Thesis--Catholic University of America. / Includes bibliographical references (p. 21-23).

Memoria para optar al título de Bioquímico / Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) es una patógeno exclusivo del ser humano y agente causal de la fiebre tifoidea. Esta enfermedad constituye un problema de salud pública a nivel mundial especialmente en países en vías de desarrollo. Nuestro trabajo se ha enfocado a comprender la regulación de la producción del lipopolisacárido (LPS) y su papel en la virulencia de esta bacteria. El LPS es el componente principal de la envoltura de las bacterias Gram negativas y, por lo tanto, es un importante mediador de las interacciones con el hospedero. Estudios anteriores de nuestro laboratorio han demostrado que la producción del antígeno O (AgO), el componente más externo de la molécula de LPS, varía durante el crecimiento bacteriano, aumentando en las fases exponencial tardía y estacionaria. Esta modulación es mediada por el factor RfaH, que regula positivamente la transcripción del operón wba encargado de la síntesis del AgO. La expresión del gen rfaH también aumenta en la etapa de transición a fase estacionaria y su activación requiere la función del factor sigma alternativo RpoN. En este trabajo se estudió el mecanismo de activación de la transcripción de rfaH mediado por RpoN. Se planteó como hipótesis que el factor sigma de estrés RpoN regula la expresión de rfaH en S. Typhi, mediante la unión directa a la región promotora de rfaH o indirectamente a través de proteínas accesorias. El hallazgo previo de la existencia de dos sitios de inicio de la transcripción con sus respectivos promotores, se confirmó mediante la construcción de vectores reporteros que contienen fusiones transcripcionales de los respectivos promotores P1 o P2 al gen lacZ. Se demostró que el promotor P1 es el responsable de la regulación fase-dependiente de la transcripción de rfaH, en cambio el promotor P2 contribuiría marginalmente a esta regulación. Se estudio la unión de RpoN a una probable secuencia de reconocimiento de este factor sigma en el promotor P1. Para esto se clonó el marco de lectura en el vector pET-21b(+) y se sobreexpresó y purificó la proteína recombinante RpoN-HisTag mediante cromatografía de afinidad a Ni. Se utilizó una fracción altamente purificada de esta proteína en ensayos de retardo en geles (EMSA). Se demostró que RpoN no se une al promotor P1 y por lo tanto no participa directamente en la regulación fase-dependiente de rfaH. La regulación mediada por este factor sigma es dependiente de su activación por proteínas activadoras, denominadas "enhancer binding proteins" (EBP). Para identificar la EBP que participa en la regulación de rfaH, se construyeron mutantes por deleción en 6 genes para las probables EBPs encontradas en el genoma de S. Typhi. De estas mutaciones, sólo aquella en ygaA, factor encargado de la transcripción de genes para detoxificar NO, presentó un efecto significativo sobre la transcripción de la fusión rfaH-lacZ, que consistió en un aumento de la actividad β-galactosidasa durante la fase exponencial temprana. Los resultados de este trabajo indican que la regulación transcripcional fase-dependiente de rfaH es mediada de forma indirecta por RpoN, a través de proteínas accesorias que serían reguladas por este factor sigma para ejercer su efecto sobre el promotor P1.

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1966. / Typescript. Vita. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph.D.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2005. / Includes bibliographical references (leaves 126-145). Also available in electronic version.

No description available.

