Lors de la dégradation du peroxyde d'hydrogène en eau et dioxygène catalysée par les hémoenzymes à fer de type catalase et peroxydase, il se forme à l'échelle de la milliseconde un intermédiaire réactionnel radicalaire porté par la porphyrine. Dans le cas de l'enzyme modèle utilisée, la catalase de foie de bœuf, il a été montré par des études de spectroscopie RPE que ce radical est ensuite délocalisé sur un résidu tyrosyle de la chaîne polypeptidique. A ce jour, on ne connaît pas l'exacte localisation du résidu impliqué, donc le rôle de ce site d'oxydation alternatif. <br />Par ailleurs, il a été montré au laboratoire que l'identification et la quantification des radicaux formés sur les acides aminés d'une protéine par l'attaque de radicaux hydroxyle sont possibles. Cette méthode est basée sur le marquage au tritium des résidus acides aminés. Notre approche est basée sur la génération de radicaux hydroxyle par radiolyse de l'eau. Les radicaux hydroxyle formés arrachent un hydrogène sur la chaîne latérale des acides aminés et génèrent ainsi un radical carboné. Il est ensuite “réparé” in situ par un composé, le sel sodique de l'acide phénylphosphinique tritié, qui permet d'introduire un atome de tritium à la place de l'hydrogène précédemment arraché. Cet atome de tritium sert de marqueur pour détecter les sites de formation des radicaux. <br />Nous avons donc utilisé les propriétés de réparation du vecteur tritié pour identifier quelle est la tyrosine impliquée dans les transferts d'électrons de la BLC. Même s'il a été montré par RPE que la disparition du radical porté par la tyrosine est effective en présence de l'agent de réparation, les études de marquage n'ont pas abouti à déterminer l'exacte localisation du radical. Une des raisons invoquées est le manque d'efficacité de l'agent de réparation pour transférer son atome d'hydrogène. C'est pourquoi d'autres composés capables eux aussi de fournir un atome d'hydrogène par voie radicalaire ont été synthétisés puis testés sur ce système enzymatique par une étude de spectroscopie RPE.<br />En parallèle, nous avons voulu comprendre les mécanismes d'action des ces mêmes composés sur un système modèle en générant des radicaux sur la tyrosine en solution par radiolyse de l'eau. La méthode consiste à produire dans une solution aqueuse de tyrosine des radicaux hydroxyle, qui vont former les radicaux tyrosyle. Les radicaux ainsi générés peuvent être ensuite réparés par un atome de deutérium fourni par un donneur. L'incorporation en deutérium et la régiosélectivité de l'attaque sont ensuite analysées par spectrométrie de masse et RMN 2H. L'irradiation de solution de tyrosine en présence des différents composés choisis s'est révélée difficile à analyser, en raison notamment de la difficulté à déterminer la proportion de radicaux hydroxyle réagissant avec l'agent réparateur au lieu de la tyrosine, mais surtout en raison de l'incorporation inattendue de deutérium dans la tyrosine en l'absence de tout agent de transfert. Ce phénomène jusqu'alors inconnu a, dès lors, retenu toute notre attention. Nous avons alors focalisé nos travaux sur la compréhension des processus intervenant dans l'autoréparation de la tyrosine et ainsi proposé un mécanisme pour expliquer nos observations.

EPR spectroscopy of site-directed spin labeled proteins is extremely informative in the studies of protein dynamics; however, it is difficult to interpret the spectra in terms of the conformational dynamics in atomic detail.In the present work we aimed to investigate the site-specific structural dynamics of proteins by using MD simulations upon analyzing and interpreting the EPR data. The major goal of this work is to know how far the computer simulations can meet the experiments. As a first step, MD simulations are performed to identify the location and orientation of the tyrosine radical in the R2 subunit of ribonucleotide reductase. The MD results show that the tyrosine is moving away from the diiron center in its radical state. This data is in agreement with EPR results and suggests reorientation of the tyrosine radical when compared to its neutral state. In further studies, the behavior of a methanethiosulfonate spin label, R1, in various environments of the protein is characterized by using MD simulations. RMSD analysis and angle ß distributions of the nitroxide show that R1 in buried sites in a protein helix is significantly immobile and in surface exposed sites it is highly mobile. Analyses of MD data suggest that internal rotations of x4 and x5 dihedrals of R1 are dominant in the R1 dynamics.Our studies also show that interaction with the surrounding residues show significant influence on the dynamics of R1. MD simulations data of the vinculin tail protein, both in water and in vacuo, are compared to the experimental results for further analysis of 12 different R1 sites in various environments.In a study on the photosynthetic reaction center(RC),MD is used to identify the location of the R1 binding site (H156)and thereby exploring the conformational dynamics in the RC protein upon light activation. The distance between the primary quinone, QA, and H156R1 determined from MD is in reasonable agreement with that measured by EPR.