Thesis with manuscript / La communication intercellulaire joue un rôle important dans tous les organismes, car elle permet l'échange de molécules bioactives entre les cellules. La plupart des cellules peuvent sécréter des vésicules extracellulaires (VE) délimitées par une membrane, qui peuvent servir de médiateur pour le transfert sélectif de matériel génétique, en particulier de molécules d'ARN, vers des cellules réceptrices et modifier leur phénotype. Pour faciliter le ciblage de l'ARN vers les VE, les protéines de liaison de l'ARN (RBP) interagissent avec les ARN, formant des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) et guidant leur localisation vers les sites de production des VE. Alors que la facilitation du transport de l'ARN par les RBP est bien étudiée dans les cellules, leur mécanisme dans les VE reste mal compris. Pour mieux comprendre le chargement sélectif des ARN dans les VE, nous avons effectué un profilage RBP complet du sécrétome libéré par les cellules épithéliales mammaires humaines (HMLE), en comparaison avec le matériel des cellules entières. Nous avons d'abord utilisé la réticulation UV pour lier de manière covalente les RBP et leurs ARN associés, puis nous avons isolé le sécrétome par ultracentrifugation et purifié les RBP par extraction d'ARN lié à des protéines (XRNAX) et par spectrométrie de masse (MS). Grâce à une analyse comparative des RBP dans les environnements cellulaire et extracellulaire, nous avons identifié des collections de protéines associées à l'ARN qui étaient communes aux deux compartiments (n=189), ou qui présentaient une association plus spécifique avec l'ARN dans les échantillons cellulaires (n= 866) ou EV (n=502). Nous avons constaté que les RBP du compartiment extracellulaire (ExRBP) avaient des signatures fonctionnelles distinctes (par exemple, le métabolisme cellulaire, la structure et la modification des cellules, le repliement des protéines) par rapport aux facteurs enrichis en cellules (par exemple, le processus métabolique de l'ARN non codant). Notamment, des RBP EV bien connus, tels que ALIX, ANXA1, hnRNPR, hnRNPQ (SYNCRIP), YBX1, ainsi que des marqueurs EV de tétraspanine (CD9, CD81, TSG101), étaient enrichis dans l'ExRBP, ce qui indique le succès de XRNAX dans la purification des RBP EV. En comparant notre collection d'ExRBP aux signatures MS des VE plus pures dérivées des cellules HMLE, nous avons également pu délimiter les ExRBP qui vi sont susceptibles d'être enrichies en VE (PureEVRBP) par rapport à celles trouvées dans le sécrétome non VE (SecRBP). Il est frappant de constater que le PureEVRBP étaient enrichies en protéines de jonction cellulaire, tandis que le secRBP étaient enrichies en facteurs spliceosomaux, ce qui implique un chargement sélectif des RBP dans les VE ou leur sécrétion dans l'espace extracellulaire. Cette recherche fournit des informations précieuses sur la composition des RBP dans les EV, servant d'ensembles de données protéomiques clés pour élucider davantage les mécanismes modulant le recrutement sélectif des ARN dans les EV et améliorant notre connaissance des rôles des RBP dans la biologie des VE. / Intercellular communication plays an important role in all organisms, as it enables the exchange of bioactive molecules between cells. Most cells can secrete membrane-delimited extracellular vesicles (EVs), which can mediate the selective transfer of genetic material, in particular RNA molecules, to recipient cells and modify their phenotypes. To facilitate the targeting of RNA to EVs, RNA binding proteins (RBPs) are thought to interact with RNAs, forming ribonucleoprotein complexes (RNPs) and guiding their localization to sites of EV production. While the facilitation of RNA transportation by RBPs is well-studied in cells, their mechanism in EVs remain poorly understood. To gain insights into the selective loading of RNAs into EVs, we conducted comprehensive RBP profiling on the secretome released by Human Mammary Epithelial (HMLE) cells, in comparison to whole cell material. We first employed UV cross-linking to covalently link RBPs and their associated RNAs, followed by secretome isolation through ultracentrifugation and purification of RBPs using Protein-Xlinked RNA Extraction (XRNAX) and mass spectrometry (MS). Through a comparative analysis of RBPs in cellular and extracellular environment, we identified collections of RNA-associated proteins that were common to both compartments (n=189), or which exhibited more specific RNA association in cellular (n= 866) or EV (n=502) specimens. We found that extracellular compartment RBPs (ExRBPs) had distinctive functional signatures (e.g. cellular metabolism, cell structure and modification, protein folding) compared to cellular-enriched factors (e.g. non-coding RNA metabolic process). Notably, well-known EV RBPs, such as ALIX, ANXA1, hnRNPR, hnRNPQ (SYNCRIP), YBX1, as well as tetraspanin EV markers (CD9, CD81, TSG101), were enriched in ExRBP, indicating the success of XRNAX in EV RBP purification. By comparing our ExRBP collection to the MS signatures of more pure HMLE cell derived EVs, we were also able to delineate ExRBPs that are likely to be EV-enriched enriched versus those found in the non-EV secretome. Strikingly, pure EV-RBPs were enriched for cell-junction proteins, while general secretome RBPs were enriched for spliceosomal factors, implying selective loading of RBPs into EVs or their secretion into the extracellular space. This research provides valuable insights into the composition of RBPs in EVs, serving as key proteomic datasets to further elucidate iv the mechanisms modulating the selective recruitment of RNAs into EVs and enhancing our knowledge of the roles of RBPs in EV biology.