Garcinia kola is one of the plants used in folklore remedies for the treatment of microbial infections. Bacterial resistance to commonly used antibiotics has necessitated the search for newer and alternative compounds for the treatment of drug resistant microbial infections. This study focuses on the bioactivity of G. kola seeds on Streptococcus pyogenes (ATCC 49399), Staphylococcus aureus (NCTC 6571), Plesiomonas Shigelloides (ATCC 51903) and Salmonella typhimurium (ATCC 13311), organisms which can cause illnesses from mild to severe with potentially fatal outcomes. The crude ethyl acetate, ethanol, methanol, acetone and aqueous extracts were screened by agar-well diffusion method and the activities of the extract were further determined by Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) assays. The inhibition zones ranged from 0 - 24 mm, while MIC and MBC of the extract ranged between 0.04 - 1.25 mg/mL and 0.081 - 2.5 mg/mL respectively. Chloroform/ Ethyl Acetate/ Formic acid (CEF) solvent system separated more active compounds followed by Ethyl Acetate/ Methanol/ Water (EMW) and Benzene/ Ethanol/ Ammonium Hydroxide (BEA). The extracts were fractionated by Thin Layer Chromatography (TLC). Bioautography was used to assess the activity of the possible classes of compounds present in the more active extracts. Column chromatography was used to purify the active compounds from the mixture while Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) was used to identify the phyto components of the fractions. The MIC of the fractions ranged between 0.0006 - 2.5 mg/mL. CEF 3 (F3), CEF 11 (F11) and CEF 12 (F12) revealed the presence of high levels fatty acids Linoleic acid, 1, 2-Benzenedicarboxylic acid and 2, 3-Dihydro-3, 5-dihydroxy-6-methyl, respectively. The results obtained from this study justify the use of this plant in traditional medicine and provide leads which could be further exploited for the development of new and potent antimicrobials.

The work in this thesis is concerned with the study of bacterial adaptation on short and long timescales. In the first section, consisting of three chapters, I describe a recently developed high-throughput technology for probing gene function, transposon-insertion sequencing, and its application to the study of functional differences between two important human pathogens, Salmonella enterica subspecies enterica serovars Typhi and Typhimurium. In a first study, I use transposon-insertion sequencing to probe differences in gene requirements during growth on rich laboratory media, revealing differences in serovar requirements for genes involved in iron-utilization and cell-surface structure biogenesis, as well as in requirements for non-coding RNA. In a second study I more directly probe the genomic features responsible for differences in serovar pathogenicity by analyzing transposon-insertion sequencing data produced following a two hour infection of human macrophage, revealing large differences in the selective pressures felt by these two closely related serovars in the same environment. The second section, consisting of two chapters, uses statistical models of sequence variation, i.e. covariance models, to examine the evolution of intrinsic termination across the bacterial kingdom. A first collaborative study provides background and motivation in the form of a method for identifying Rho-independent terminators using covariance models built from deep alignments of experimentally-verified terminators from Escherichia coli and Bacillus subtilis. In the course of the development of this method I discovered a novel putative intrinsic terminator in Mycobacterium tuberculosis. In the final chapter, I extend this approach to de novo discovery of intrinsic termination motifs across the bacterial phylogeny. I present evidence for lineage-specific variations in canonical Rho-independent terminator composition, as well as discover seven non-canonical putative termination motifs. Using a collection of publicly available RNA-seq datasets, I provide evidence for the function of some of these elements as bona fide transcriptional attenuators.

