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Estandarización de la técnica RT-PCR a tiempo real para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)

Castro Sanguinetti, Gina Ruth January 2010 (has links)
El presente trabajo tuvo como objetivo estandarizar y validar la técnica de RT-PCR en tiempo real para el diagnóstico del virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV) en la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en el Perú. Se utilizaron muestras de riñón y bazo de truchas arcoíris provenientes de dos piscigranjas del departamento de Junín, tomándose 61 animales con signos clínicos de enfermedad y 60 animales aparentemente sanos. Todas las muestras fueron evaluadas mediante la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) para determinar la presencia del virus. La prueba de RT-PCR tiempo real se realizó utilizando un kit comercial en dos pasos y utilizando el fluoróforo Sybr Green I. Se utilizaron los primers WB1 y WB2 para identificar un segmento genómico específico de la proteína estructural VP2. Como controles positivos se utilizaron virus inactivado IPNV cepa Sp, así como 10 muestras inoculadas con IPNV; y como controles negativos, se utilizaron virus relacionados a IPNV como son Rotavirus A y el virus de la Bursitis Infecciosa del pollo; así como virus no relacionados. A su vez, se llevó a cabo la inoculación viral en muestras de tejido en diluciones decrecientes para determinar el grado de sensibilidad. Los resultados fueron determinados a partir de los valores del Ciclo Umbral (Ct) y temperatura de Melting (Tm) de los productos amplificados. La prueba fue capaz de detectar al virus hasta concentraciones de 102 UFP/ml. Las 121 muestras de campo resultaron negativas a IPNV; los animales enfermos evidenciaron etiologías de tipos bacterianos y no virales. Los resultados obtenidos determinaron una especificidad del 100% y una sensibilidad del 100%; a su vez, los valores predictivo positivo y predictivo negativo resultaron en 100%. La técnica de RT-PCR en tiempo real estandarizada en el laboratorio representa una técnica valiosa para el diagnóstico de IPNV. Palabras Clave: Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa, IPNV, RT-PCR, RT-PCR tiempo real / --- This study aimed to standardize and validate the real-time RT-PCR technique for diagnosis of Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Peru. Kidney and spleen samples of rainbow trout (n=121) from two fish farms of Junin were taken, 61 animals showed signs of disease and 60 were apparently healthy animals. All samples were assessed by indirect immunofluorescence technique (IIF) to determine presence of virus. Real-time RT-PCR was carried out using a two-step commercial kit. We used WB1 and WB2 primers for amplification of a specific genomic segment of the VP2 structural protein. IPNV Sp strain and 10 samples inoculated with IPNV were used as positive controls; whereas related viruses, such as rotavirus and infectious bursal disease virus from chickens, as well as unrelated viruses were all used as negative controls. Also, we inoculated decreasing dilutions of virus into tissue samples to determine the sensitivity degree of the test. Results were assesssed according to the values of the threshold cycle (Ct) and melting temperature (Tm) of the amplified products. The test was able to detect the virus in concentrations up to 102 PFU/ml. All 121 field samples were negative for IPNV; sick animals were apparently infected by bacterial agents. Real Time RT-PCR’s specificity and sensitivity were around 100%; moreover, the positive predictive value and negative predictive value was also set in 100%. Real time RT- PCR technique standardized in our laboratory is a valuable diagnostic tool for IPNV detection in field samples. Key Words: Infectious Pancreatic Necrosis Virus, IPNV, RT-PCR, real time RT-PCR
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Evaluación experimental de la patogenicidad de un virus velogénico viscerotrópico de la enfermedad de Newcastle y su respuesta inmune humoral en aves columbiformes

