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Os vasos sanguíneos são formados, entre outros componentes, por células endoteliais as quais fazem parte da microvasculatura óssea e são capazes de regular o desenvolvimento ósseo tendo em vista de que os processos de osteogênese e angiogênese estão interligados. Os leucotrienos (LTs) são mediadores lipídicos envolvidos no recrutamento de leucócitos e na regulação da síntese de citocinas. O tratamento com o leucotrieno B4 (LTB4) induz a angiogênese pela superexpressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Assim, o objetivo do trabalho foi investigar o efeito das células endoteliais reguladas pelo LTB4 na diferenciação osteogênica. Para isso, células endoteliais primárias de aorta foram isoladas e cultivadas por até 4 dias e, quando apropriado, foi realizado o tratamento das mesmas com o LTB4. O meio condicionado das células endoteliais foi armazenado para os experimentos com osteoblastos. Células osteoblásticas foram isoladas da calvária e cultivadas por até 21 dias, avaliando-se, portanto, os efeitos das células endoteliais reguladas ou não pelo LTB4 e a resposta dos estímulos exógenos LTB4, o inibidor da síntese de LTs MK 886 e o antagonista do receptor do LTB4, o U75302. Tais respostas foram observadas na fase de crescimento celular, por meio da viabilidade, proliferação e produção de marcadores osteogênicos e angiogênicos como o RANKL, OPG e o VEGF por meio da redução do MTT, citometria de fluxo e western blotting, respectivamente. A diferenciação foi avaliada por meio dos ensaios de fosfatase alcalina (ALP) e expressão gênica por meio de ensaio enzimático e qRT-PCR e mineralização por Vermelho de alizarina. Resultados mostraram que tanto as células endoteliais, mediadas ou não pelo LTB4, quanto os estímulos exógenos não foram capazes de modular a proliferação dos osteoblastos. Porém, durante a diferenciação, o LTB4 inibiu a atividade da ALP, a expressão gênica do BLT1, ALP, BGLAP (osteocalcina) e OPG (osteoprotegerina) foi aumentada, e os genes RANKL e VEGF tiveram a sua expressão diminuída pelo tratamento com o meio condicionado das células endoteliais, mediadas ou não pelo LTB4 (P<0,05). Além disso, a mineralização dos osteoblastos foi aumentada pelas células endoteliais e diminuída pelas células endoteliais mediadas pelo LTB4 (P<0,05). Assim, podemos concluir que os fatores angiogênicos das células endoteliais, mediadas ou não pelo LTB4, exercem um papel importante na regulação da diferenciação osteogênica e formação óssea contribuindo, portanto, para a compreensão de mecanismos que regulam a patofisiologia de doenças ósseas. / Endothelial cells make blood vessels and are involved in the regulation of tissue metabolism. Endothelial cells from bone microvasculature are capable of regulating bone development in view of the fact that the processes of osteogenesis and angiogenesis are interconnected. Leukotrienes (LTs) are lipid mediators involved in leukocyte recruitment and regulation of cytokine synthesis. It is known that the treatment with LTB4 induces angiogenesis by overexpression of vascular endothelial growth factor (VEGF). Thus, the aim of this study was to investigate the effect of LTB4-regulated endothelial cells on osteogenic differentiation. For this, primary endothelial cells from aorta were isolated and cultured for up to 4 days and, where appropriate, the treatment with LTB4 was done. The conditioned medium of these cells was stored for osteoblast experiments. Osteoblastic cells were isolated from calvaria and cultured for up to 21 days, assessing the effects of endothelial cells regulated or not by LTB4 and the response of exogenous LTB4 stimuli, the inhibitor of LTs synthesis MK 886 and the antagonist of LTB4 receptor, U75302. Such responses were observed in the cell growth phase through the viability, proliferation and production of osteogenic and angiogenic markers such as RANKL, OPG and VEGF by MTT assay, flow cytometry and western blotting, respectively. The cell differentiation was evaluated by alkaline phosphatase (ALP), gene expression and mineralization assay through ALP enzymatic assay, qRT-PCR and Alizarin Red staining. Results showed that both endothelial cells, mediated or not by LTB4 and exogenous stimuli were not able to modulate the osteoblasts proliferation. However, during the differentiation, LTB4 inhibited ALP activity, the gene expression of BLT1, ALP, BGLAP (osteocalcin) and OPG (osteoprotegerin) was increased, and the RANKL and VEGF genes had their expression decreased by the treatment with the endothelial cells conditioned medium, mediated or not by LTB4 (P <0.05). In addition, the osteoblasts mineralization was increased by endothelial cells conditioned medium (CM-EC) and decreased by LTB4-mediated endothelial cells conditioned medium (CM-EC-LTB4) (P <0.05). Thus, we can conclude that the angiogenic factors of the endothelial cells, mediated or not by LTB4, play an important role in the regulation of osteogenic differentiation and bone formation, thus contributing to the understanding of mechanisms that regulate the pathophysiology of bone diseases.

