A urocortina 2 (Ucn2) é um peptídeo que pertence à família dos fatores liberadores de corticotrofina (CRF) e, assim como seu receptor específico CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), encontram-se expressos no músculo esquelético. Embora tenha sido demonstrado que o tratamento sistêmico com Ucn2 seja capaz de induzir hipertrofia e prevenir a perda de massa muscular, nada se conhece acerca dos mecanismos moleculares através dos quais a Ucn2 desempenha suas ações biológicas. O principal objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo de ação da Ucn2 no músculo esquelético de roedores para o aparecimento da resposta hipertrófica e a possível participação das vias de sinalização Akt/mTOR, Akt/Foxo e ERK1/2 neste efeito anabólico. Para isto foi utilizado o modelo de transfecção in vivo da Ucn2 pelo método da eletroporação em músculos tibialis anterior de camundongos. Nestes músculos foram quantificados: 1) o estado de fosforilação de componentes efetores destas vias; 2) moléculas sinalizadoras da via autofágica; 3) a taxa de síntese proteica in vivo e 4) a expressão de genes relacionados à atrofia muscular (atrogenes). Outra metodologia utilizada para verificar o efeito direto da Ucn2 na musculatura esquelética foi a incubação in vitro de músculos soleus e EDL isolados de roedores com este peptídeo a fim de investigar a taxa de degradação proteica total, bem como a atividade dos sistemas proteolíticos lisossomal¸ ubiquitina-proteassoma e dependente de Ca+2. A superexpressão in vivo da Ucn2 por 14 dias promoveu hipertrofia e preveniu a atrofia em músculos tibialis anterior de camundongos normais e submetidos ao modelo de desnervação motora isquiática.Resumo Este crescimento muscular induzido pela Ucn2 in vivo foi associado a ativação das vias de sinalização AMPc/PKA/CREB, AMPc/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 e ERK1/2/eIF4E com consequente estimulação da síntese proteica. Em concordância, utilizando uma técnica de manipulação genética in vivo, demonstramos que a hipertrofia promovida pela Ucn2 é dependente da estimulação das cascatas de sinalização ativadas por Akt e ERK1/2. Ademais, essa alteração fenotípica promovida pela Ucn2 induziu melhora da resistência à fadiga muscular, sendo este impacto funcional dependentente de ERK1/2, mas não de Akt. Além disso, a superexpressão da Ucn2 induziu \"shifting\" para o tipo de fibra oxidativa (tipo I), sendo esta plasticidade possivelmente mediada por PGC-1?, o que pode ter contribuído pelo menos em parte, para o efeito benéfico promovido pela Ucn2 na função muscular. O efeito antiatrófico da Ucn2 in vivo foi associado à estimulação da via Akt/Foxo1,3 concomitante com a redução da atividade transcricional de Foxo, resultando na diminuição da expressão da E3-ligase atrogin-1 e do gene autofágico LC3. Em paralelo, a Ucn2 in vivo promoveu inibição do fluxo autofágico, inferido pelo acúmulo das proteínas LC3-I, LC3-II e p62 nestes músculos. Corroborando os achados in vivo, os efeitos antiproteolíticos da Ucn2 in vitro parecem ser mediados pelo AMPc e envolvem a supressão da atividade do sistema lisossomal/autofágico em músculos EDL de ratos normais. Portanto, além da participação de efetores dowsntream do AMPc, como PKA e EPAC, diferentes quinases participam dos efeitos biológicos da Ucn2 na musculatura esquelética. Esses resultados são importantes para caracterizar novas estratégias terapêuticas capazes de atuar no combate à atrofia muscular em diversas situações catabólicas. / Urocortin 2 (Ucn2) is a peptide that belongs to corticotrophin releasing factors (CRF) family and, as well as its specific receptor CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), are expressed in skeletal muscle. Although it has been demonstrated that Ucn2 systemic treatment is able to induce hypertrophy and prevent loss of muscle mass, nothing is known about the molecular mechanisms through which Ucn2 plays its biological actions. The main objective of this work was to investigate the Ucn2 mechanism of action in rodent skeletal muscle for the appearance of the hypertrophic response and the possible participation of Akt/mTOR, Akt/Foxo and ERK1/2 signaling pathways in this anabolic effect. For this, an in vivo transfection model of Ucn2 was used by the electroporation method in tibialis anterior muscles of mice. Were quantified in these muscles: 1) the phosphorylation state of effector components of these pathways; 2) signaling molecules of the autophagic pathway; 3) the rate of protein synthesis in vivo and 4) the expression of genes related to muscle atrophy (atrogenes). Another