Caballero Romero, Fabiola January 2003 (has links)
El objetivo del presente estudio fue evaluar el grado de susceptibilidad, el efecto patológico y respuesta serológica de la paloma silvestre (especie Columba livia) frente a la inoculación experimental con una cepa de virus velogénico de la enfermedad de Newcastle. Se capturaron 28 aves adultas, 14 fueron inoculadas con una cepa velogénica viscerotrópica de la enfermedad de Newcastle, vía nasal y oral, mientras las restantes fueron criadas como grupo control. En las aves inoculadas se registró los signos clínicos y mortalidad. Se tomaron muestras de diferentes tejidos de aves que murieron así como del grupo control, para su análisis histopatológico. Se tomaron muestras de pulmón y tráquea e hisopado de cloaca para la recuperación viral, semanalmente durante seis semanas. El 64% de aves del grupo inoculado presentó signos clínicos y se obtuvo una mortalidad del 42.8%. Se presentaron estornudos a partir del cuarto día post inoculación. El erizamiento de plumas, aislamiento y letargia, se observó a partir del quinto día en aves que presentaron signos respiratorios y nerviosos. Al séptimo día se observó en el 42.8% opistótonos, tremores de cabeza y cuello que se exacerbaban al estímulo de ruidos. Al octavo día sólo en el 21 % de las aves mostraron diarrea. Los hallazgos a la necropsia consistieron en una congestión generalizada de los diferentes órganos y esplenomegalia. Las lesiones microscópicas más marcadas fueron edema, gliosis, manguito perivascular a mononucleares en cerebro y cerebelo, pérdida de cilios, infiltrado de linfocitos en tráquea, congestión interalveolar en pulmón, congestión en proventrículo, congestión e infiltración de linfocitos en intestinos y despoblamiento linfoide en bazo. El grupo inoculado mostró un incremento en sus títulos de anticuerpos a partir de la primera semana post inoculación llegando a su máximo nivel promedio geométrico de título (P.G.T) de 4.9 en la segunda semana para luego descender por completo a la quinta semana. Se logró la recuperación viral a partir de muestras de pulmón y tráquea durante las tres primeras semanas post inoculación. Se demostró que la especie Columba livia es susceptible a la inoculación experimental con una cepa velogénica del virus de la enfermedad de Newcastle. / -- This study was designed to asses the susceptibility, pathologic effect and serologic response of wild pigeons (sp. Columba livia) to Newcastle virus. A total of twenty eight adult wild pigeons were captured, fourteen were inoculated with a velogenic viscerotropic strain of Newcastle virus by oral and nasal route. The remaining pigeons were used as control group. The birds were observed to record clinical signs and mortality, also blood samples were collected for hemaglutination inhibition technique and tissue samples from lungs, tracheas and cloacal swabs were harvested for the viral recovery and histological studies. The 64 % of the inoculated group showed clinical signs and a mortality of 42.8 %. The clinical signs (sneezes, ruffled plumage, isolation and lethargy) started the fourth day post inoculation. The 43 % showed nervous signs: opisthotonos, tremors of head and neck that was exaggerated to the stimulus of noises and the 21 % showed diarrhea. In the necropsy were observed a widespread congestion and splenomegaly. The microscopic injuries were edema, gliosis, mononuclear perivascular cuffing in brain and cerebellum, loss ciliar, lymphoid infiltration in trachea, lungs congestion, proventricular congestion, and lymphocitic infiltration in intestines and lymphoid depletion in spleen. The inoculated group showed an increase in the antibody titers the first week post inoculation reaching the highest titer mean (P.G.T=4.9) in the second week after this they descended. The viral recovery was made upon lungs and tracheas tissues and from a cloacal swab in dead birds. It was showed that the specie Columba livia was susceptible to the experimental inoculation with a velogenic strain of Newcastle diasease virus.