Chapter I Introduction Salmonellae are facultative Gram-negative intracellular pathogens. Different serovars of it causes a variety of diseases in multiple hosts with different disease outcomes. Salmonella enterica serovar Enteritidis and Typhimurium (STM) can infect domestic animals causing gastroenteritis or typhoid like fever. Typhoid fever in humans which is actually caused by Salmonella enterica serovar Typhi still remains a significant health problem in many parts of the world with an estimated annual incidence of nearly 16 million cases and about 600,000 deaths. The infection begins via the orofecal route following which it invades the intestinal mucosa through several ways, namely by antigen sampling M cells, CD18 macrophages present in the intestinal lumen or via a forced entry in the non-phagocytic enterocytes. Upon entry, Salmonella resides in an intracellular phagosomal compartment called Salmonella containing vacuole (SCV) and has several strategies to counteract the host defense mechanisms. Following phagocytosis and its compartmentalization into Salmonella containing vacuole (SCV), a series of defense mechanisms are initiated. These include toxic reactive oxygen species or super oxide production, nitric oxide production, phagosomal acidification and release of hydrolases and defensins through fusion of phagosome with lysosomes generating highly bactericidal environment. The SCV transiently acquires endocytic markers like TfnR, EEA1, Rab4, Rab5, Rab11 and Rab7 and resist killing by avoiding phagosomal maturation and vesicular trafficking of iNOS and NADPH oxidase vesicles. Moreover, Salmonella also uses acidic pH of the SCV (~ pH 4.5) to assemble the Salmonella Pathogenecity Island 2 (SPI-2) type three secretion system (TTSS) which is essential for survival inside the macrophages. Salmonella uses these hostile conditions inside the host as cues for regulating their virulence factors using global regulatory factors. Hfq is one such global regulator playing an important role in many physiological processes and stress responses. Understanding the importance of Hfq regulated genes which impart Salmonella survival advantage under hostile conditions for successful infection will be of particular significance. The host too recognizes pathogen using innate immune receptors present either on the cell surface like TLRs (Toll Like Receptors) or inside the cells like NLRs (Nod Like Receptors). Innate immune receptors recognize pathogen associated molecular patterns (PAMPs) such as Lipopolysacharide (LPS), peptidoglycon (PGN), or hypomethylated DNA or RNA. Recognition of PAMPs by innate receptors leads, via activation of transcription factors (NF-κB and IRF3), to the generation of pro and anti-inflammatory cytokines, chemokines. Vaccination has been practiced for many years and it is one of the most effective methods of controlling infectious diseases like typhoid. At present two licensed vaccines against Salmonella are in use globally namely, Vi polysaccharide subunit vaccine (Typhim Vi™) and live attenuated typhoid vaccine (Vivotif Berma™). Lack of immunological memory, low efficacy (55-75 % protection) and requirement of higher number of doses are the important practical shortcomings associated with the currently used vaccines. So there is a need for a safer and immunogenic vaccine to combat Salmonella infection. Chapter II Salmonella Typhimurium lacking hfq gene induces long term memory response and confers protective immunity Currently available vaccines for typhoid have less-than-desired efficacy and certain unacceptable side effects, making it pertinent to search for new improved ones. Of the various strategies used for the generation of vaccine strains, focus is on manipulation of virulence regulator genes for bacterial attenuation. Hfq is a RNA chaperon which mediates the binding of small RNA to the mRNA and assists in post-transcriptional gene regulation in bacteria. Salmonella hfq deletion mutant is highly attenuated in vitro as well as in vivo implying its role in bacterial virulence. In this study, we have evaluated the efficacy of the Salmonella Typhimurium hfq deletion mutant as a candidate for live oral vaccine against Salmonella infection in murine salmonellosis model. The hfq deletion mutant is not only able to confer protection when administered orally to the mice against oral challenge with serovar Typhimurium virulent strain, but also elicits cross protective immune responses to other Salmonella serovars. The vaccine candidate appears to be safe for use in pregnant mice. This protection is partially mediated by the increase in the number of CD4+ T lymphocytes upon vaccination. STM hfq deletion mutant further exhibited significant increase in the lipopolysaccharide as well as outer membrane protein specific IgG in the serum as well as secretory S-IgA in the intestinal washes. In addition, vaccination led to an increased serum IFN-γ and IL-6. Taken together, our results suggest that the Salmonella Typhimurium hfq deletion mutant can be an excellent live oral vaccine candidate. Chapter III Acidic pH induced STM1485 gene governs intracellular replication and pathogenesis in Salmonella During the course of infection, Salmonella has to face several potentially lethal environmental conditions such as low pH both inside and outside the host. The ability to sense and respond to the acidic pH is crucial for survival and replication of Salmonella. Exposure to acidic pH results in the expression of large pool of virulence genes. One such gene highly up regulated inside the macrophage is STM 1485. In order to understand physiological role of STM 1485 in Salmonella pathogenesis, STM 1485 gene was deleted chromosomally and characterized in vitro and in vivo. In vitro the mutant did not show any growth defects at pH 4.5 and no difference in acid tolerance response. The 1485 deletion mutant was compromised in its capacity to proliferate inside the cells and is further lowered inside activated macrophages. We further showed that surface translocation of SPI-2 encoded translocon protein SseB was reduced at low pH in vitro in STM 1485 mutant and the mutant was found to colocalize with lysosomes higher than the wild type. In addition, the STM 1485 deletion mutant displayed decreased virulence in murine typhoid model when infected intragastrically. Based on our results, we hypothesize that the acid shock protein encoded by the STM 1485 might be involved in the formation of SPI-2 translocon at low pH and there by contributing to the virulence of Salmonella. Chapter IV Role of Nod1 in sensing vacuolar pathogen Salmonella in epithelial cells Nod1 and Nod2 are the archetypal members of the Nod like receptor family (NLR) and they recognize distinct peptidoglycan motifs of Gram-negative and Gram-positive bacteria respectively. Role of Nod1 and Nod2 in sensing bacterial pathogens have been elucidated. However, the role of Nod1 in sensing vacuolar pathogen Salmonella in epithelial cells is not understood. So in this study we investiged the role of Nod1 in the innate immune response against Salmonella in epithelial cells. We demonstrate that the recognition of Salmonella by Nod1 leads to NF-κB activation and this activation is diminished in epithelial cells expressing a dominant-negative Nod1 construct or Nod1 shRNA. Using a set of Salmonella mutants we show that the availability of ligand is higher when the bacteria were in cytosol rather than in vacuole. Further we also observed that the Nod1 mediated killing of Salmonella is mediated through the defensins. Based on our results we hypothesize that Salmonella uses its vacuolar niche to evade Nod1 mediated innate immune response.

