In der neuronalen Signaltransmission spielen die vesikulären Neurotransmittertransporter eine Schlüsselrolle in der Modifikation der Quantengröße. Sie sind verantwortlich für die Befüllung der synaptischen Vesikel (SVs) mit Neurotransmittern und werden vom elektrochemischen Gradienten (ΔµH+) angetrieben, welcher durch die vakuole ATPase (V-ATPase) generiert wird. Die Aufklärung der Regulationsmechanismen der SV-Beladung kann entscheidend zur Beantwortung fundamenteller Fragen zu synaptischen Funktionen beitragen. Insbesondere der Mechanismus des vesikulären Glutamattransporters (VGLUT), der die SVs mit L-Glutamat befüllt, konnte bisweilen nicht zufriedenstellend aufgeklärt werden. Beispielsweise ist bisweilen nicht klar welcher Mechanismus der biphasischen Abhängigkeit des Transporters von Chlorid-Ionen unterliegt. Desweiteren wurden widersprüchliche Daten zur Chlorid-Leitfähigkeit des Transporters veröffentlicht. Kürzlich wurde ein Regulationsmodus vorgeschlagen, der die Glutamataufnahme durch den Austausch eines luminalen Protons mit einem cytosolischen Kalium-Ion stimuliert. Der Fokus der vorliegenden Studie liegt hauptsächlich auf dem Chlorid-Transport durch VGLUT1 und der Regulierung von VGLUT1 durch den vermeintlichen Kalium-Ion/Proton Austausch mit dem Ziel den ionischen Mechnismus des Glutamattransportes aufzuklären. Die Fragen um den ionischen Kupplungsmechanismus wurden unter Verwendung eines minimalen Systems adressiert, das aus dem rekombinanten Maus-VGLUT1 und einer Protonenpumpe aus dem Bacillus thermophilus (TF0F1) rekonstituiert in künstliche Membranen besteht und in der vorliegenden Arbeit etabliert wurde. Die VGLUT1/TF0F1 Liposomen wiesen keine Chlorid-Leitfähigkeit auf -im Gegensatz zu früheren Studien. Zudem haben hohe luminale Chlorid-Konzentrationen keinen stimulierenden Effekt auf die Glutamataufnahme gezeigt, wie zuvor berichtet. Dieses Ergebnis bestätigt zusätzlich eine fehlende Chlorid-Leitfähigkeit durch VGLUT1. Bei Untersuchungen an SVs konnte der kürzlich beschriebene Kalium-Ion/Proton Austausch beobachtet werden. Bemerkenswerterweise haben erste Ergebnisse in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass VGLUT1 selbst für den Kalium-Ion/Proton Austausch in SVs verantwortlich ist. Desweiteren wurde in dieser Arbeit ein neuartiges „Hybrid“-System entwickelt, bestehend aus SVs und Proteoliposomen mit TF0F1 und fusionsmediierenden Proteinen, die miteinander fusioniert werden. Die Einzigartigkeit dieser „fusionierten SVs“ liegt in der erstmals möglichen Modifikation des SV-Lumens, eine bisweilen schwer umsetzbare Herausfoderung. Die Glutamataufnahme kann in „fusionierten SVs“ ohne Aktivitätsverlust erhalten werden. Die „fusionierten SVs“ bieten u.a. eine einzigartige Möglichkeit den luminalen Effekt hoher Chlorid-Konzentrationen auf die Glutamataufnahme in SVs zu untersuchen.