O timo é um órgão essencial para a maturação, diferenciação e seleção de linfócitos T, consequentemente fundamental para o desenvolvimento da imunidade do organismo. Além do papel na manutenção da integridade tecidual, os vasos sanguíneos tímicos desempenham função no processo de migração de células precursoras de linfócitos para o interior do órgão. Sua arquitetura típica é caracterizada por grandes vasos localizados na junção corticomedular e uma fina cadeia de ramificações e anastomoses no interior do córtex, porém são pouco conhecidas as bases moleculares que induzem a formação desta particular vascularização, bem como os exatos mecanismos que desencadeiam a involução do órgão, evento relacionado a alterações nos padrões vasculares. Entretanto, tem sido demonstrado que as interações entre o estroma, que inclui o endotélio vascular, e o compartimento hematopoiético tímico desempenham papéis cruciais na funcionalidade do órgão. Sendo o VEGF um fator angiogênico essencial na formação do leito vascular tecidual e na modulação de funções diretamente relacionadas à vascularização, objetivamos neste estudo avaliar a expressão gênica e protéica deste fator de crescimento durante estágios de desenvolvimento e involução do órgão. Foram utilizadas amostras de timo suíno em 3 diferentes estágios de desenvolvimento fetal (65, 85 e 111 dias) e 2 estágios de vida pós-natal, um compreendendo fase de maturação (5 meses) e outro de involução do órgão (2 anos), compreendendo um total de 25 animais, divididos em 5 grupos (n = 5). A análise da expressão relativa do mRNA do sistema VEGF-A, acessada por meio de PCR em tempo real, apresentou modificações tempo-dependentes significativas (P<0,05) em relação ao controle endógeno GAPDH. Também foram observadas diferenças significativas (P0,05) na quantificação vascular por meio de estereologia entre as idades. A imunolocalização da proteína do VEGF e de seus receptores Flt-1 e KDR foi identificada no timo de todos os grupos experimentais e variou entre os grupos pré e pós-natais, com expressão mais rara nestes últimos, o que sugere diferenças temporais na modulação do mRNA no órgão. Assim como as células endoteliais, as células epiteliais tímicas demonstraram modulação pelo sistema VEGF-A, indicando ação parácrina e/ou autócrina deste fator de crescimento no timo. Os valores das variáveis estereológicas Sv[m] e Vv[m] do timo fetal em período próximo ao nascimento mantiveram-se maiores do que no córtex e se correlacionaram positivamente com a expressão do mRNA do KDR e negativamente com a do Flt-1 até a idade adulta. Ao contrário da expressão protéica, a expressão gênica do sistema VEGF-A pode se correlacionar negativamente com aspectos quantitativos da vascularização do timo pós-natal, como observado para o mRNA do VEGF e seu receptor Flt-1 a partir dos 5 meses de idade, quando os valores das variáveis Vv[vasos,timo], Sv[vasos,timo] e Lv[vasos,timo] diminuíram significativamente (P0,05), o que sugere uma resposta de compensação ou manutenção de uma condição hipóxica instalada no órgão. / Crucial for maturation, differentiation and selection of T lymphocytes, the thymus is an essential organ to the development of immunity. In addition to its role in the maintenance of tissue integrity, thymus blood vessels play a role in migration of T-cell precursors into the organ, and show a typical architecture characterized by the presence of large blood vessels at the corticomedullary junction and fine network of branching vessels and anastomosing arcades extending into the cortex. The molecular basis of this typical vasculature and the exact mechanisms that trigger thymus involution are both not well understood. However, it has been shown that the interactions between thymus stroma, including vascular endothelium and the hematopoietic compartment play crucial roles for normal organ function. Thus, because VEGF is an essential angiogenic factor for induction of the vascular bed and modulation of functions directly related with vascularization, the aim of this study was to assess the temporal protein and mRNA expression of VEGF and its receptors Flt-1 and KDR in the thymus during early stages of its development and involution. Samples of thymus from 3 different stages of fetal development (65, 85, and 111 days) and 2 stages of postnatal life of pigs, including one stage of maturation (5 months) and another of involution (2 years) comprising a total of 25 animals that were divided into 5 groups (n = 5). Relative mRNA expression