methodology used to verify the direct effect of Ucn2 in skeletal muscle was the incubation of soleus and EDL muscles isolated from rodents with this peptide in vitro in order to investigate the total rate of protein degradation, as well as the activity of the lysosomal, ubiquitin-proteasome and Ca+2 dependent proteolytic systems. Ucn2 overexpression in vivo for 14 days promoted hypertrophy and prevented atrophy in tibialis anterior muscles of normal mice and submitted to the sciatic motor denervation model. This muscle growth induced by Ucn2 in vivo was associated with the activation ofAbstract cAMP/PKA/CREB, cAMP/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 and ERK1/2/eIF4E signaling pathways with consequent stimulation of protein synthesis. In agreement, using a genetic manipulation technique in vivo, we demonstrated that the hypertrophy promoted by Ucn2 is dependent on the stimulation of the signaling cascades activated by Akt and ERK1/2. In addition, this phenotypic alteration promoted by Ucn2 induced an improvement in muscle fatigue resistance, being this functional impact dependent on ERK1/2, but not on Akt. Moreover, Ucn2 overexpression in vivo induced the shift to type I oxidative fiber, and this plasticity is possibly mediated by PGC-1?, which may have contributed at least in part to the beneficial effect promoted by Ucn2 in muscle function. The anti-atrophic effect of Ucn2 in vivo was associated with the stimulation of Akt/Foxo1,3 pathway concomitant with the reduction of Foxo transcriptional activity, resulting in a decrease in the expression of the atrogin-1 E3-ligase and of the autophagic gene LC3. In parallel, Ucn2 in vivo promoted inhibition of autophagic flow, inferred by the accumulation of LC3-I, LC3-II and p62 proteins in these muscles. Corroborating the in vivo findings, the antiproteolytic effects of Ucn2 in vitro appear to be mediated by cAMP and involve the suppression of lysosomal/autophagic system activity in EDL muscles of normal rats. Thus, in addition to the participation of cAMP dowsntream effectors, such as PKA and EPAC, different kinases participate in the biological effects of Ucn2 on skeletal muscle. These results are important to characterize new therapeutic strategies able to prevent muscular atrophy in several catabolic situations.

A urocortina 2 (Ucn2) é um peptídeo que pertence à família dos fatores liberadores de corticotrofina (CRF) e, assim como seu receptor específico CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), encontram-se expressos no músculo esquelético. Embora tenha sido demonstrado que o tratamento sistêmico com Ucn2 seja capaz de induzir hipertrofia e prevenir a perda de massa muscular, nada se conhece acerca dos mecanismos moleculares através dos quais a Ucn2 desempenha suas ações biológicas. O principal objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo de ação da Ucn2 no músculo esquelético de roedores para o aparecimento da resposta hipertrófica e a possível participação das vias de sinalização Akt/mTOR, Akt/Foxo e ERK1/2 neste efeito anabólico. Para isto foi utilizado o modelo de transfecção in vivo da Ucn2 pelo método da eletroporação em músculos tibialis anterior de camundongos. Nestes músculos foram quantificados: 1) o estado de fosforilação de componentes efetores destas vias; 2) moléculas sinalizadoras da via autofágica; 3) a taxa de síntese proteica in vivo e 4) a expressão de genes relacionados à atrofia muscular (atrogenes). Outra metodologia utilizada para verificar o efeito direto da Ucn2 na musculatura esquelética foi a incubação in vitro de músculos soleus e EDL isolados de roedores com este peptídeo a fim de investigar a taxa de degradação proteica total, bem como a atividade dos sistemas proteolíticos lisossomal¸ ubiquitina-proteassoma e dependente de Ca+2. A superexpressão in vivo da Ucn2 por 14 dias promoveu hipertrofia e preveniu a atrofia em músculos tibialis anterior de camundongos normais e submetidos ao modelo de desnervação motora isquiática.Resumo Este crescimento muscular induzido pela Ucn2 in vivo foi associado a ativação das vias de sinalização AMPc/PKA/CREB, AMPc/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 e ERK1/2/eIF4E com consequente estimulação da síntese proteica. Em concordância, utilizando uma técnica de manipulação genética in vivo, demonstramos que a hipertrofia promovida pela Ucn2 é dependente da estimulação das cascatas de sinalização ativadas por Akt e ERK1/2. Ademais, essa alteração fenotípica promovida pela Ucn2 induziu melhora da resistência à fadiga muscular, sendo este impacto funcional dependentente de ERK1/2, mas