The evolutionary relationship between Salmonella enterica serovar Typhi, other typhoid-like enteric fever causing serovars and 10 non-Typhoid serovars from S. enterica subspecies I, could not be determined by comparative nucleotide sequences of six genes. Phylogenetic analyses of the dataset showed that the genes of interest underwent frequent recombination, suggesting a low level of clonality within subspecies I of S. enterica. To establish the evolutionary relationships within serovar Typhi, genome-wide Single Nucleotide Polymorphism (SNP) was explored as a marker for both typing purposes and phylogenetic analysis. Thirty eight SNPs were typed in 73 global Typhi isolates, including 18 isolates expressing the special flagellar antigen z66, using restriction enzyme digestion method. The isolates were differentiated into 23 SNP profiles and grouped into four distinct clusters. The z66 isolates were divided into four SNP profiles and were all grouped into one cluster, suggesting a single origin. An alternative SNP typing method using the hairpin real time PCR assay was investigated to type four additional SNPs, termed as biallelic polymorphisms (BiP). These BiPs were found to classify 481 global Typhi isolates into five major clusters (Roumagnac et al., 2006). Typing four BiPs resulted in the identification of four additional SNP profiles. We proposed nine SNPs were required to type Typhi isolates into 13 subclusters for global epidemiology. An enzymatic-based method using CelI nuclease was evaluated to discover more SNPs from other Typhi genomes. The efficiency of the CelI was shown to be unsatisfactory and we were unable to demonstrate the effectiveness of the proposed method. Nine Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs) were typed in the 73 Typhi isolates using fluorescent-labelled universal primers, and analysed on an automated DNA sequencer. Five isolates were unable to give PCR products in one or more VNTR loci. Nine VNTRs could differentiate 68 Typhi isolates into 65 MLVA profiles, suggesting a higher discriminating power than SNP typing. SNPs were shown to be a more appropriate marker for phylogenetic tracing for Typhi while VNTRs were highly discriminating but could not be used to establish the evolutionary relationships of diverse Typhi isolates.

Thesis (M. Phil.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2003. / Includes bibliographical references (leaves 98-116). Also available in electronic version. Access restricted to campus users.

Thesis (M. Phil.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2003. / Includes bibliographical references (leaves 110-127). Also available in electronic version. Access restricted to campus users.

The evolutionary relationship between Salmonella enterica serovar Typhi, other typhoid-like enteric fever causing serovars and 10 non-Typhoid serovars from S. enterica subspecies I, could not be determined by comparative nucleotide sequences of six genes. Phylogenetic analyses of the dataset showed that the genes of interest underwent frequent recombination, suggesting a low level of clonality within subspecies I of S. enterica. To establish the evolutionary relationships within serovar Typhi, genome-wide Single Nucleotide Polymorphism (SNP) was explored as a marker for both typing purposes and phylogenetic analysis. Thirty eight SNPs were typed in 73 global Typhi isolates, including 18 isolates expressing the special flagellar antigen z66, using restriction enzyme digestion method. The isolates were differentiated into 23 SNP profiles and grouped into four distinct clusters. The z66 isolates were divided into four SNP profiles and were all grouped into one cluster, suggesting a single origin. An alternative SNP typing method using the hairpin real time PCR assay was investigated to type four additional SNPs, termed as biallelic polymorphisms (BiP). These BiPs were found to classify 481 global Typhi isolates into five major clusters (Roumagnac et al., 2006). Typing four BiPs resulted in the identification of four additional SNP profiles. We proposed nine SNPs were required to type Typhi isolates into 13 subclusters for global epidemiology. An enzymatic-based method using CelI nuclease was evaluated to discover more SNPs from other Typhi genomes. The efficiency of the CelI was shown to be unsatisfactory and we were unable to demonstrate the effectiveness of the proposed method. Nine Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs) were typed in the 73 Typhi isolates using fluorescent-labelled universal primers, and analysed on an automated DNA sequencer. Five isolates were unable to give PCR products in one or more VNTR loci. Nine VNTRs could differentiate 68 Typhi isolates into 65 MLVA profiles, suggesting a higher discriminating power than SNP typing. SNPs were shown to be a more appropriate marker for phylogenetic tracing for Typhi while VNTRs were highly discriminating but could not be used to establish the evolutionary relationships of diverse Typhi isolates.