Das Ziel dieser Arbeit war es, anhand von klinischen, kulturellen, serologischen sowie hämatologischen Parametern den frühen Einsatz des Salmonella-Lebendimpfstoffs Salmoporc® bei Saugferkeln in der ersten Lebenswoche zu prüfen. Dabei ergaben sich im Wesentlichen zwei zentrale Fragestellungen. Zum einen waren die Wirksamkeit sowie die Verträglichkeit der Vakzine bei der Anwendung bei Saugferkeln am dritten Lebenstag sowie im Alter von vier Wochen zu prüfen. Zum anderen war zu hinterfragen, ob der Antikörperstatus bzw. die präpartale Impfung von Muttersauen einen Einfluss auf den Impferfolg bei deren Ferkeln haben. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Impf- und Infektionsversuche mit Sauen und deren Ferkeln nach einem bereits etablierten Modell durchgeführt. Es wurden neun tragende und Salmonellen-freie Sauen in drei Gruppen zu je drei Sauen eingeteilt. Eine Gruppe Sauen wurde sechs sowie drei Wochen ante partum parenteral mit Salmoporc® geimpft. Deren Ferkel sowie die Ferkel von drei ungeimpften Sauen wurden am dritten und am 28. Lebenstag oral immunisiert. Die Ferkel der drei verbleibenden ungeimpften Sauen wurden nicht vakziniert und dienten als Kontrollgruppe. Die Versuche zeigten, dass die Impfung der Ferkel am dritten Lebenstag und in der 4. Lebenswoche sowohl bei den Ferkeln der nicht immunisierten Sauen wie auch bei den Ferkeln der vor der Geburt geimpften Sauen zu keinerlei klinischen Symptomen post vaccinationem führte, was für eine sehr gute Verträglichkeit der untersuchten Vakzine beim Saugferkel spricht. Die bakteriologische Untersuchung ausgewählter immunologisch und fleischhygienisch relevanter Organe von einem Teil der geimpften Ferkel am zehnten Lebenstag offenbarte zudem die noch erhaltene Invasivität des Impfstammes, welche einen entscheidenden Einfluss auf die Ausbildung einer belastbaren Immunität der Tiere post vaccinationem hat. So waren extraintestinale Nachweise des Impfstamms in den Tonsillen und Mandibularlymphknoten aller Tiere und bei einem Großteil der Tiere auch in den darmassoziierten Lymphknoten und teilweise in der Milz möglich. Am 49. Lebenstag wurden alle verbliebenen Ferkel via Magenschlundsonde intragastral mit je 1 x 1010 KbE eines Salmonella Typhimurium DT104-Wildstammes infiziert und anschließend über sieben Tage klinisch und bakteriologisch untersucht. Eine Woche post infectionem wurden schließlich ausgewählte Organe der Tiere kulturell auf den Infektionsstamm hin untersucht. Nach der Belastungsinfektion offenbarten sich deutliche klinische Effekte der Impfung. Bei den Tieren der nicht geimpften Kontrollgruppe wurden deutliche Symptome einer Salmonelleninfektion beobachtet, wohingegen bei den geimpften Ferkeln, unabhängig vom Impfstatus der Muttersauen, keinerlei Salmonelloseanzeichen feststellbar waren. Auch bei den kulturellen Untersuchungen zeigten sich deutliche Effekte der Impfung auf die Salmonellen-Ausscheidungskinetik. So schieden die geimpften Tiere beider Impfgruppen den vollvirulenten Challenge Stamm in signifikant niedrigerer Menge mit den Fäzes aus als die Kontrolltiere, weshalb die Saugferkelvakzinierung gut geeignet erscheint, die Salmonellenverbreitung durch die Fäzes infizierter Tiere zu reduzieren. Die bakteriologischen Organuntersuchungen zeigten in den lymphatischen Geweben, aber vor allem auch in den fleischhygienisch relevanten Organen deutliche Unterschiede zwischen den geimpften Ferkeln und den Kontrolltieren, die den Infektionsstamm in diesem frühen Infektionsstadium zu teilweise hohen Prozentsätzen in Leber, Milz und Unterarm-Muskulatur aufwiesen. Somit konnte gezeigt werden, dass der untersuchte Impfstoff auch bei der Anwendung beim neugeborenen Saugferkel gut verträglich ist und zudem eine belastbare Immunität induziert. Der Vakzinierungsstatus der Muttertiere hat hierbei keinen negativen Einfluss auf den Impfschutz der Ferkel. Die Anwesenheit maternaler Immunglobuline scheint sogar geeignet, die zelluläre Immunantwort der Ferkel in besonders hohem Maße zu stimulieren. Auch die Anforderungen nach § 5 der Schweine-Salmonellen-Verordnung vom 13. März 2007 an eine Salmonellenimpfung, die serologische Untersuchung auf Salmonellen-Antikörper nicht zu beeinträchtigen, werden durch Salmoporc® erfüllt.