não de Akt. Além disso, a superexpressão da Ucn2 induziu \"shifting\" para o tipo de fibra oxidativa (tipo I), sendo esta plasticidade possivelmente mediada por PGC-1?, o que pode ter contribuído pelo menos em parte, para o efeito benéfico promovido pela Ucn2 na função muscular. O efeito antiatrófico da Ucn2 in vivo foi associado à estimulação da via Akt/Foxo1,3 concomitante com a redução da atividade transcricional de Foxo, resultando na diminuição da expressão da E3-ligase atrogin-1 e do gene autofágico LC3. Em paralelo, a Ucn2 in vivo promoveu inibição do fluxo autofágico, inferido pelo acúmulo das proteínas LC3-I, LC3-II e p62 nestes músculos. Corroborando os achados in vivo, os efeitos antiproteolíticos da Ucn2 in vitro parecem ser mediados pelo AMPc e envolvem a supressão da atividade do sistema lisossomal/autofágico em músculos EDL de ratos normais. Portanto, além da participação de efetores dowsntream do AMPc, como PKA e EPAC, diferentes quinases participam dos efeitos biológicos da Ucn2 na musculatura esquelética. Esses resultados são importantes para caracterizar novas estratégias terapêuticas capazes de atuar no combate à atrofia muscular em diversas situações catabólicas. / Urocortin 2 (Ucn2) is a peptide that belongs to corticotrophin releasing factors (CRF) family and, as well as its specific receptor CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), are expressed in skeletal muscle. Although it has been demonstrated that Ucn2 systemic treatment is able to induce hypertrophy and prevent loss of muscle mass, nothing is known about the molecular mechanisms through which Ucn2 plays its biological actions. The main objective of this work was to investigate the Ucn2 mechanism of action in rodent skeletal muscle for the appearance of the hypertrophic response and the possible participation of Akt/mTOR, Akt/Foxo and ERK1/2 signaling pathways in this anabolic effect. For this, an in vivo transfection model of Ucn2 was used by the electroporation method in tibialis anterior muscles of mice. Were quantified in these muscles: 1) the phosphorylation state of effector components of these pathways; 2) signaling molecules of the autophagic pathway; 3) the rate of protein synthesis in vivo and 4) the expression of genes related to muscle atrophy (atrogenes). Another methodology used to verify the direct effect of Ucn2 in skeletal muscle was the incubation of soleus and EDL muscles isolated from rodents with this peptide in vitro in order to investigate the total rate of protein degradation, as well as the activity of the lysosomal, ubiquitin-proteasome and Ca+2 dependent proteolytic systems. Ucn2 overexpression in vivo for 14 days promoted hypertrophy and prevented atrophy in tibialis anterior muscles of normal mice and submitted to the sciatic motor denervation model. This muscle growth induced by Ucn2 in vivo was associated with the activation ofAbstract cAMP/PKA/CREB, cAMP/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 and ERK1/2/eIF4E signaling pathways with consequent stimulation of protein synthesis. In agreement, using a genetic manipulation technique in vivo, we demonstrated that the hypertrophy promoted by Ucn2 is dependent on the stimulation of the signaling cascades activated by Akt and ERK1/2. In addition, this phenotypic alteration promoted by Ucn2 induced an improvement in muscle fatigue resistance, being this functional impact dependent on ERK1/2, but not on Akt. Moreover, Ucn2 overexpression in vivo induced the shift to type I oxidative fiber, and this plasticity is possibly mediated by PGC-1?, which may have contributed at least in part to the beneficial effect promoted by Ucn2 in muscle function. The anti-atrophic effect of Ucn2 in vivo was associated with the stimulation of Akt/Foxo1,3 pathway concomitant with the reduction of Foxo transcriptional activity, resulting in a decrease in the expression of the atrogin-1 E3-ligase and of the autophagic gene LC3. In parallel, Ucn2 in vivo promoted inhibition of autophagic flow, inferred by the accumulation of LC3-I, LC3-II and p62 proteins in these muscles. Corroborating the in vivo findings, the antiproteolytic effects of Ucn2 in vitro appear to be mediated by cAMP and involve the suppression of lysosomal/autophagic system activity in EDL muscles of normal rats. Thus, in addition to the participation of cAMP dowsntream effectors, such as PKA and EPAC, different kinases participate in the biological effects of Ucn2 on skeletal muscle. These results are important to characterize new therapeutic strategies able to prevent muscular atrophy in several catabolic situations.