of VEGF-A system, accessed by real-time PCR, showed temporal significant changes (P<0.05) compared to endogenous control GAPDH. Quantification of blood vessels by means of stereology also showed significant differences (P0.05) between ages. Positive immunostaining for VEGF and its receptors Flt-1 and KDR was identified in the thymus of all groups and it varied between the pre and postnatal groups with rare expression in the latter, suggesting temporal differences in the modulation of mRNA. Endothelial and epithelial cells showed modulation by the VEGF-A system, suggesting paracrine or alternatively autocrine activity of this growth factor. The values of the stereological parameters Sv[m] and Vv[m] of the thymus in fetal period around the birth remained higher than in the cortex and upregulated with mRNA expression of KDR and downregulated with mRNA expression of Flt-1 until adulthood. Unlike protein expression, gene expression gene expression of VEGF-A system can be downregulated with quantitative aspects of the postnatal thymus vascularization as observed for the mRNA of VEGF and its receptor Flt-1 from the age of 5 months, when the values of the stereological parameters Vv[vessels,thymus], Sv[vessels,thymus] and Lv[vessels,thymus] decreased significantly (P0.05), which suggests a compensatory or maintenance response to an hypoxic condition in the organ.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença da proteínas - fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores R1 (Flt-1) e R2 (Flk-1) em placentas a termo de gestantes com hipergliccemia leve, comparando estes resultados com o observado em placentas de gestantes normoglicêmicas e diabéticas gestacional e clínica, através de reações de imunohistoquímica e Western Blotting. Resultados: em geral, placentas de gestantes normoglicêmicas apresentam reatividade bastante expressiva aos anticorpos contra VEGF, VEGF-R1 e -R2 nas células vasculares e trofoblásticas. Reações destacadamente intensas foram observadas no endotélio capilar, células mesenquimais, sinciciotrofoblasto e células citotrofoblásticas extravilosas para VEGF e VEGF-R2. Estes resultados sugerem que o balance VEGF/VEGFR está alterado nas placentas de gestantes com hiperglicemia leve, o que pode ser um aspecto crucial para explicar a hipercapilarização induzida nos vilos terminais neste distúrbio glicêmicos. / O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença da proteínas - fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores R1 (Flt-1) e R2 (Flk-1) em placentas a termo de gestantes com hipergliccemia leve, comparando estes resultados com o observado em placentas de gestantes normoglicêmicas e diabéticas gestacional e clínica, através de reações de imunohistoquímica e Western Blotting. Resultados: em geral, placentas de gestantes normoglicêmicas apresentam reatividade bastante expressiva aos anticorpos contra VEGF, VEGF-R1 e -R2 nas células vasculares e trofoblásticas. Reações destacadamente intensas foram observadas no endotélio capilar, células mesenquimais, sinciciotrofoblasto e células citotrofoblásticas extravilosas para VEGF e VEGF-R2. Estes resultados sugerem que o balance VEGF/VEGFR está alterado nas placentas de gestantes com hiperglicemia leve, o que pode ser um aspecto crucial para explicar a hipercapilarização induzida nos vilos terminais neste distúrbio glicêmicos.

A expressão do fator de crescimento endotelial vascular tipo C (VEGF-C) e de podoplanina pelas células malignas tem sido associada com a maior ocorrência de metástases regionais e/ou pior prognóstico para os pacientes com câncer de boca. O objetivo deste estudo foi avaliar o significado clinico da expressão de VEGF-C e podoplanina em 42 carcinomas espinocelulares (CEC) bem diferenciado de boca, com e sem comprometimento linfonodal, incluindo oito carcinomas verrucosos, tratados no Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, do Hospital do Câncer A. C. Camargo, São Paulo, no período de 1980 a 2000. Os pacientes foram analisados quanto ao gênero, idade, cor, tabagismo, etilismo, localização do tumor primário, classificação pelo sistema TNM, tratamento, ocorrência de recidivas local e regional, metástase à distância, de segundo tumor primário, além da presença de infiltrações perineural, muscular, glandular e óssea e de embolizações vasculares. Analisou-se também o índice histopatológico de malignidade tumoral e as expressões imuno-histoquímica de VEGFC e de podoplanina pelas células malignas no front de invasão