Ziel dieser Arbeit war es, die porzine Salmonelleninfektion unter Berücksichtigung der drei beim Schwein am häufigsten vorkommenden Salmonella-Serovaren anhand des klinischen Bildes, der quantitativen und qualitativen Erregerausscheidung, des Kolonisationsverhaltens, der Serokonversion bezüglich der unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen IgA, IgG und IgM sowie durch die Labordiagnostik näher zu charakterisieren. Bisherige Studien an Schweinen wurden überwiegend mit S. Typhimurium durchgeführt, weitere Serovare sind bisher nur unzureichend erforscht worden, obwohl sie ebenfalls zoonotisches Potential besitzen, aber vergleichsweise nur als gering virulent und kaum invasiv gelten. Die Durchführung dieser Studie erfolgte mit 6 Wochen alten Absatzferkeln, welche nach einem bereits etablierten Modell mit den jeweiligen Salmonella-Serovaren infiziert wurden. Nach dem Challenge wurden die Tiere täglich klinisch untersucht und es wurden Kotproben zur qualitativen und quantitativen Erregerausscheidung entnommen. Parallel dazu wurden im Abstand von zwei bzw. drei Tagen Blutproben für ein Differentialblutbild, Blutchemie sowie für die serologische Untersuchung gewonnen. Nach einer Woche wurden die Tiere getötet und es wurden insgesamt 13 sterile Organproben gewonnen, um eine Aussage über das Kolonisationsverhalten treffen zu können. Die Infektionsversuche zeigten, dass nach oraler Verabreichung von 1x1010 KbE die Tiere der mit S. Infantis infizierten Gruppe, entgegen den Erwartungen, die stärksten klinischen Symptome einer Salmonellose mit Diarrhoe, Fieber, Anorexie sowie reduziertem Allgemeinbefinden zeigten. Nach dem Challenge schieden alle Tiere der drei Infektionsgruppen den jeweiligen Challengestamm zu allen Zeitpunkten des Experimentes aus. Dabei war die quantitative Erregerausscheidung bei der S. Infantis-Infektionsgruppe stets am höchsten, bei der S. Derby-Gruppe stets am geringsten. Die Kolonisationsrate in den untersuchten Organproben war bei der S. Derby-Gruppe mit insgesamt 80,7 % am höchsten, gefolgt von der S. Typhimurium DT104-Gruppe mit 80,3 %. S. Infantis wurde mit einer Kolonisationsrate von 73,6 % am seltensten isoliert. Bei der quantitativen bakteriologischen Untersuchung der Organproben wurden bei der S. Typhimurium DT104-Gruppe die meisten Salmonellen vorwiegend aus den lymphatischen Organen isoliert, während bei der S. Infantis-Gruppe die Salmonellenbelastung in den essbaren Organen am höchsten war. Die serologische Untersuchung mittels isotypspezifischen ELISA offenbarte für IgG einzig bei der S. Typhimurium DT104-Gruppe einen deutlichen Anstieg der spezifischen Antikörperaktivität, während für IgM die höchste Aktivität bei der S. Derby-Gruppe gemessen wurde. Für IgA fand bei allen Tieren der drei Infektionsgruppen keine Serokonversion statt. Im Differentialblutbild stellten sich bei allen Tieren der drei Infektionsgruppen nach dem Challenge mit einer Leukozytose, einer Linksverschiebung und einer Monozytose typische Anzeichen einer bakteriellen Infektion ein. Die blutchemische Untersuchung offenbarte besonders bei der S. Typhimurium DT104-Gruppe und der S. Infantis-Gruppe größere Verluste von Natrium und Chlorid nach dem Challenge, während es bei der S. Derby-Gruppe zu keinen Elektrolytverschiebungen im Plasma kam. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deutlich, dass S. Infantis auch beim Schwein schwere klinische Verläufe verursachen kann und auch in essbaren Organen kolonisiert. Diese invasiven Isolate stellen neben den wirtschaftlichen Verlusten ein großes Verbraucher- schutzproblem dar. Obwohl die Prävalenz von S. Infantis beim Schwein nicht so hoch wie die von S. Typhimurium ist, so sollte diese Serovar in Zukunft besonders beobachtet werden. Für S. Derby wurde trotz schwacher Virulenz die höchste Kolonisationsrate nachgewiesen, was deren Potential, klinisch inapparente Salmonelleninfektionen auszulösen, deutlich macht. Somit belegt diese Arbeit, dass S. Infantis und S. Derby für den Menschen sehr bedeutsam sein können und daher ein entsprechendes Monitoring erfordern.

Aus Materialien einer mesophilen Biogasanlage wurden Untersuchungen zur natürlichen Inaktivierung von Salmonellen durchgeführt. In dieser Biogasanlage werden zur alternativen Energiegewinnung im zweistufigen Prozess Rinderflüssigmist, Hühnerkot und Fettabscheiderinhalte fermentiert. Insgesamt konnten in den Jahren 1997-2000 zwölf verschiedene Salmonella-Serovare (z. B. S. Enteritidis, S. Agona, S. Hadar) in den Ausgangsmaterialien, im Fermentationsmaterial und im fertigen Fermentationsprodukt isoliert werden. Salmonella-positiv waren die Proben zu 95,5% (n = 22) aus der Rindergülle, zu 69,2% (n =13) aus dem Fermenter I, zu 50% (n = 20) aus dem Fermenter II, zu 77,3% (n = 22) aus der Lagune und zu 40% (n = 10) aus dem Fettabscheider. Als Quellen der Salmonellen werden die Gülle der Milchviehanlage (besonders für den Impfstamm) sowie Fettabscheiderinhalte diskutiert. Nach einer Infektion von Rindern mit S. Typhimurium in der gülleliefernden Milchviehanlage war nach der Vakzinierung der Kälber der Zoosaloral®-Impfstamm (LT: DT009) in der Gülle häufig nachweisbar. Bei 13 Untersuchun-gen wurde der Impfstamm zwölfmal in der Gülle der Milchviehanlage, einmal im Fermentationsprodukt der Biogasanlage und in fünf Proben aus der Lagune isoliert. Im Laboratorium wurde das Absterben von S. Typhimurium DT104 in fermen-tierender Rindergülle bei Lagerungstemperaturen von 7°C, 22°C und 37°C un-tersucht. Nach durchschnittlich 10 Tagen waren bei 37°C – dies entspricht etwa der Betriebstemperatur einer mesophilen Biogasanlage – keine Salmonellen nachweisbar. Bei einer Temperatur von 22°C überlebten die Salmonellen neun Wochen, bei 7°C überlebten sie mehr als 52 Wochen. Der mikrobiologische Abbau von Biomasse führt zur Aufspaltung der Makro-moleküle und danach zur Bildung von Karbonsäuren. Nach der Analyse orga-nischer Säuren aus Rindergülle und Cosubstraten wurden Konzentrationen dieser Säuren gegen S. Typhimurium DT104 experimentell geprüft. Es wurde der Einfluss von Ameisen-, Essig-, Propion-, Butter-, Isobutter-, Valerian-, Iso-valeriansäure auf die Inaktivierung von S. Typhimurium DT104 untersucht. In Versuchen mit den Einzelsäuren und Dosen der Salmonellen, die über den Gehalten nativer Gülle lagen, konnte eine Inaktivierung erst bei Konzentratio-nen von 10 bis 40 g/l erzielt werden. Da diese Konzentrationen laut der zu Grunde gelegten Gülleanalyse in den jeweiligen Einzelfällen nicht erreicht wurden, erfolgte die Prüfung der Säuren gegenüber den Salmonellen im Kom-plex. Dazu wurde ein Säuregemisch hergestellt, das den ermittelten Konzentra-tionen der Säuren in der Rindergülle plus Cosubstraten entspricht und auf ei-nen pH-Wert von 7,3 eingestellt. In dieser Säurelösung wurden Salmonellen täglich um durchschnittlich 0,5 Zehnerpotenzen reduziert und in drei Ver-suchsansätzen innerhalb von durchschnittlich 17 Tagen inaktiviert. Mit diesen Daten wird der Einfluß von in der Gülle vorkommenden Konzentrationen or-ganischer Säuren auf S. Typhimurium DT104 erstmals quantifiziert. Aus den Untersuchungen wird der Schluß gezogen, dass für das Absterben von S. Typhimurium DT104 während der 24 bis 33 Tage andauernden natürlichen Fermentation der Gülle in der Biogasanlage der Anstieg und der