Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription. / Biochemical, genetic and structural studies made over the last years bring a new view on the RNA polymerase II (Pol II) machinery and the process by which it decodes the genetic information. They provided new insights into the diversity of the transcriptional regulation mechanisms, and on the role played by the general transcription factors (GTFs). The studies presented in this thesis provide new evidence on the role of human GTFs in the regulation of different stages of transcription. In the first part of the thesis, we investigated the function of the human Pol II and GTFs in living cells, by systematically analyzing their genomic location. The location profiles obtained by chromatin immunoprecipitation (ChIP) of TAP (tandem-affinity purification) tagged versions of these factors indicate new in vivo functions for several components of this machinery, and for structural elements of the Pol II. These results suggest that TFIIF and the heterodimer Rpb4–Rpb7 have a specific function during the elongation stage in vivo. Additionally, our study offers for the first time a general picture of GTFs function during the Pol II transcription reaction in live mammalian cells, and provides a framework to uncover new regulatory hubs. Secondly, we report on the identification of a new function of the factor TFIIS in the regulation of CDK9, the kinase subunit of the Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). We identify two interaction partners for TFIIS, namely CDK9 and the E3 ubiquitin ligase UBR5. We show that UBR5 catalyzes the ubiquitination of CDK9 in vitro. Moreover, the polyubiquitination of CDK9 in human cells is dependent upon both UBR5 and TFIIS, and does not signal its degradation. We also show that UBR5, CDK9 and TFIIS co-localize along specific regions of the  fibrinogen (FBG) gene, and that the overexpression of TFIIS increases the occupancy of CDK9 along this gene in a UBR5 dependant manner. We propose a new function of TFIIS in the transition between initiation and elongation stages, by regulating the stability of the early CDK9-Pol II transcribing complexes. Key words: chromatin immunoprecipitation, general transcription factors, tandem-affinity purification, RNA polymerase II, Rpb4–Rpb7 heterodimer, transcription factor IIF (TFIIF), transcription factor IIS (TFIIS), UBR5 ubiquitin ligase, Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb), CDK9 ubiquitination.

Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription. / Biochemical, genetic and structural studies made over the last years bring a new view on the RNA polymerase II (Pol II) machinery and the process by which it decodes the genetic information. They provided new insights into the diversity of the transcriptional regulation mechanisms, and on the role played by the general transcription factors (GTFs). The studies presented in this thesis provide new evidence on the role of human GTFs in the regulation of different stages of transcription. In the first part of the thesis, we investigated the function of the human Pol II and GTFs in living cells, by systematically analyzing their genomic location. The location profiles obtained by chromatin immunoprecipitation (ChIP) of TAP (tandem-affinity purification) tagged versions of these factors indicate new in vivo functions for several components of this machinery, and for structural elements of the Pol II. These results suggest that TFIIF and the heterodimer Rpb4–Rpb7 have a specific function during the elongation stage in vivo. Additionally, our study offers for the first time a general picture of GTFs function during the Pol II transcription reaction in live mammalian cells, and provides a framework to uncover new regulatory hubs. Secondly, we report on the identification of a new function of the factor TFIIS in the regulation of CDK9, the kinase subunit of the Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). We identify two interaction partners for TFIIS, namely CDK9 and the E3 ubiquitin ligase UBR5. We show that UBR5 catalyzes the ubiquitination of CDK9 in vitro. Moreover, the polyubiquitination of CDK9 in human cells is dependent upon both UBR5 and TFIIS, and does not signal its degradation. We also show that UBR5, CDK9 and TFIIS co-localize along specific regions of the  fibrinogen (FBG) gene, and that the overexpression of TFIIS increases the occupancy of CDK9 along this gene in a UBR5 dependant manner. We propose a new function of TFIIS in the transition between initiation and elongation stages, by regulating the stability of the early CDK9-Pol II transcribing complexes. Key words: chromatin immunoprecipitation, general transcription factors, tandem-affinity purification, RNA polymerase II, Rpb4–Rpb7 heterodimer, transcription factor IIF (TFIIF), transcription factor IIS (TFIIS), UBR5 ubiquitin ligase, Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb), CDK9 ubiquitination.