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Epidémiologie de la maladie de West Nile en Tunisie / Epidemiology of West Nile disease in Tunisia

Bergaoui, Ramzi 18 December 2012 (has links)
Nous avons cherché à mieux comprendre la situation épidémiologique du virus West Nile (VWN) en Tunisie. Nous avons tout d'abord produit une carte du risque de transmission du VWN aux équidés montrant un risque élevé dans de nombreuses régions, dépendant de facteurs environnementaux : zones humides et climat favorables aux populations d'oiseaux sauvages et de moustiques. Le taux élevé de séroprévalence observé chez les équidés est compatible avec l'hypothèse d'une circulation endémique du VWN sans exclure la possibilité d'introductions répétées.Une étude complémentaire a démontré l'exposition des oiseaux domestiques, péri-domestiques et sauvages au VWN et a permis d'établir un premier inventaire des espèces d'oiseaux les plus exposées, pouvant servir de base à un système de surveillance de l'avifaune sauvage en Tunisie.Le suivi sérologique mensuel de poules sentinelles a permis de détecter la circulation du virus en fin de saison chaude (septembre, octobre) à proximité de zones humides pendant une période de forte activité des moustiques et d‘abondance des oiseaux sauvages. L'occurrence simultanée de cas humains de fièvre West Nile (FWN) laisse penser qu'un système de poules sentinelles serait utile pour une alerte précoce de recrudescence de l'activité du VWN.A l'issue de ce travail, nous proposons des pistes pour un système de surveillance multidisciplinaire de la FWN, adapté au contexte tunisien, et devant permettre la détection précoce de toute circulation virale. / Our investigations aimed at clarifying some aspects of the West Nile virus (WNV) epidemiological situation in Tunisia, and in particular at identifying areas at high risk of WNV circulation. A major achievement was the establishment of a risk map for the transmission of WNF in horses. This map shows that the risk of transmission strongly depends on environmental factors: increased risk associated to wetlands proximity and climatic factors favourable to wild birds and mosquitoes. The high seroprevalence observed in horses is compatible with an endemic circulation of WNV without excluding the possibility of repeated introductions.Another study in birds showed the exposure of domestic, wild resident and migratory birds to WNV, and helped establishing an initial inventory of bird species most exposed to WNV. These studies can serve as a basis for a monitoring system of wild birds in Tunisia.A system of monthly follow-up of sentinel chickens detected virus circulation at the end of the hot season (September, October), near wetlands and during a period of high mosquito activity, and abundance of wild birds. The simultaneous occurrence of human cases of WNF brought us to suggest that active surveillance in sentinel chickens would be useful for early warning of increased activity of WNV. This work allows us to propose trails for a WNV multidisciplinary monitoring system adapted to the Tunisian situation, enabling early detection of viral circulation.
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Génomique des Flavivirus : Contribution à l'analyse taxonomique et phylogénique

Moureau, Grégory 17 January 2012 (has links)
Les virus à ARN - à l'exception des rétrovirus - représentent plus de 200 pathogènes humains et/ou vétérinaires majeurs. Ils sont pour la plupart considérés comme émergents, durant les dernières années ils ont été retrouvés au-delà de leur territoire d'origine, dans de nouvelles régions du monde. Les plus connus de ces virus sont le virus du West Nile, le virus chikungunya, la grippe, le coronavirus SRAS, l'entérovirus 71 (agent responsable de la fièvre aphteuse), les virus de la dengue, l'hépatite C virus, le virus de la fièvre hémorragique de Crimée Congo, le virus de la vallée du Rift, l'encéphalite japonaise et plusieurs entérovirus humains. En terme de mortalité et morbidité ils sont à l'origine de plus 100 millions de cas par an et la menace a tendance à augmenter. Ces statistiques sont démoralisantes quand on considère les immenses progrès de la médecine et de la science durant ces dernières dizaines d'années. Les recherches présentées dans ma thèse portent sur le genre Flavivirus, au sein duquel on retrouve le virus de la fièvre jaune, un pathogène humain responsable d'épidémies majeures en Afrique et en Amérique latine durant les 300 à 400 dernières années. Ce virus est toujours responsable d'épidémies majeures en Afrique malgré un vaccin très bien toléré et des plus efficaces. On assiste au même scénario avec le virus de l'encéphalite japonaise en Inde. / Without including the retroviruses, there are in excess of 200 RNA viruses that are recognised human and/or animal pathogens, many of which are considered to be emerging viruses because during recent years they have dispersed beyond their original territories causing epidemics in new regions of the World. The more well known of these emerging viruses include, West Nile virus, chikungunya virus, influenza virus, SARS coronavirus, EV71 virus (the aetiological agent of hand foot and mouth disease), dengue virus, hepatitis C virus, Crimean Congo haemorrhagic fever virus, Rift Valley fever virus, Japanese encephalitis virus and many human enteroviruses from a variety of genera. The combined global morbidity and mortality figures for these viruses add up to 100s of millions per year and the current trend appears to be upwards. This is a depressing statistic when one considers the amazing medical and scientific achievements that we have witnessed during the past decades. The studies described in my thesis were focused on the genus Flavivirus the type species of which is yellow fever virus, another terrifyingly virulent human pathogen that has caused so much suffering in Africa and Latin America during the past 300 to 400 years. This virus continues to cause major epidemics in Africa despite the availability of one of the safest and most effective vaccines with which to control infections due to yellow fever virus. Indeed similar comments can be made in the context of the flavivirus Japanese encephalitis virus in India.