Einfluß der Karbonsäuren sehr wesentlich ist. Die nach der Vakzinierung der Kälber mit dem Lebendimpfstoff Zoosaloral® ausgeschiedenen Salmonellenimpfstämme waren auch nach Passage der Bio-gasanlage durch ihr auxotrophes Verhalten sicher von Wildstämmen zu unter-scheiden. Bei der Untersuchung von Gülle aus mit Salmonella-Lebendvakzinen geimpften Rinderbeständen ist das Mitführen des Bovisal-Diagnostikums® zu empfehlen. Bei den natürlich vorkommenden Salmonellen-Serovaren wurden zahlreiche Resistenzen gegenüber unterschiedlichen Antibiotika festgestellt. Die Zoosalo-ral®-Impfstämme wiesen nach der Passage der Biogasanlage keine veränderten Resistenzen auf. Die Zoosaloral®-Impfstämme sind resistent gegen Spectinomy-cin, Erythromycin und Penicillin. / We investigated the natural inactivation of Salmonella in the stuff of a meso-philic biogas plant where cattle slurry, poultry waste and fat separator contents are fermented in a two-step process for the use of alternative energy recovery. From 1997 to 2000 we isolated 12 different Salmonella serovars (e. g. S. Enteriti-dis, S. Agona, S. Hadar) in the native sludge, in the fermenter material and in the fermentation product. The following parts of the samples were Salmonella-positive: cattle slurry 95,5% (n = 22), fermenter I 69,2% (n =13), fermenter II 50% (n = 20), storage tank 77,3% (n = 22), and fat separator 40% (n = 10). As source of the Salmonella we assume the slurry of the dairy cattle farm (esp. in the case of vaccine strains) and the fat separator contents. After an infection of cattle with S. Typhimurium in the sludge-producing farm and vaccination of calves with Zoosaloral® the vaccine strain (LT: DT009) was frequently found in the slurry. In the course of 13 tests we isolated the vaccine strain in 12 samples of the biogas plant slurry, in one sample of the fermenta-tion product and in 5 samples of the storage tank. In laboratory investigations we studied the inactivation of S. Typhimurium DT104 in fermented cattle slurry at storage temperatures of 7°C, 22°C, and 37°C. After a mean storage time of 10 days at 37°C (i.e. the working tempera-ture of the biogas plant) all Salmonella were inactivated. At 22°C they survived nine weeks, at 7°C more than 52 weeks. The microbiologic degradation causes the splitting of macromolecules and the formation of free volatile acides (VFA). After analysis of the VFA in cattle slurry and cosubstrates we tested different concentrations of formic, acetic, propionic, butyric, isobutyric, valerianic, and isovalerianic acid. In tests with the single acids and Salmonella concentrations higher than in native slurry an inactivation was achieved at acid concentrations between 10-40 mg/l. Because acid concen-trations in native sludge are lower, we examined an acid mixture with acid con-centrations equivalent to cattle slurry/cosubstrate at pH 7,3. In the mixture Salmonalla were daily reduced about 0,5 orders and inactivated in an average of 17 days. These data quantify the influence of VFA concentrations in slurry for the first time. We concluded that the increase and the influence of VFA are very important for the inactivation of S. Typhimurium DT104 during the 24-33 days of slurry fer-mentation in the biogas plant. After vaccination of calves with the live vaccine Zoosaloral® the excreted Salmonella vaccine strains could be distinguished after the passage of the biogas plant by their auxotrophy from wild strains. We rec-ommend the use of Bovisaloral-Diagnostikum® for investigations of slurry from cattle vaccinated with Salmonella live vaccine. The natural Salmonella serovars were resistant against numerous antibiotics. The Zoosaloral® vaccine strains showed no deviating resistances after passag-ing the biogas plant. The Zoosaloral® vaccine strains were spectinomycine-, erythromycine- and penicilline-resistent.