tumoral. A associação das expressões de VEGF-C e podoplanina com as variáveis estudadas foi calculada pelo teste quiquadrado. As probabilidades de sobrevida, acumuladas nos períodos de 5 e 10 anos calculadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de long-rank. A maioria dos CEC de boca, incluindo os carcinomas verrucosos, exibiu uma forte expressão de VEGF-C pelas células malignas. Houve uma tendência, sem associação estatisticamente significativa, dos pacientes com CEC de boca e forte expressão de VEGF-C apresentarem maior freqüência de recidivas locais e/ou regionais. A forte expressão de podoplanina foi significativamente associada com o gênero masculino (p=0,037), com o estadiamento T1 e T2 (p=0,037), com o estadio clínico I e II (p=0,027) e com a presença de infiltração glandular (p=0,003). As recidivas locais e regionais foram detectadas mais freqüentemente nos CEC de boca com forte expressão de podoplanina, porém sem diferença estatisticamente significativa, quando comparados com aqueles com expressão fraca da proteína. As taxas de sobrevida global e específica por câncer para os pacientes com tumores com forte expressão de VEGF-C e a taxa de sobrevida global para a forte expressão de podoplanina foram percentualmente menores do que aquelas dos pacientes com tumores com fraca expressão destas proteínas. O comprometimento linfonodal cervical se mostrou fator de prognóstico significativo (p=0,001) para os pacientes com câncer de boca. Estes resultados sugerem que a forte expressão de VEGF-C e podoplanina pelas células malignas juntamente com o comprometimento linfonodal regional são fatores indicativos de uma evolução clínica desfavorável e de um pior prognóstico para os pacientes com CEC bem diferenciados de boca. / The expression of vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) and podoplanin by malignant cells has been associated with a greater incidence of regional metastasis and/or poor prognosis for patients with oral cancer. The purpose of this study was to evaluate the clinical significance of VEGF-C and podoplanin expression in 42 well-differentiated oral squamous cell carcinomas (OSCC), with and without lymph node involvement, including eight verrucous carcinoma, treated at the Department of the Head and Neck Surgery and Otorhinolaryngology, A. C. Camargo Cancer Hospital, São Paulo, from 1980 to 2000. Patients were evaluated according the following parameters: gender, age, ethnic group, tobacco and/or alcohol consumption, tumor location, TNM stage, treatment and clinical follow-up (recurrence, occurrence of a second primary tumor and death) and the presence of perineural, muscular, glandular and bone infiltrations or vascular embolizations. In addition, we investigated the histopathological malignancy index and the immunohistochemistry expression of VEGF-C and podoplanin by malignant cells in the invasive front tumor. Chisquare test or Fishers exact test was used to analyze the association of VEGF-C and podoplanin with demographic, clinical and microscopic variables in OSCC patients. The 5 and 10-year survival rates were calculated by Kaplan-Meier method and the comparison of the survival curves were performed using log rank test. Most of OSCC, including verrucous carcinoma, showed a high expression of VEGF-C by malignant cells. The OSCC patients with high expression of VEGF-C showed a tendency, without statistical significance, of local and/or regional recurrence. The overexpression of podoplanin was significantly associated with the male gender (p=0,037), with T1 and T2 stage (p=0,037), with I and II clinical stage (p=0,027) and with the presence of glandular infiltration (p=0,003). The local and regional recurrences were detected more frequently in OSCC with high expression of podoplanin, without statistical significant difference, when compared with those with low expression of the protein. The overall survival rates and cancer specific survival rates for OSCC patients with high VEGF-C expression and the overall survival rate for OSCC patients with podoplanin overexpression were lower than those of OSCC patients with low expression of these proteins. The cervical lymph node involvement was significant prognostic factor (p=0,001) for patients with oral cancer. These results suggest that the overexpression of VEGF-C and podoplanin by malignant cells and regional lymph node involvement are indicative factors of an unfavorable clinical outcome and a poor prognosis for patients with well-differentiated OSCC.