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Patogeneze eczema vaccinatum / Pathogenesis of eczema vaccinatum

Elsterová, Jana January 2012 (has links)
Vaccinia virus (VACV) is primarily known as a vaccine against its relative variola virus, the causative agent of smallpox. In the seventies of the 20th century, the vaccination campaign with VACV led to eradication of smallpox. Consequently, vaccination of the general population was stopped. Currently, the vaccination was reintroduced, namely among army and healthcare professionals. However, vaccination with VACV is accompanied with a high incidence of vaccination-related complications, namely among immunocompromised individuals. One of the complications is eczema vaccinatum, occuring in patients with atopic dermatitis. The laboratory of Dr. Melkova has focused on development of a model of eczema vaccinatum in mice Nc/Nga and on studies of pathogenesis of this complication. The goal of my diploma thesis is to contribute to characterization of imunopathogenesis of eczema vaccinatum in mice Nc/Nga infected either with VACV strain Western Reserve (WR) or with a recombinant VACV with the integrated cDNA for IRF-3 (Interferon Regulatory Factor 3; WR-IRF3). IRF-3 regulates the expression of interferon type I in response to viral infection. This recombinant virus has been constructed in the laboratory of Dr. Melková. The objective of my work was to verify the expression of the integrated cDNA for IRF-3 and to...
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Untersuchung rekombinanter Vakziniaviren MVA auf Eignung als Vektorimpfstoff gegen Infektionen mit dem Hepatitis-C-Virus / Evaluation of recombinant vaccinia virus MVA as an experimental vaccine against infections with the hepatitis c virus

Meyr, Marcus January 2004 (has links) (PDF)
Die Infektion mit dem Hepatitis C Virus (HCV) gilt als eine der Hauptursachen für chronische Hepatitiden und führt häufig zu Leberzirrhose und Leberkarzinom. Weltweit sind etwa 200 Millionen Menschen mit diesem Virus infiziert. Die aktuelle Behandlung der Hepatitis C mit Ribavirin und Interferon-alpha ist langwierig, beeinträchtigt durch Nebenwirkungen und führt nur bei einem Teil der Patienten zur Heilung. Aus diesem Grund ist die Entwicklung eines präventiv oder therapeutisch einsetzbaren Impfstoffes gegen HCV-Infektionen sehr wünschenswert. Das hoch attenuierte und in seiner Vermehrungsfähigkeit extrem eingeschränkte modifizierte Vakziniavirus Ankara (MVA) gehört zu den viel versprechendsten Kandidaten für die Entwicklung neuartiger rekombinanter Virusimpfstoffe. Im Rahmen dieser Arbeit sollten erste rekombinante MVA-HCV-Viren auf ihre Eignung als Impfstoffe untersucht werden. Als Zielantigene dienten wichtige virale Strukturproteine, darunter das unter den HCV-Genotypen hoch konservierte Nukleokapsidprotein Core, sowie das Nichtstrukturprotein NS3, welches als regulatorisches Virusprotein im HCV-Replikationszyklus eine wichtige Rolle spielt, untersucht werden. Hierfür wurden die rekombinanten MVA-Viren MVA-P7.5-HCV core (MVA-core) und MVA P7.5-HCV-1-830 (MVA-1-830) eingesetzt, welche für die HCV-Strukturproteine codierende Gensequenzen unter der Kontrolle des Vakziniavirus-spezifischen Promotors P7.5 exprimieren. Zusätzlich wurde ein weiteres rekombinantes Virus MVA-P7.5-HCV-NS3 (MVA-NS3) konstruiert, welches die Gensequenz für das HCV-Nichtstrukturprotein NS3 trägt. Alle Vektorviren erwiesen sich in in vitro Experimenten als genetisch stabil, erlaubten die Produktion der rekombinanten HCV-Antigene in infizierten Zielzellen und waren somit geeignet für in vivo Untersuchungen im Mausmodell. Da HCV-spezifischen CD8+-T-Zellantworten eine wichtige Rolle bei der Ausheilung einer Hepatitis C zugeschrieben wird, sollte insbesondere die Anregung dieser Immunantworten untersucht werden. Dabei zeigte sich, dass bereits eine