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Grape seed extract (GSE) and peanut skin extract (PSE) are waste products in the wine and peanut industries. Both extracts have high concentrations of polyphenols, known to possess antioxidant and antimicrobial properties. A subcategory of polyphenol is procyanidin, which can be divided into two types, type A and type B. Type A (PSE), contains two single bonds connecting the phenolic groups while type B (GSE), contains one single bond connecting the phenolic groups. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the two extracts was evaluated for their antimicrobial effect on Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7, and Salmonella Typhimurium using the pour plate method. GSE was found to have a significantly lower MIC (p ≤ 0.05) than PSE for L. monocytogenes (GSE=60.60ppm, PSE=not found), S. aureus (GSE=38.63ppm, PSE=51.36ppm), and S. Typhimurium (GSE=45.73ppm, PSE=60.60ppm). There was no significant difference in inhibition of E. coli O157:H7 (GSE=47.44ppm, PSE=51.13ppm). Since GSE, contributed to greater pathogen inhibition, its extract was fractionated into monomer and oligomers components. Growth curves of all four pathogens inoculated in the monomer and oligomer fractions were compared using the BioScreen method. Oligomers inhibited growth of L. monocytogenes, S. aureus, and E. coli O157:H7 while monomers inhibited growth of S. Typhimurium. These results indicate that an extract with type B procyanidins that are high in oligomers may be more effective as antimicrobials. Type B procyanidins have also been shown to prevent bacterial adhesion, as is the case with urinary tract infections, and may aid in the prevention of biofilms. / Master of Science in Life Sciences

[ES] Actualmente, una de las principales preocupaciones de las autoridades sanitarias y de la industria alimentaria sigue siendo garantizar la inocuidad microbiológica en la cadena alimentaria ya que a pesar de los notables esfuerzos realizados, el número de brotes y casos de enfermedades de transmisión alimentaria causadas por microorganismos sigue elevándose. Por otro lado, otro de los problemas que debe afrontar la industria alimentaria es la implementación de nuevas alternativas de producción más sostenibles, manteniendo altos estándares de seguridad y garantizando la disponibilidad de alimentos. En este contexto se enmarca la presente tesis doctoral, cuyo principal objetivo es la evaluación in vivo e in vitro de la capacidad antimicrobiana de distintas sustancias naturales procedentes de fuentes alternativas, más sostenibles (extracto de coliflor, espirulina y soluciones de quitosano), frente a microorganismos patógenos de importancia en la industria de alimentos. Los estudios demuestran la capacidad antimicrobiana in vitro del quitosano de insecto y crustáceo frente a microorganismos patógenos como E. coli, L. monocytogenes y S. Typhimurium siendo dependiente del pH del medio estudiado. Además, cuando el quitosano se combina con un tratamiento suave de altas presiones hidrostáticas, se pone de manifiesto una relación sinérgica entre ambas tecnologías llegando a inactivar completamente la carga microbiana de S. Typhimurium. Los estudios in vivo llevados a cabo con Caenorhabditis elegans muestran que el nematodo aumenta su supervivencia en presencia de extractos de coliflor y espirulina. En cuanto a la capacidad antimicrobiana, los extractos de espirulina y de coliflor reducen la colonización intestinal por S. Typhimurium en el nema todo mostrando así su capacidad antimicrobiana in vivo. En la presente tesis doctoral, se hace un recorrido completo sobre la capacidad antimicrobiana de ciertos extractos vegetales o componentes procedentes de animales, fundamentalmente basados en estudios in vivo. Este es un paso importante en la materialización de estos compuestos como alternativas más naturales y sostenibles a otros compuestos sintéticos usados en conservación de alimentos. / [CA] Actualment, una de les principals preocupacions de les autoritats sanitàries i de la indústria alimentària continua sent garantir la innocuïtat microbiològica en la cadena alimentària ja que malgrat els notables esforços realitzats, el nombre de brots i casos de malalties de transmissió alimentària causades per microorganismes continua elevant-se. D'altra banda, un altre dels problemes que ha d'afrontar la indústria alimentària és la implementació de noves alternatives