A expressão do fator de crescimento endotelial vascular tipo C (VEGF-C) e de podoplanina pelas células malignas tem sido associada com a maior ocorrência de metástases regionais e/ou pior prognóstico para os pacientes com câncer de boca. O objetivo deste estudo foi avaliar o significado clinico da expressão de VEGF-C e podoplanina em 42 carcinomas espinocelulares (CEC) bem diferenciado de boca, com e sem comprometimento linfonodal, incluindo oito carcinomas verrucosos, tratados no Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, do Hospital do Câncer A. C. Camargo, São Paulo, no período de 1980 a 2000. Os pacientes foram analisados quanto ao gênero, idade, cor, tabagismo, etilismo, localização do tumor primário, classificação pelo sistema TNM, tratamento, ocorrência de recidivas local e regional, metástase à distância, de segundo tumor primário, além da presença de infiltrações perineural, muscular, glandular e óssea e de embolizações vasculares. Analisou-se também o índice histopatológico de malignidade tumoral e as expressões imuno-histoquímica de VEGFC e de podoplanina pelas células malignas no front de invasão tumoral. A associação das expressões de VEGF-C e podoplanina com as variáveis estudadas foi calculada pelo teste quiquadrado. As probabilidades de sobrevida, acumuladas nos períodos de 5 e 10 anos calculadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de long-rank. A maioria dos CEC de boca, incluindo os carcinomas verrucosos, exibiu uma forte expressão de VEGF-C pelas células malignas. Houve uma tendência, sem associação estatisticamente significativa, dos pacientes com CEC de boca e forte expressão de VEGF-C apresentarem maior freqüência de recidivas locais e/ou regionais. A forte expressão de podoplanina foi significativamente associada com o gênero masculino (p=0,037), com o estadiamento T1 e T2 (p=0,037), com o estadio clínico I e II (p=0,027) e com a presença de infiltração glandular (p=0,003). As recidivas locais e regionais foram detectadas mais freqüentemente nos CEC de boca com forte expressão de podoplanina, porém sem diferença estatisticamente significativa, quando comparados com aqueles com expressão fraca da proteína. As taxas de sobrevida global e específica por câncer para os pacientes com tumores com forte expressão de VEGF-C e a taxa de sobrevida global para a forte expressão de podoplanina foram percentualmente menores do que aquelas dos pacientes com tumores com fraca expressão destas proteínas. O comprometimento linfonodal cervical se mostrou fator de prognóstico significativo (p=0,001) para os pacientes com câncer de boca. Estes resultados sugerem que a forte expressão de VEGF-C e podoplanina pelas células malignas juntamente com o comprometimento linfonodal regional são fatores indicativos de uma evolução clínica desfavorável e de um pior prognóstico para os pacientes com CEC bem diferenciados de boca. / The expression of vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) and podoplanin by malignant cells has been associated with a greater incidence of regional metastasis and/or poor prognosis for patients with oral cancer. The purpose of this study was to evaluate the clinical significance of VEGF-C and podoplanin expression in 42 well-differentiated oral squamous cell carcinomas (OSCC), with and without lymph node involvement, including eight verrucous carcinoma, treated at the Department of the Head and Neck Surgery and Otorhinolaryngology, A. C. Camargo Cancer Hospital, São Paulo, from 1980 to 2000. Patients were evaluated according the following parameters: gender, age, ethnic group, tobacco and/or alcohol consumption, tumor location, TNM stage, treatment and clinical follow-up (recurrence, occurrence of a second primary tumor and death) and the presence of perineural, muscular, glandular and bone infiltrations or vascular embolizations. In addition, we investigated the histopathological malignancy index and the immunohistochemistry expression of VEGF-C and podoplanin by malignant cells in the invasive front tumor. Chisquare test or Fishers exact test was used to analyze the association of VEGF-C and podoplanin with demographic, clinical and microscopic variables in OSCC patients. The 5 and 10-year survival rates were calculated by Kaplan-Meier method and the comparison of the survival curves were performed using log rank test. Most of OSCC, including verrucous carcinoma, showed a high expression of VEGF-C by malignant cells. The OSCC patients with high expression of VEGF-C showed a tendency, without statistical significance, of local and/or regional recurrence. The overexpression of podoplanin was significantly associated with the male gender (p=0,037), with T1 and T2 stage (p=0,037), with I and II clinical stage (p=0,027) and with the presence of glandular infiltration (p=0,003). The local and regional recurrences were detected more frequently in OSCC with high expression of podoplanin, without statistical significant difference, when compared with those with low expression of the protein. The overall survival rates and cancer specific survival rates for OSCC patients with high VEGF-C expression and the overall survival rate for OSCC patients with podoplanin overexpression were lower than those of OSCC patients with low expression of these proteins. The cervical lymph node involvement was significant prognostic factor (p=0,001) for patients with oral cancer. These results suggest that the overexpression of VEGF-C and podoplanin by malignant cells and regional lymph node involvement are indicative factors of an unfavorable clinical outcome and a poor prognosis for patients with well-differentiated OSCC.