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Após a descrição da Urocortina 1, um neuropeptídeo encontrado principalmente no núcleo de Edinger-Westphal e no núcleo lateral superior da oliva (LSO), atentou-se para a ausência do conhecimento das projeções de ambos os núcleos. Nós pretendemos contribuir para o conhecimento das projeções ascendentes e descendentes do LSO, usando um traçador neuronal anterógrado. Nós utilizamos o Biotin-Dextran-Amine (BDA) injetado no LSO de ratos, 15 a 20 dias depois os ratos eram perfundidos, os encéfalos e medulas foram seccionados e tratados histoquimicamente. Nós encontramos que existem 4 vias eferentes do LSO, tanto ascendentes como descendentes no sistema nervoso central, como segue: duas vias ascendentes, uma ipsilateral à injeção, a mais proeminente e a via contralateral que é menos densa; duas vias descendentes, uma ipsilateral muito menos evidente, e a contralateral que é moderada. Seguindo a via ascendente ipsilateral, nós encontramos as seguintes estruturas bem marcadas com BDA: o próprio LSO, núcleo do corpo trapezóide, o lemnisco lateral e seus núcleos, colículos inferior e superior e os seguintes núcleos talâmicos: suprageniculado, geniculado medial, partes dorsal e medial e córtex somatosensorial primário. Seguindo a via descendente contralateral nós encontramos as seguintes estruturas: o LSO ipsi e contralateral, o núcleo do corpo trapezóide, núcleo coclear ventral, parte anterior, núcleo coclear dorsal, núcleo coclear ventral, parte posterior e VIII nervo. Os dados que nós encontramos neste trabalho sugerem que as vis do LSO podem se estender até o córtex somatosensorial no prosencéfalo e o complexo de núcleos cocleares no tronco, enviando colaterais para os principais núcleos relacionados a via auditiva, provavelmente contribuindo para a localização da fonte sonora, em acordo com a anatomia desta informação sensorial específica. / After the discovery of the Urocortin-1, a neuropeptide found mainly in the Edinger-Westphal nucleus and in the lateral superior olive nucleus (LSO), the attention was caught about the lack of known projections of both nuclei. We intended to contribute to the knowledge of both ascending and descending projections of the LSO, using a neuronal anterograde tracer. In order to do that we use the Biotin-Dextran-Amine (BDA) injected in the LSO of rats, fifteen to twenty days later the rats were perfused, the brains and spinal cords were cut and the sections treated histochemically. We have found that there are four pathways leaving the LSO either ascending or descending in the central nervous system, as following: two ascending pathways, one ipsilateral to the injection, the most proeminent one and the contralateral pathway that is less dense; two descending pathways, one ipsilateral, much less evident, and the contralateral that is very moderate. Tracking the ipsilateral ascending pathway we have found the following structures well labeled with BDA: the LSO itself, nucleus of the trapezoid body, the lateral lemniscus and its nuclei, inferior and superior colliculus, the following thalamic nuclei: suprageniculate, medial geniculate, dorsal and medial parts and the primary somatosensory cortex. Tracking the contralateral descending pathway we have found the following structures: the LSO ipsi and contralateral; the nucleus of the trapezoid body; ventral cochlear nucleus, anterior part; dorsal cochlear nucleus; ventral cochlear nucleus, posterior part and, the eight nerve. The data we have found in this work suggests that the pathways from the LSO could reach as far as the somatosensory cortex in the prosencephalon and the cochlear complex nuclei in the brainstem, sending collaterals to the main nuclei related to the auditory pathway, probably contributing to the localization of the sound source, due to the anatomy of this specific sensory information.