de producció més sostenibles, mantenint alts estàndards de seguretat i garantint la disponibilitat d'aliments. En aquest context s'emmarca la present tesi doctoral, el principal objectiu de la qual és l'avaluació in vivo i in vitro de la capacitat antimicrobiana de diferents substàncies naturals procedents de fonts alternatives, més sostenibles (extracte de coliflor, espirulina i solucions de quitosano), enfront de microorganismes patògens d'importància en la indústria d'aliments. Els estudis demostren la capacitat antimicrobiana in vitro del quitosano d'insecte i crustaci enfront de microorganismes patògens com a E. coli, L. monocytogenes i S. Typhimurium sent dependent del pH del mig estudiat. A més, quan el quitosano es combina amb un tractament suau d'altes pressions hidroestàtiques, es posa de manifest una relació sinèrgica entre totes dues tecnologies arribant a inactivar completament la càrrega microbiana de S. Typhimurium. Els estudis in vivo duts a terme amb Caenorhabditis elegans mostren que el nematode augmenta la seua supervivència en presència d'extractes de coliflor i espirulina. Quant a la capacitat antimicrobiana, els extractes d'espirulina i de coliflor redueixen la colonització intestinal per S. Typhimurium en el nematode mostrant així la seua capacitat antimicrobiana in vivo. En la present tesi doctoral, es fa un recorregut complet sobre la capacitat antimicrobiana d'uns certs extractes vegetals o components procedents d'animals, fonamentalment basats en estudis in vivo. Aquest és un pas important en la materialització d'aquests compostos com a alternatives més naturals i sostenibles a altres compostos sintètics usats en conservació d'aliments. / [EN] Currently, one of the main concerns of the health authorities and the food industry continues to be ensuring microbiological safety in the food chain, as despite considerable efforts, the number of outbreaks and cases of foodborne diseases caused by microorganisms continues to rise. On the other hand, another chalenge facing the food industry is the implementation of new, more sustainable production alternatives while maintaining high safety standards and ensuring food availability. It is in this context, the main objective of this PhD thesis is the in vivo and in vitro evaluation of the antimicrobial capacity of different natural substances from alternative, more sustainable sources (cauliflower extract, spirulina and chitosan solutions) against pathogenic microorganisms of importance in the food industry. Studies demonstrate the in vitro antimicrobial capacity of insect and crustacean chitosan against pathogenic microorganisms such as E. coli, L. monocytogenes and S. Typhimurium, being dependent on the pH of the medium studied. Moreover, when chitosan is combined with a mild treatment of high hydrostatic pressures, a synergistic relationship between both technologies is evident, reaching the point of completely inactivating the microbial load of S. Typhimurium. In vivo studies carried out with Caenorhabditis elegans show that the nematode increases its survival in the presence of cauliflower and spirulina extracts. In terms of antimicrobial capacity, spirulina and cauliflower extracts reduce intestinal colonization by S. Typhimurium in the nematode, thus showing their antimicrobial capacity in vivo. In this doctoral thesis, a complete overview of the antimicrobial capacity of certain plant extracts or animal-derived compounds is presented, mainly based on in vivo studies. This is an important step in the materialisation of these compounds as more natural and sustainable alternatives to other synthetic compounds used in food preservation. / La presente tesis doctoral se enmarca dentro del Programa de Doctorado Ciencia, Tecnología y Gestión Alimentaria de la Universidad Politécnica de Valencia. El trabajo experimental se realizó gracias a fondos del Ministerio de Ciencia e Innovación y del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), a través del proyecto: Validación de nuevas herramientas y procesos para el análisis y la mejora de la seguridad alimentaria microbiológica: aplicación a nuevas matrices alimentarias (AGL2017-86840-C2-2-R) del Programa Estatal de Investigación, Desarrollo e Innovación Orientada a los Retos de la Sociedad. / Ibáñez Peinado, D. (2022). Estudio de la capacidad antimicrobiana de sustancias naturales in vivo e in vitro [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/184317