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-19T13:51:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese_RayanaLuna_2016 (1).pdf: 8156604 bytes, checksum: 38605ef2e80adea3732612e363d4a7d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-19T13:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese_RayanaLuna_2016 (1).pdf: 8156604 bytes, checksum: 38605ef2e80adea3732612e363d4a7d2 (MD5) Previous issue date: 2016-06-15 / FACEPE / O desenvolvimento de uma gestação saudável depende de uma adequada circulação uteroplacentária. Abortos recorrentes (AR), óbito fetal, partos prematuros, pré-eclâmpsia (PE) e trombofilia materna (TM) são algumas das patologias que interferem nessa rede vascular. São muitos os fatores que podem influenciar na tênue interface entre o parto de um feto saudável, um parto prematuro ou até mesmo um aborto. Uma variedade de moléculas como citocinas, proteínas de adesão e fatores de crescimento podem ter um papel importante durante o desenvolvimento fetal assim como em todo processo gestacional. Desta forma, desequilíbrio entre vias de sinalização assim como as vias inflamatórias têm sido relacionadas com o desencadeamento do processo abortivo. O fator de crescimento placentário (PGF) é um marcador importante para identificar deficiência placentária que pode ser ligada a PE. Mulheres com PE tendem a ter níveis inferiores de PGF circulantes quando comparadas a mulheres com gestações saudáveis. A inflamação aguda é comumente associada com injúria fetal assim como a inflamação crônica tem sido associada com a morte fetal e aborto. Estudos epigenéticos e epidemiológicos têm demostrado que indivíduos nascidos de mães que tiveram complicações durante a gravidez possuem maior risco de desenvolverem patologias diversas na vida adulta como acidente vascular cerebral, cardiopatias, obesidade e infertilidade. O Sildenafil, um inibidor de fosfodiesterase tipo-5 com características vasodilatadoras tem ajudado na terapia de restrição de crescimento fetal (RCF). Recentemente Sildenafil, tem sido demostrado por apresentar-se como anti-inflamatório em diversos modelos animais de patologias humanas como esclerose múltipla, hiperplasia prostática, doenças cardiovasculares, pulmonares entre outras. Por outro lado a Heparina de baixo peso molecular tem sido utilizada como tratamento para casos de AR quando o diagnóstico é associado ou não com TM, apesar deste tipo de esquema terapêutico não ser considerado eficaz em muitos casos. O presente estudo se propôs a investigar alvosterapêuticos em modelos animais de AR e PE, através da avaliação do tratamento com Sidenafil ou/com Heparina para a prevenção do processo abortivo assim como a investigação da influência da sinalização via-PGF na formação da vascularização cerebral fetal. Tratamento com Sildenafil sozinho ou tratamento conjunto com Heparina protegeu contra a mortalidade fetal, diminuiu a sinalização inflamatória na placenta assim como melhorou a saúde dos fetos de camundongo expostos a altas doses de Lipopolissacarídeos (LPS) como modelo para perda gestacional. PGF foi identificado em áreas importantes do cérebro de fetos geneticamente normais, no período de gestação média assim como também foram identificados níveis compatíveis do receptor 1 para fator de crescimento vascular endotelial (VEGF): Flt-1. A via que envolve o PGF mostrou-se essencial para o desenvolvimento vascular cerebral saudável. A proteção placentária e por consequência manutenção da saúde do feto é de suma importância para que a gestação chegue a termo e resulte no parto de um indivíduo saudável e sem riscos à saúde da mãe. Esse trabalho traz informações detalhadas de como acontece a modulação durante a vascularização cerebral durante o desenvolvimento em animais geneticamente normais assim como em camundongos PGF-/-. Adicionalmente, demostra como a terapia utilizando Sildenafil isoladamente ou em combinação com Heparina pode diminuir o perfil inflamatório e/ou trombótico do sistema fisiológico gravídico e desta forma prevenir o processo abortivo, mantendo a saúde fetal. / The development of a healthy pregnancy depends on proper uteroplacental circulation. Recurrent miscarriages (RM), fetal death, pre-term labour, preeclampsia (PE) and maternal thrombophilia (MT) are some of the pathologies that may affect with arrangements of this circulation network. There are many factors that can influence the maternal-fetal interface and aberrant gene expression at the site of this interface can result in premature birth or even miscarriage. A variety of molecules including a variety of cytokines, adhesion proteins and growth factors play an important role during fetal development as well as throughout gestation. Indeed, an imbalance of signaling and inflammatory signaling pathways have been associated with the initiation of the abortive process, regardless of the origin of this event. Placental growth factor (PGF) is an important marker to identify placental defects