O neuropeptídeo urocortina 1 (UCN 1) tem entre os seus principais locais de expressão o núcleo de Edinger-Westphal (EW) e o núcleo lateral superior da oliva. Após sua descoberta, sugeriu-se que o EW e o núcleo paraventricular do hipotálamo (PVH) possuíssem papéis complementares e opostos na resposta ao estresse, porém, não existem trabalhos que relacionam anatomicamente núcleos hipotalâmicos e o EW. A fim de contribuir para esta área foi proposto o mapeamento das aferências hipotalâmicas do EW, através da injeção de Fluoro-Gold neste núcleo e posterior mapeamento de suas aferências. Os resultados encontrados foram: PVH, área hipotalâmica lateral (LHA) e o núcleo posterior do hipotálamo (PH) e outras regiões do sistema nervoso central. Para controle, o traçador anterógrado Amina Dextrana Biotinilada, foi injetado nos núcleos/áreas hipotalâmicas PVH, LHA e PH sendo encontradas fibras próximas as células urocortinérgicas do EW. Nossos dados mostram um possível envolvimento das células UCN 1 do EW com o controle de funções autonômicas e neuroendócrinas. / The neuropeptide urocortin 1 (UCN 1) has its main sites of expression at the Edinger-Westphal nucleus (EW) and the lateral superior olivary nucleus. After its discovery has suggested that EW and paraventricular nucleus of hypothalamus (PVH) have complementary and opposing roles in the stress response. However, there are no works relating anatomically the hypothalamic nuclei and EW. To contribute to this area we proposed mapping the hypothalamic afferents of the EW. We have used the Fluoro-Gold injected in the EW as a result of we have found retrogradely labeled cells in the following nuclei: PVH, lateral hypothalamic area (LHA), posterior hypothalamic nucleus (PH) and other regions of the central nervous system. For control, the anterograde tracer biotinylated dextran amine was injected into the nuclei/areas hypothalamic PVH, LHA, and PH we have found anterogradely labeled fibers in a very close apposition over urocortinergic cells at EW. Based on these data we are suggesting a involvement of cells with UCN 1 EW control of autonomic and neuroendocrine functions.

O neuropeptídeo urocortina 1 (UCN 1) tem entre os seus principais locais de expressão o núcleo de Edinger-Westphal (EW) e o núcleo lateral superior da oliva. Após sua descoberta, sugeriu-se que o EW e o núcleo paraventricular do hipotálamo (PVH) possuíssem papéis complementares e opostos na resposta ao estresse, porém, não existem trabalhos que relacionam anatomicamente núcleos hipotalâmicos e o EW. A fim de contribuir para esta área foi proposto o mapeamento das aferências hipotalâmicas do EW, através da injeção de Fluoro-Gold neste núcleo e posterior mapeamento de suas aferências. Os resultados encontrados foram: PVH, área hipotalâmica lateral (LHA) e o núcleo posterior do hipotálamo (PH) e outras regiões do sistema nervoso central. Para controle, o traçador anterógrado Amina Dextrana Biotinilada, foi injetado nos núcleos/áreas hipotalâmicas PVH, LHA e PH sendo encontradas fibras próximas as células urocortinérgicas do EW. Nossos dados mostram um possível envolvimento das células UCN 1 do EW com o controle de funções autonômicas e neuroendócrinas. / The neuropeptide urocortin 1 (UCN 1) has its main sites of expression at the Edinger-Westphal nucleus (EW) and the lateral superior olivary nucleus. After its discovery has suggested that EW and paraventricular nucleus of hypothalamus (PVH) have complementary and opposing roles in the stress response. However, there are no works relating anatomically the hypothalamic nuclei and EW. To contribute to this area we proposed mapping the hypothalamic afferents of the EW. We have used the Fluoro-Gold injected in the EW as a result of we have found retrogradely labeled cells in the following nuclei: PVH, lateral hypothalamic area (LHA), posterior hypothalamic nucleus (PH) and other regions of the central nervous system. For control, the anterograde tracer biotinylated dextran amine was injected into the nuclei/areas hypothalamic PVH, LHA, and PH we have found anterogradely labeled fibers in a very close apposition over urocortinergic cells at EW. Based on these data we are suggesting a involvement of cells with UCN 1 EW control of autonomic and neuroendocrine functions.