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Synaptische Vesikel (SV) besitzen abhängig vom Neurontyp unterschiedliche Neurotransmittertransporter. In glutamatergen Neuronen kommen die vesikulären Glutamattransporter (VGLUT)1, VGLUT2 und VGLUT3 vor. GABAerge Neurone besitzen den vesikulären GABA-Transporter (VGAT). Die getrennte Glutamat- und GABA-Speicherung in unterschiedlichen Neuronen dient dem exakten Funktionieren neuronaler Netze. Mitunter setzen glutamaterge Neurone auch GABA frei. Einige entscheidende Proteine GABAerger Nervenendigungen wurden auf dem Protein- und mRNA-Niveau nachgewiesen. GABAerge Transmission glutamaterger Neurone wurde elektrophysiologisch gezeigt. Diese Studie untersucht eine mögliche VGLUT/VGAT-Kolokalisation mittels Immunisolierungen (II) von SV (SP), Neurotransmitteraufnahmeversuchen mit aufgereinigten SV, SP und der elektronenmikroskopischen Postembeddingmethode. II aus dem Rattengehirn zeigen, dass die VGLUT1-SP VGLUT2 und die VGLUT2-SP auch VGLUT1 enthält. Beide VGLUT kommen auf dem selben SV vor. Die VGLUT2-SP beinhaltet VGAT- und die VGAT-SP VGLUT2-tragende SV. SP aus frühen Entwicklungsstadien zeigen bereits eine ausgeprägte vesikuläre VGLUT2/VGAT- Kolokalisation. SV der VGAT-SP akkumulieren GABA und Glutamat. Die Hemmung der VGLUT zeigt ihren unterstützenden Einfluss auf die vesikuläre GABA- und Monoaminaufnahme. Damit moduliert die VGLUT-Aktivität die Neurotransmitterspeicherung in nicht glutamatergen Neuronen. Doppelmarkierung im Postembeddingverfahren zeigen die synaptische VGLUT/VGAT- Kolokalisation in glutamatergen hippokampalen und cerebellären Moosfaserendigungen. Dagegen ist VGAT weder in den nur VGLUT1-positiven cerebellären Parallelfaser- noch in den nur VGLUT2-positiven Kletterfaserendigungen detektierbar. Die cerebellären GABAergen Korbzellenendigungen beinhalten auch VGLUT2. Diese Befunde liefern den morphologischen Beweis für die synaptische GABA/Glutamat-Koausschüttung aus speziellen großen glutamatergen und GABAergen präsynaptischen Endigungen. / Synaptic vesicles (SV) are equipped with a common set of proteins. Dependent on the type of nerve cell SV differ in their neurotransmitter transporters, i.e. the vesicular glutamate transporters (VGLUT) 1 and VGLUT2 in types of glutamatergic neurons and the vesicular GABA transporter (VGAT) in types of GABAergic neurons. The strict separation of glutamate and GABA storage generally guarantees the precise function of neuronal networks. However, GABA may be released by glutamatergic neurons under certain conditions as shown by electrophysiological studies. The project aims to analyse a putative vesicular and synaptic co-localisation of VGLUT and VGAT using immunoisolations, neurotransmitter uptake assays, and post-embedding electron microscopy. Immunoisolations from whole brain of adult rats revealed that VGLUT1 immunoisolates (ii) contain VGLUT2 and VGLUT2-ii also have VGLUT1 indicating the vesicular co-localisation of both VGLUT. VGLUT2-ii harbour in addition VGAT and VGAT-ii also contain VGLUT2. Transporter-specific ii from rat brain at different postnatal levels (P5/15/30) show a pronounced vesicular co-localisation of VGLUT2 and VGAT during these early developmental stages. Transmitter uptake studies show GABA and also glutamate concentrating VGAT-ii. Using the specific inhibitor trypan blue we found that VGLUT activity improves GABA as well as monoamine uptake into SV. Thus VGLUT activity modulates transmitter storage in non-glutamatergic neurons. Post-embedding immunogold double labelling indicates a synaptic co-localisation of VGLUT and VGAT in glutamatergic hippocampal and cerebellar mossy fibre terminals while VGAT was not seen in cerebellar parallel fibre (VGLUT1-positive only) and climbing fibre (VGLUT2-positive only) terminals. Remarkably, cerebellar GABAergic basket cell terminals also contain VGLUT2. These findings provide the morphological evidence for a synaptic co-release of GABA and glutamate from some large glutamatergic and GABAergic terminals.

Les vésicules synaptiques (VSs) sont essentielles pour la neurotransmission. Les recherches actuelles se focalisent sur la caractérisation de leur contenu en neurotransmetteurs, leur cinétique de libération, leur distribution et leur mobilité. Les VS ne sont pas présentes exclusievement en paquet dans les boutons présynaptiques mais sont echangées de façon dynamique avec le reste de l’axone dans un super-contingent (super-pool). Notre laboratoire a précédement montré que le transporteur vésiculaire de glutamate de type 1 (VGLUT1) jouerait un rôle dans la régulation du super-pool. Mon projet de thèse se focalise sur la mobilité des VS dans les axones. En premier lieu, j’ai généré une souris gain de fonction VGLUT1mEos2 afin d'étudier la mobilité des VSs et de mieux caractériser le super-pool. Ensuite j’ai engagé une étude des relation entre la structure de VGLUT1 et ses fonctions afin d’identifier les signatures moléculaires responsable de la régulation de la taille du super-pool. J’ai identifié le second motif poly-proline à l’extremité C-terminale de VGLUT1 comme étant nécessaire et suffisante pour induire une diminution de la taille du super-pool des VSs. Pour conclure mes travaux de thèse ont contribué à la compréhension du rôle de VGLUT1 dans la régulation de la mobilité des VSs et à fournir les outils nécessaires pour de futures investigations concernant la physiologie du super-pool. / Synaptic vesicles (SVs) are essential for neurotransmission, and more efforts are needed for better understanding their neurotransmitter content, release kinetics, distribution and mobility. SVs are not only clustered in presynaptic boutons, but also dynamically shared among multiple en passant presynaptic boutons, a phenomenon named SV super‐pool. Previous work from our laboratory suggested that the Vesicular GLUtamate Transporter 1 (VGLUT1) may play a role in regulating SV super-­pool size beyond loading glutamate into SV. My Ph.D project is focused on SVs mobility in axons. Firstly, I generated a VGLUT1mEos2 knock-in (KI) mouse line, which provides extended possibilities to study the SV trafficking and characterize SV super‐pool. Secondly, I engaged in a thorough VGLUT1 structure‐function analysis. I identified that VGLUT1 tends to cluster SVs in the presynaptic boutons and reduce SVs exchange with the super‐pool via the second poly‐proline motif of its C­‐terminus. Overall, my Ph.D work contributes to the knowledge of the role of VGLUT1 in regulating SVs mobility and provides new tools for the further investigations on SV super-­pool physiology.

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