that can be linked to PE. Women with PE tend to have lower levels of circulating PGF when compared to women with healthy pregnancies. Acute inflammation is often associated with fetal injury and chronic inflammation has been associated with abortion and fetal death. Additionally, epigenetic and epidemiological studies have shown that individuals born to mothers who have complications during pregnancy have a higher risk of developing various diseases in adulthood such as: stroke, heart disease, obesity and infertility. Sildenafil, a phosphodiesterase type-5 inhibitor with vasodilating characteristics has proved beneficial in fetal growth restriction (FGR) pathologies. Recent studies have shown that Sildenafil plays an anti-inflammatory agent in a wide range of pathologies in animal models of human diseases such as: multiple sclerosis, prostatic hyperplasia, cardiovascular, and pulmonary diseases among others. Low molecular weight heparin (LMWH) has been used as a treatment for RM cases when diagnosis is associated or not with MT. Despite these facts, recently published meta-analyses have demonstrated that treatments using LMWH are not superior. This study proposed to investigate new therapeutic approaches in animal models of RM and PE. This was accomplished by evaluation of the effectiveness of Sildenafil and/or Heparin in the prevention of fetal mortality/abortion as well as the investigation of the influence of PGF signaling pathway in the formation of fetal brain vasculature. Treatment with sildenafil; alone or in combination with heparin protected against fetal mortality and decreased inflammatory signaling in the placenta, as well as improved the health of the mouse fetuses exposed to high doses of lipopolysaccharide (LPS). PGF was detected in important areas of the brain in genetically normal fetuses and the average period of gestation was also identified as compatible to vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor: Flt-1. The pathway involving PGF was found to be essential for healthy vascular development in the brain. Therefore, early placental protection and therefore maintaining the fetus' health is of paramount importance if the pregnancy comes to term and results in the birth of a healthy individual and without risks to health of the mother. This work provides detailed information into critical events that occur during the development of the cerebral vasculature both in genetically normal as well as in PGF -/- mice. Additionally, this work demonstrates how therapies with sildenafil alone or in combination with heparin can reduce the inflammatory status and/or thrombotic physiological systems of pregnancy and thereby prevent fetal mortality, thus maintaining fetal health.

O timo é um órgão essencial para a maturação, diferenciação e seleção de linfócitos T, consequentemente fundamental para o desenvolvimento da imunidade do organismo. Além do papel na manutenção da integridade tecidual, os vasos sanguíneos tímicos desempenham função no processo de migração de células precursoras de linfócitos para o interior do órgão. Sua arquitetura típica é caracterizada por grandes vasos localizados na junção corticomedular e uma fina cadeia de ramificações e anastomoses no interior do córtex, porém são pouco conhecidas as bases moleculares que induzem a formação desta particular vascularização, bem como os exatos mecanismos que desencadeiam a involução do órgão, evento relacionado a alterações nos padrões vasculares. Entretanto, tem sido demonstrado que as interações entre o estroma, que inclui o endotélio vascular, e o compartimento hematopoiético tímico desempenham papéis cruciais na funcionalidade do órgão. Sendo o VEGF um fator angiogênico essencial na formação do leito vascular tecidual e na modulação de funções diretamente relacionadas à vascularização, objetivamos neste estudo avaliar a expressão gênica e protéica deste fator de crescimento durante estágios de desenvolvimento e involução do órgão. Foram utilizadas amostras de timo suíno em 3 diferentes estágios de desenvolvimento fetal (65, 85 e 111 dias) e 2 estágios de vida pós-natal, um compreendendo fase de maturação (5 meses) e outro de involução do órgão (2 anos), compreendendo um total de 25 animais, divididos em 5 grupos (n = 5). A análise da expressão relativa do mRNA do sistema VEGF-A, acessada por meio de PCR em tempo real, apresentou modificações tempo-dependentes significativas (P<0,05) em relação ao controle endógeno GAPDH. Também foram observadas diferenças significativas (P0,05) na quantificação vascular por meio de estereologia entre as idades. A imunolocalização da proteína do VEGF e de seus receptores Flt-1 e KDR foi identificada no timo de todos os grupos experimentais e variou entre os grupos pré e pós-natais, com expressão mais rara nestes últimos, o que sugere diferenças temporais na modulação do mRNA no órgão. Assim como as células endoteliais, as células epiteliais tímicas demonstraram modulação pelo sistema VEGF-A, indicando ação parácrina e/ou autócrina deste fator de crescimento no timo. Os valores das variáveis estereológicas Sv[m] e Vv[m] do timo fetal em período próximo ao nascimento mantiveram-se maiores do que no córtex e se correlacionaram positivamente com a expressão do mRNA do KDR e negativamente com a do Flt-1 até a idade