Magíster en Bioquímica en el área de especialización de Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular / Memoria para optar al Título de Bioquímica / El género Salmonella comprende dos especies, S. enterica y S. bongori, que en conjunto agrupan a más de 2.500 serovares. De éstos, los pertenecientes a S. enterica subespecie enterica son responsables de aproximadamente el 99% de los casos de salmonelosis en animales de sangre caliente. A nivel mundial se producen anualmente millones de casos de salmonelosis en el ser humano y miles de muertes, principalmente en países subdesarrollados. En esta tesis se propuso identificar un conjunto de genes requeridos para la colonización sistémica de un hospedero murino por tres serovares de Salmonella: S. Typhi, S. Typhimurium y S. Enteritidis. Este estudio se realizó mediante un análisis masivo de mutantes bajo selección negativa in vivo. La detección de aquellas mutantes con defectos en la colonización sistémica aguda de ratones BALB/c se realizó mediante hibridaciones comparativas utilizando un microarray genómico de Salmonella. El posterior análisis comparativo de las mutantes bajo selección negativa in vivo en los tres serovares, nos permitió identificar que mutantes en 131 genes serían atenuadas in vivo. Dentro de este grupo identificamos genes codificados en islas de patogenicidad conservadas del género Salmonella, genes necesarios para la biosíntesis de purinas y compuestos aromáticos (aro, pur y gua), genes relacionados con la biosíntesis y modificación del LPS (rfa, rfb) y genes que codifican reguladores globales asociados a patogenicidad (phoP, envZ, rpoN, dam y rsd). Otros genes identificados corresponden a los que codifican el sistema transportador de proteínas Twin-Arginine (tatABC), genes que codifican las diferentes subunidades de una NADH deshidrogenasa (genes nuo); un locus que corresponde a un transportador de péptidos del tipo ABC (sapBF). También pudimos detectar que mutantes en genes involucrados en el transporte de solutos se encuentran bajo selección, como trkH que codifica un transportador de potasio. El sistema de transporte Twin-Arginine corresponde a una de las dos vías de translocación de proteínas hacia el espacio periplasmático en bacterias Gram negativo. La participación de este sistema en la patogenicidad de Salmonella se confirmó mediante ensayos de competencia in vivo entre mutantes definidas del operón y la respectiva cepa silvestre en los tres serovares estudiados. El análisis global de mutantes en tres serovares nos permitió determinar un conjunto de genes comunes necesarios para establecer la colonización sistémica aguda en un hospedero murino. Posteriormente, se confirmó la participación del sistema de transporte de proteínas Tat en la patogenicidad de Salmonella. Los resultados de los ensayos de competencia nos permitieron confirmar la predicción obtenida en el análisis de masivo de mutantes bajo selección negativa in vivo. / The Salmonella genus comprises two species: S. bongori and S. enterica, which can be grouped into more than 2,500 serotypes. Serovars within S. enterica subspecies enterica account for ~99% of all salmonellosis in warm-blooded animals. Worldwide, these organisms are responsible for hundreds of millions of salmonellosis cases and hundreds of thousands of deaths, mainly in underdeveloped countries. In this thesis, we aimed to identify a group of genes required for systemic colonization of a murine host by three Salmonella serotypes: S. Typhi, S. Typhimurium and S. Enteritidis. We used a high-throughput microarray-based screening for mutants with defects in systemic colonization of BALB/c mice. Subsequent comparative analysis of mutants under negative selection in vivo allowed us to identify that mutants in 131 genes are attenuated in the three serotypes under study. Within this group we found genes encoded in some of the pathogenicity islands conserved in the Salmonella genus, genes required for biosynthesis of purines and aromatic compounds (aro, pur and gua), genes related to LPS biosynthesis (rfa and rfb) and genes encoding regulators previously associated with virulence (phoP, envZ, rpoN, dam and rsd). Other genes identified are those encoding the Twin-Arginine transport system (tatABC), genes coding the different subunits of a NADH dehydrogenase (nuo genes) and a locus encoding an ABC peptide transporter (sapBF). We also identified that mutants in genes involved in solute transport (i.e: trkH, that encodes a potassium transporter) are under negative selection in vivo. The Twin-Arginine transport system corresponds to one of the two pathways used by Gram-negative bacteria to translocate proteins to the periplasmatic space. Participation of this system in Salmonella pathogenicity was confirmed in the three serotypes under study by means of in vivo competition assays between targeted mutants of the operon and the corresponding wild-type strains. Overall, the global analysis of mutants under negative selection in vivo in three serotypes of Salmonella allowed us to identify a common group of genes required to establish acute systemic colonization of a murine host. We confirmed the participation of the Tat transport system in the pathogenicity of Salmonella using in vivo competition assays. These results further support the predictions obtained in our global analysis. / Fondecyt