ARMC5 est une protéine qui contient sept motifs Armadillo répétitifs organisés en tandem et un domaine BTB. Nous avons observé que cette protéine était fortement exprimée dans les organes lymphoïdes, les glandes surrénales et le cerveau. Les souris avec une délétion d’Armc5 (souris KO) étaient de petite taille, et présentaient une diminution de la prolifération et la différenciation des lymphocytes T. L’absence d’ARMC5 entraînait une déficience de la réponse immunitaire médiée par les lymphocytes CD4+ et CD8+ dans les modèles expérimentaux d’encéphalomyélite auto-immune et d’infection au virus de la chorioméningite lymphocytaire, respectivement. Par la suite, plusieurs études ont révélé que la mutation ARMC5 était associée à l’hyperplasie macronodulaire bilatérale primitive des surrénales (HMBPS), qui représente une cause rare du syndrome de Cushing. Nous avons ensuite confirmé que l’hyperplasie des glandes surrénales s’était développée chez les souris KO âgées, et qu’elle s’accompagnait d’une légère augmentation des taux sériques de glucocorticoïdes. Comme ARMC5 ne présentait pas d’activité enzymatique, il était probable qu’elle faisait appel à d’autres protéines pour exercer sa fonction. Nous avons identifié plusieurs protéines qui se liaient à ARMC5, et plus particulièrement le complexe ARMC5/Cullin3 qui formait une ubiquitine ligase (E3) spécifique de la sous-unité RPB1 de l’ARN polymérase II. ARMC5 contrôlait le processus d’ubiquitination de RPB1 qui, par conséquent, s’accumulait dans plusieurs organes majeurs : les glandes surrénales, les ganglions lymphatiques, le cerveau, les poumons, le foie, etc. chez la souris KO. Ces résultats démontrent un rôle clé de l’ubiquitine ligase dans la dégradation de la protéine RPB1. Une accumulation similaire a également été observée dans les tissus hyperplasiques des surrénales provenant de patients atteints d’HMBPS et porteurs de la mutation ARMC5, ce qui souligne la pertinence clinique de nos résultats de recherche fondamentale dans les maladies humaines. Un défaut de dégradation de RPB1 augmentait le pool d’ARN polymérase II. Par ailleurs, nous avons identifié un groupe de gènes fortement surexprimés dans les glandes surrénales déficientes en ARMC5, parmi lesquels figurent les gènes effecteurs qui seraient impliqués dans l’hyperplasie des surrénales chez les souris KO et l’HMBPS chez les patients porteurs de la mutation ARMC5. Finalement, nous avons montré que la délétion ou la mutation d’Armc5 augmentait considérablement le risque des anomalies du tube neural chez les souris et les humains. Chez les patients souffrant de myéloméningocèle, nous avons constaté neuf différentes mutations faux-sens délétères, dont une diminuait l’interaction entre ARMC5 et RPB1. L’augmentation du pool d’ARN polymérase II dans les cellules précurseurs neurales (CPN), causée par la délétion ARMC5, influençait un groupe particulier de gènes, dont certains (p. ex. Folh1) seraient susceptibles de participer au développement du tube neural. En résumé, l’association ARMC5 et Cullin3 forme un complexe E3 qui cible RPB1 provoquant son ubiquitination et sa dégradation. En absence d’un tel mécanisme, on observe une perturbation de l’homéostasie de l’ARN polymérase II, qui mène à une diminution de la réponse immunitaire médiée par lymphocytes T, le développement d’HMBPS et un risque accru d’anomalies du tube neural. / ARMC5 protein contains seven tandem Armadillo repeats and one BTB domain. We observed that Armc5 was highly expressed in the lymphatic organs, adrenal glands, and brain. Armc5 knockout (KO) mice were small in size and exhibited compromised T cell proliferation and differentiation. The absence of ARMC5 resulted in an impairment of the CD4 + cell- and CD8 + cell-mediated immune response in the experimental autoimmune encephalomyelitis model and lymphocytic choriomeningitis virus infection model, respectively. Subsequently, several studies revealed that ARMC5 mutations were related to primary bilateral macronodular adrenal hyperplasia (PBMAH), which is a rare cause of Cushing’s syndrome. We then confirmed that adrenal gland hyperplasia was indeed developed in aged Armc5 KO mice with mildly increased serum glucocorticoid levels. Since ARMC5 did not exhibit enzymatic activity, its function likely depends on the interaction with other proteins. We identified several proteins that binds to ARMC5, most notably ARMC5 binding to Cullin3, forming a ubiquitin ligase (E3) specific for RNA polymerase II subunit I (RPB1). ARMC5 regulated the ubiquitination of RPB1, and its deletion resulted in RPB1 accumulation in major organs (e.g., adrenal glands, lymph nodes, brain, lung, and liver), indicating the critical role of this E3 in RPB1 degradation. A similar accumulation was also found in hyperplasia tissues from adrenal glands of PBMAH patients carrying ARMC5 mutations, underscoring the clinical relevance of our basic research findings in human disease. Defective degradation of RPB1 led to an enlarged RNA polymerase II (Pol II) pool. In addition, we have identified a group of genes strongly upregulated in KO adrenal glands, including the effector genes which would be involved in adrenal gland hyperplasia in Armc5 KO mice and PBMAH patients carrying ARMC5 mutation. Finally, we have shown that deleting or mutating Armc5 significantly augments the risk of neural tube defects in mice and humans. In patients with myelomeningocele, we found nine deleterious missense mutations in ARMC5, one of which weakened the interaction between ARMC5 and RPB1. The enlarged Pol II pool in Armc5 KO neural precursor cells (NPCs) influenced a particular group of genes, some of which (e.g., Folh1) are thought to be involved in the development of the neural tube. In summary, ARMC5 and CUL3 form an E3 complex, which targets RPB1 causing its ubiquitination and degradation. In the absence of such a mechanism, there is a disturbance of RNA polymerase II homeostasis, which leads to a decrease in the T cell-mediated immune response, the development of PBMAH and an increased risk of neural tube defects.