Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2015-01-21T20:50:54Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_EstudoMorfologicoImunologico.pdf: 6412438 bytes, checksum: 5197a96b4bdc735c52be042964a21efb (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2015-01-22T13:57:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_EstudoMorfologicoImunologico.pdf: 6412438 bytes, checksum: 5197a96b4bdc735c52be042964a21efb (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-22T13:57:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_EstudoMorfologicoImunologico.pdf: 6412438 bytes, checksum: 5197a96b4bdc735c52be042964a21efb (MD5) Previous issue date: 2013 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Muitos estudos têm sido realizados para o entendimento da neuropatogênese das encefalites virais a partir de trabalhos experimentais, porém, nenhum estudo experimental foi dedicado à compreensão da neuropatogênese de membros da família Picornaviridae isolados de morcegos na região amazônica. O vírus Juruaçá, um desses agentes, parcialmente caracterizado como membro da família Picornaviridae por Araújo e colaboradores (2006), causou lesões no encéfalo de camundongos neonatos com presença de gliose reativa, apesar de não provocar efeito citopático (ECP) em cultivos primários de células do sistema nervoso central (SNC), sugerindo que este agente viral seja responsável pela morte dos animais devido a uma intensa resposta imune. O objetivo desse trabalho foi investigar a resposta imune no SNC e alterações celulares causadas pelo vírus Juruaçá em camundongos albinos da linhagem BALB/c neonatos a partir de análises histopatológicas, de ativação microglial e da expressão de citocinas, óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS). Para tanto, foram realizados processamento de amostras para histopatologia, ensaios imunoenzimáticos, imunohistoquímicos e de imunofluorescência, além de testes para quantificação de NO e ROS e análises estatísticas. Nossos resultados demonstraram que o vírus Juruaçá induz lesões por todo o encéfalo, com maior intensidade no parênquima cortical. Os testes imunohistoquímicos demonstraram a presença de antígenos virais e de micróglias reativas distribuídos por todo o encéfalo e região anterior da medula espinhal. Micróglias com aspecto ameboide, demonstrando intensa ativação, foram observadas principalmente no córtex cerebral, bulbo olfatório, núcleo olfatório anterior, prosencéfalo e diencéfalo próximo ao ventrículo lateral. A produção das citocinas anti-inflamatórias (IL-10, IL-4) diminuiu ao longo do tempo, enquanto que as pró-inflamatórias (IL-12, IL-6, IL-1β, TNF-α, IFN-γ) aumentaram significativamente a partir do 8º dia. Os ensaios para detecção de ROS demonstraram grande produção de radicais superóxido desde o 4º dia, já a produção de NO foi sempre menor nos animais infectados. Provavelmente, a ativação das células gliais, principalmente micróglias, e consequente produção de citocinas pró-inflamatórias e ROS promoveram uma ação devastadora sobre as células do SNC, que coincide com a intensificação dos sinais clínicos. Diante do exposto, ficou evidente que os nossos resultados indicam que o vírus Juruaçá é responsável por uma doença de cunho inflamatório que leva a óbito 100% de camundongos neonatos infectados. / Many studies have been conducted to understand the neuropathogenesis of viral encephalitis from experimental work, however, no experimental studies have been devoted to understanding the neuropathogenesis of members of the Picornaviridae family isolated from bats in the Amazon region. The Juruaçá virus, one of these agents, partially characterized as a member of the Picornaviridae family by Araujo et al. (2006), caused lesions in the brain of neonatal mice with reactive gliosis presence, although not cause cytopathic effect (CPE) in primary cultures of central nervous system (CNS) cells, suggesting that this viral agent is responsible for the death of animals due to an intense immune response. The aim of this study was to investigate the immune response in the CNS and cellular changes caused by Juruaçá virus in newborn albino mice of strain BALB/c from histopathological analysis, microglial activation, and expression of cytokines, nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS). Thus, we performed sample processing for histopathology, immunosorbent assay, immunohistochemical and immunofluorescence assays, tests to quantify NO and superoxide radicals, and statistical analysis. Our results demonstrated that the Juruaçá virus induces lesions throughout the brain, with greater intensity in the cortical parenchyma. Immunohistochemical tests showed the presence of viral antigens and reactive microglias distributed throughout the brain and anterior spinal cord. Microglias with amoeboid shape, demonstrating intense activation, were observed in the cerebral cortex, olfactory bulb, anterior olfactory