryonale Stammzellen nachzubilden, um diese in unterschiedliche Zelltypen zu differenzieren, ermöglicht es, Zelltypen von schwer zugänglichen Geweben wie das Gehirn zu erforschen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Auswirkungen einer TREX1- und SAMHD1-Defizienz in neuronalen Zellen. Dazu wurden reprogrammierte neuronale Modelle für das AGS Typ 1 und AGS Typ 5 etabliert. Ziel war hierbei die Aufdeckung bisher unbekannter molekularer Mechanismen, die zur Entstehung einer Typ 1-IFN-induzierten Inflammation und Neurodegeneration bei Patienten mit AGS führt. Material und Methoden: Als Ausgangspunkt dieser Arbeit dienten primäre Fibroblasten und PBMCs, die aus Hautbiopsien bzw. Blutproben von AGS-Patienten mit Mutationen in den Genen, TREX1 und SAMHD1, gewonnen wurden. Durch eine Reprogrammierung dieser patientenspezifischen Zellen wurden pluripotente Stammzellen induziert und anschließend über die Bildung von Embryonalkörperchen und neuronale Vorläuferzellen in neuronale Zellen differenziert. Um die etablierten neuronalen Zelllinien funktionell zu charakterisieren, wurden isogene Zelllinien etabliert. Hierbei wurde mittels Genomeditierung der patientenspezifischen iPS-Zellen die krankheitsassoziierte Mutation behoben und auf diese Weise isogene Zelllinien mit identischem genetischen Hintergrund generiert, die sich lediglich durch die Anwesenheit oder das Fehlen der krankheitsrelevanten Mutation unterscheiden. Unter Nutzung verschiedener molekularbiologischer Methoden wurden die patientenspezifischen neuronalen Zellen näher untersucht. Um die in Patienten-Fibroblasten nachgewiesene erhöhten Typ 1-IFN-Aktivität auch im neuronalen Zellmodell zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit AGS-patientenspezifische neuronale Zellen und deren Vorläufer auf eine Erhöhung der IFN-Signatur überprüft. Um die etablierten neuronalen Zellmodelle eines AGS auf zellulären Stress in Form von ROS zu untersuchen, wurden patientenspezifische NPCs im Vergleich zu WT-Linien mittels DHR-Assay analysiert. Weiterhin wurde aus neuronalen Zellen mit AGS-spezifischen Mutationen mittels einer speziellen Kultivierungsmethode zur in vitro Separation von Axonen und Dendriten in proximale und distale Bereiche und einem nachfolgenden Tracking von Lysosomen und Mitochondrien per Live cell imaging die subzelluläre Verteilung dieser Organellen untersucht. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden zudem aus iPSC bzw. NPCs gewonnene neuronale Zellen mit AGS-spezifischen Mutationen die zelluläre Expression von Proteinen, die eine Rolle bei neurodegenerativen Krankheiten spielen, untersucht. Ergebnisse Die Nutzung der iPSC-Technologie eröffnet besonders für neurodegenerative Krankheiten die Möglichkeit, geeignete zelluläre Krankheitsmodelle zu schaffen. So existieren bereits eine Reihe iPSC-basierter Studien für Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington oder amyotropher Lateralsklerose. Mit der vorliegenden Arbeit wurden iPSC-basierte Modelle für das AGS entwickelt. Als Grundstein dieser Arbeit konnten aus somatischen Zellen von AGS-Patienten pluripotente Stammzellen erzeugt und als iPSCLinien etabliert werden. Die funktionelle Charakterisierung der patientenspezifischen Zellen erfolgte durch die Etablierung isogener Kontrollen mit identischem genetischen Hintergrund, um phänotypische Unterschiede direkt auf die krankheitsspezifischen Mutationen zurückzuführen. Die vorhandenen SAMHD1- und TREX1-Mutationen in den iPS-Zellen der Patienten wurden zunächst mittels Genomeditierung korrigiert. Anschließend wurden iPSC-Linien etabliert. Die patientenspezifischen iPS-Zellen sowie die isogenen Kontrollen wurden über neuronale Vorläuferzellen zu Neuronen differenziert, validiert und funktionell untersucht. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die etablierten Zellmodelle teilweise den Phänotyp eines AGS rekapitulieren. So entsprach die im AGS-Modell neuronaler Vorläuferzellen untersuchte Expression von IFN-stimulierten Genen (ISGs) weitgehend dem typischen Bild einer Interferonopathie und konnte durch den Vergleich mit isogenen Zelllinien auf die TREX1-Mutation der neuronalen Vorläuferzellen zurückgeführt werden. Eine Variabilität der ISG-Expression in ausdifferenzierten neuronalen Zellen könnte verschiedene Ursachen haben. Die Untersuchungen auf zellulären Stress in Form von ROS konnten zeigen, dass sowohl in TREX1- als auch SAMHD1-defizienten neuronalen Vorläuferzellen ein erhöhtes zelluläres Level an ROS vorliegt. Möglicherweise ist dies mit dem festgestellten langsamen Zellwachstum der patientenspezifischen Vorläuferzellen assoziiert. Weiterhin konnte mittels Live cell imaging ein verringertes Mobilitätsverhalten von Lysosomen und Mitochondrien in patienten- spezifischen neuronalen Zellen festgestellt werden, was die Vermutung nahelegt, dass die untersuchten AGS-verursachenden Mutationen in TREX1 und SAMHD1 ursächlich an der Neurodegeneration bei AGS-Patienten beteiligt sind. Ausblick: Die in dieser Arbeit erfolgreich etablierten reprogrammierten neuronalen AGS-Modelle können zukünftig dazu dienen, pathogenetische Prozesse im Gehirn zu untersuchen. Es konnten Grundlagen zur Aufklärung bisher unbekannter molekularer Mechanismen der Neurodegeneration bei AGS-Patienten geschaffen werden. Weiterführend kann das etablierte Modell zur Untersuchung weiterer Aspekte wie der Messung von transkriptomweiten Expressionsprofilen verwendet werden und somit neue Einblicke in die zellintrinsische Aktivierung der Typ 1-IFN-Achse von AGS-Patienten liefen. Um die Rolle von neuronal vorkommenden Proteinen oder Vesikeln bei neuronalen Erkrankungen, insbesondere bei AGS,zu untersuchen, stellt das patientenspezifische AGS-Modell eine wichtige Grundlage dar. Die hier aufgeführten immunhistochemischen Untersuchungen neuronaler Proteine können vertieft und in einem größeren Umfang ausgewertet werden. Die vorteilhaften Eigenschaften der iPSC-basierten neurodegenerativen Modelle ermöglichen neben grundlagenwissenschaftlichen Untersuchungen zur Krankheitsursache auch die Bearbeitung von Fragestellungen zur Behandlung von AGS-Patienten.