adulta. Ao contrário da expressão protéica, a expressão gênica do sistema VEGF-A pode se correlacionar negativamente com aspectos quantitativos da vascularização do timo pós-natal, como observado para o mRNA do VEGF e seu receptor Flt-1 a partir dos 5 meses de idade, quando os valores das variáveis Vv[vasos,timo], Sv[vasos,timo] e Lv[vasos,timo] diminuíram significativamente (P0,05), o que sugere uma resposta de compensação ou manutenção de uma condição hipóxica instalada no órgão. / Crucial for maturation, differentiation and selection of T lymphocytes, the thymus is an essential organ to the development of immunity. In addition to its role in the maintenance of tissue integrity, thymus blood vessels play a role in migration of T-cell precursors into the organ, and show a typical architecture characterized by the presence of large blood vessels at the corticomedullary junction and fine network of branching vessels and anastomosing arcades extending into the cortex. The molecular basis of this typical vasculature and the exact mechanisms that trigger thymus involution are both not well understood. However, it has been shown that the interactions between thymus stroma, including vascular endothelium and the hematopoietic compartment play crucial roles for normal organ function. Thus, because VEGF is an essential angiogenic factor for induction of the vascular bed and modulation of functions directly related with vascularization, the aim of this study was to assess the temporal protein and mRNA expression of VEGF and its receptors Flt-1 and KDR in the thymus during early stages of its development and involution. Samples of thymus from 3 different stages of fetal development (65, 85, and 111 days) and 2 stages of postnatal life of pigs, including one stage of maturation (5 months) and another of involution (2 years) comprising a total of 25 animals that were divided into 5 groups (n = 5). Relative mRNA expression of VEGF-A system, accessed by real-time PCR, showed temporal significant changes (P<0.05) compared to endogenous control GAPDH. Quantification of blood vessels by means of stereology also showed significant differences (P0.05) between ages. Positive immunostaining for VEGF and its receptors Flt-1 and KDR was identified in the thymus of all groups and it varied between the pre and postnatal groups with rare expression in the latter, suggesting temporal differences in the modulation of mRNA. Endothelial and epithelial cells showed modulation by the VEGF-A system, suggesting paracrine or alternatively autocrine activity of this growth factor. The values of the stereological parameters Sv[m] and Vv[m] of the thymus in fetal period around the birth remained higher than in the cortex and upregulated with mRNA expression of KDR and downregulated with mRNA expression of Flt-1 until adulthood. Unlike protein expression, gene expression gene expression of VEGF-A system can be downregulated with quantitative aspects of the postnatal thymus vascularization as observed for the mRNA of VEGF and its receptor Flt-1 from the age of 5 months, when the values of the stereological parameters Vv[vessels,thymus], Sv[vessels,thymus] and Lv[vessels,thymus] decreased significantly (P0.05), which suggests a compensatory or maintenance response to an hypoxic condition in the organ.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença da proteínas - fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores R1 (Flt-1) e R2 (Flk-1) em placentas a termo de gestantes com hipergliccemia leve, comparando estes resultados com o observado em placentas de gestantes normoglicêmicas e diabéticas gestacional e clínica, através de reações de imunohistoquímica e Western Blotting. Resultados: em geral, placentas de gestantes normoglicêmicas apresentam reatividade bastante expressiva aos anticorpos contra VEGF, VEGF-R1 e -R2 nas células vasculares e trofoblásticas. Reações destacadamente intensas foram observadas no endotélio capilar, células mesenquimais, sinciciotrofoblasto e células citotrofoblásticas extravilosas para VEGF e VEGF-R2. Estes resultados sugerem que o balance VEGF/VEGFR está alterado nas placentas de gestantes com hiperglicemia leve, o que pode ser um aspecto crucial para explicar a hipercapilarização induzida nos vilos terminais neste distúrbio glicêmicos. / O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença da proteínas - fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores R1 (Flt-1) e R2 (Flk-1) em placentas a termo de gestantes com hipergliccemia leve, comparando estes resultados com o observado em placentas de gestantes normoglicêmicas e diabéticas gestacional e clínica, através de reações de imunohistoquímica e Western Blotting. Resultados: em geral, placentas de gestantes normoglicêmicas apresentam reatividade bastante expressiva aos anticorpos contra VEGF, VEGF-R1 e -R2 nas células vasculares e trofoblásticas. Reações destacadamente intensas foram observadas no endotélio capilar, células mesenquimais, sinciciotrofoblasto e células citotrofoblásticas extravilosas para VEGF e VEGF-R2. Estes resultados sugerem que o balance VEGF/VEGFR está alterado nas placentas de gestantes com hiperglicemia leve, o que pode ser um aspecto crucial para explicar a hipercapilarização induzida nos vilos terminais neste distúrbio glicêmicos.