nucleus, midbrain and forebrain near the lateral ventricle. The production of anti-inflammatory cytokines (IL-10 and IL-4) decreased over time, whereas pro-inflammatory cytokines (IL -12, IL- 6, IL- 1β, TNF-α and IFN-γ) increased significantly from the 8th day. Assays for ROS detection showed great superoxide radicals production from the 4th day, as NO production was always lower in the infected animals. Probably, activation of glial cells, especially microglias, and subsequent production of proinflammatory cytokines and ROS promoted a devastating action on the cells of the CNS, which coincides with the intensification of clinical signs. In accordance with what has been explained above, became evident that our results indicate that the Juruaçá virus is responsible for a imprint inflammatory disease that leads to death 100% of infected neonates mice.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-04-16T20:01:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoMorfologicaAntigenica.pdf: 3870476 bytes, checksum: 0787dfb29b9498030bcf6be48618a460 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-04-18T12:53:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoMorfologicaAntigenica.pdf: 3870476 bytes, checksum: 0787dfb29b9498030bcf6be48618a460 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-18T12:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoMorfologicaAntigenica.pdf: 3870476 bytes, checksum: 0787dfb29b9498030bcf6be48618a460 (MD5) Previous issue date: 2006 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O vírus Juruaçá (AN 401933) foi isolado a partir de um lote de vísceras de um morcego capturado na região de Porto Trombetas, município de Oriximiná, Estado do Pará, em 1982, sendo considerado um vírus não grupado/ não classificado. O objetivo deste trabalho foi classificar o vírus Juruaçá em um táxon viral, baseando-se nas suas propriedades morfológicas, físico-químicas, antigênicas e moleculares, bem como descrever as alterações anatomo-patológicas associadas à infecção experimental. Camundongos recém-nascidos mostraram suscetibilidade à infecção pelo vírus Juruaçá por inoculação i.c., iniciando os sintomas com quatro dias p.i. e culminando com morte dos animais oito dias p.i.. O vírus não é sensível à ação do DCA e consegue aglutinar hemácias de ganso em pH 5,75. Pelos testes de IH e FC, o vírus não se relaciona com nenhum arbovírus ou outros vírus de vertebrados conhecidos testados, reagindo apenas com o seu soro homólogo. O vírus não causa ECP em linhagens de células Vero e C6/36, e IFI destas células também foi negativa. Entretanto, o vírus Juruaçá replica em cultivo primário de células do SNC de camundongo (astrócitos e microglias), confirmada por IFI com dupla marcação. Cultivos de neurônios não se mostraram susceptíveis à infecção pelo vírus Juruaçá, porém a presença do antígeno viral nestas células foi confirmada por imunohistoquímica. A microscopia eletrônica de transmissão revelou a presença de partículas esféricas, com um diâmetro médio de 23-30nm. Alterações anatomo-patológicas foram observadas principalmente no SNC de camundongos infectados experimentalmente com o vírus Juruaçá. O resultado do RT-PCR sugere que o vírus Juruaçá pode ser um novo vírus pertencente à família Picornaviridae, gênero Enterovirus. / Juruaçá virus (BE AN 401933) was isolated from pooled organs of an unidentified bat captured during field work in Porto Trombetas, Oriximiná, Pará State, in 1982, and remains unclassified/ungrouped. The aims of this work were to classify Juruaçá virus in a viral taxon taking in account its morphological, physicochemical, antigenic and molecular properties, as well as, to describe the pathological alterations. This agent is pathogenic only for infant mice, and the animal’s death occurs with eight days post-inoculation. It’s not related to any of the arthropod borne viruses with which it has been tested by serological tests, such as complement fixation (CF) and hemagglutination inhibition (HI). Positive reactions were only observed with its homologous serum. Juruaçá virus is not sensitive to sodium desoxicolate and can hemagglutinate goose cells at pH 5.75. The virus didn’t show any cytophatic effect and immunofluorescence was negative in Vero and C6/36 cell lines, but it replicates in brain tissue primary culture cell line (astrocytes and microglias), confirmed by immunofluorescent assay (IFA). Culture of neuronal cells appears not to be infected by Juruaçá virus; however, infection of these cells was confirmed by imunohistochemistry. By transmission electron microscopy and negative stain, the virus is a spherical particle, with mean diameter of 23-30nm. Pathological alterations were observed mainly in the central nervous system of newborn mice experimentally infected with Juruaçá virus. The molecular results of RT-PCR suggest that Juruaçá virus is a possible new virus belonging to the family Picornaviridae, genus Enterovirus.