Após a descrição da Urocortina 1, um neuropeptídeo encontrado principalmente no núcleo de Edinger-Westphal e no núcleo lateral superior da oliva (LSO), atentou-se para a ausência do conhecimento das projeções de ambos os núcleos. Nós pretendemos contribuir para o conhecimento das projeções ascendentes e descendentes do LSO, usando um traçador neuronal anterógrado. Nós utilizamos o Biotin-Dextran-Amine (BDA) injetado no LSO de ratos, 15 a 20 dias depois os ratos eram perfundidos, os encéfalos e medulas foram seccionados e tratados histoquimicamente. Nós encontramos que existem 4 vias eferentes do LSO, tanto ascendentes como descendentes no sistema nervoso central, como segue: duas vias ascendentes, uma ipsilateral à injeção, a mais proeminente e a via contralateral que é menos densa; duas vias descendentes, uma ipsilateral muito menos evidente, e a contralateral que é moderada. Seguindo a via ascendente ipsilateral, nós encontramos as seguintes estruturas bem marcadas com BDA: o próprio LSO, núcleo do corpo trapezóide, o lemnisco lateral e seus núcleos, colículos inferior e superior e os seguintes núcleos talâmicos: suprageniculado, geniculado medial, partes dorsal e medial e córtex somatosensorial primário. Seguindo a via descendente contralateral nós encontramos as seguintes estruturas: o LSO ipsi e contralateral, o núcleo do corpo trapezóide, núcleo coclear ventral, parte anterior, núcleo coclear dorsal, núcleo coclear ventral, parte posterior e VIII nervo. Os dados que nós encontramos neste trabalho sugerem que as vis do LSO podem se estender até o córtex somatosensorial no prosencéfalo e o complexo de núcleos cocleares no tronco, enviando colaterais para os principais núcleos relacionados a via auditiva, provavelmente contribuindo para a localização da fonte sonora, em acordo com a anatomia desta informação sensorial específica. / After the discovery of the Urocortin-1, a neuropeptide found mainly in the Edinger-Westphal nucleus and in the lateral superior olive nucleus (LSO), the attention was caught about the lack of known projections of both nuclei. We intended to contribute to the knowledge of both ascending and descending projections of the LSO, using a neuronal anterograde tracer. In order to do that we use the Biotin-Dextran-Amine (BDA) injected in the LSO of rats, fifteen to twenty days later the rats were perfused, the brains and spinal cords were cut and the sections treated histochemically. We have found that there are four pathways leaving the LSO either ascending or descending in the central nervous system, as following: two ascending pathways, one ipsilateral to the injection, the most proeminent one and the contralateral pathway that is less dense; two descending pathways, one ipsilateral, much less evident, and the contralateral that is very moderate. Tracking the ipsilateral ascending pathway we have found the following structures well labeled with BDA: the LSO itself, nucleus of the trapezoid body, the lateral lemniscus and its nuclei, inferior and superior colliculus, the following thalamic nuclei: suprageniculate, medial geniculate, dorsal and medial parts and the primary somatosensory cortex. Tracking the contralateral descending pathway we have found the following structures: the LSO ipsi and contralateral; the nucleus of the trapezoid body; ventral cochlear nucleus, anterior part; dorsal cochlear nucleus; ventral cochlear nucleus, posterior part and, the eight nerve. The data we have found in this work suggests that the pathways from the LSO could reach as far as the somatosensory cortex in the prosencephalon and the cochlear complex nuclei in the brainstem, sending collaterals to the main nuclei related to the auditory pathway, probably contributing to the localization of the sound source, due to the anatomy of this specific sensory information.