einmalige Immunisierung mit MVA-core, MVA-1-830 oder MVA-NS3 ausreichend ist, um HCV-spezifische CD8+-T-Zellantworten zu induzieren. Diese CD8+-T-Lymphozyten konnten ex vivo in Epitop-spezifischer Weise zur Interferon-gamma-Synthese stimuliert werden, ließen sich Antigen-spezifisch in vitro expandieren und waren in der Lage, HCV-spezifische Zielzellen zu erkennen und zu lysieren. Zudem konnte eine Steigerung der Immunantworten durch Mehrfachapplikation der MVA-Vakzinen erzielt werden. Im Folgenden gelang es, die HCV-spezifischen CD8+-T-Zellantworten durch kombinierte Applikation der MVA-Vakzinen mit anderen rekombinanten Virusimpfstoffen wie Semliki-Forest-Viren oder Adenoviren, sowie mit Plasmid-DNA weiter zu verstärken. Solche Impfstrategien sind viel versprechend, da sich die gemeinsame Komponente der eingesetzten, unterschiedlichen Vektorvakzinen auf die rekombinanten Antigene beschränkt und eine starke Immunreaktion auf diese Antigene angeregt wird. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse erlauben die Schlussfolgerung, dass rekombinante MVA-Vektoren, die HCV-spezifische Antigene produzieren, dafür geeignet sind, um nach Impfapplikation HCV-spezifische zelluläre Immunantworten zu induzieren. Die im Tiermodell erarbeiteten, optimierten Immunisierungsstrategien liefern eine erste Grundlage für weitere Immunisierungsexperimente in Primatenmodellen und zur Planung erster klinischer Studien im Menschen. / Infections with hepatitis C virus (HCV) are considered as one of the main causes for chronic hepatitis and often lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. About 200 million people worldwide are chronically infected with this virus. The current antiviral therapy relying on ribavirin and interferon-alpha is time consuming, often impaired by side effects and leads to resolution of the disease in only a part of the patients. For this reason, the development of a prophylactic or therapeutic vaccine against HCV infections is very desirable. The highly attenuated and replication deficient modified vaccinia virus Ankara (MVA) is one of the most promising candidates for development of new generation virus vaccines. Purpose of this work was to evaluate first recombinant MVA HCV viruses for their suitability as vaccines against hepatitis C. HCV structural proteins, amongst them the highly conserved core protein, as well as the non-structural protein NS3, which plays a key regulatory role in the HCV replication cycle, served as target antigens for MVA vaccine development. First, we investigated recombinant MVA viruses MVA-P7.5-HCV-core (MVA-core) and MVA-P7.5-HCV-1-830 (MVA-1-830), which express the coding gene sequences for HCV structural proteins under control of the vaccinia virus specific promoter P7.5. Second, we constructed and characterized a recombinant virus MVA-P7.5-HCV-NS3 (MVA-NS3) that carries the gene sequence for the HCV non-structural protein NS3. As demonstrated by in vitro experiments, all vector viruses were genetically stable, permitted the production of recombinant HCV antigens in infected target cells and were thus suitable for in vivo experiments using mouse models. Since HCV specific CD8+ T cell responses are considered important in hepatitis C virus clearance, special emphasis was given to the analysis of induction of this kind of immune response. When tested in first vaccination experiments, already a single immunization with MVA-core, MVA-1-830 or MVA-NS3 was sufficient to induce HCV specific CD8+ T cell responses. These CD8+ T lymphocytes could be stimulated ex vivo in an epitope specific manner, resulting in interferon-gamma production, could be further expanded in vitro and were able to recognize and lyse HCV specific target cells. Additionally, multiple applications of the MVA vaccines resulted in an increase of these cellular immune responses. In a final series of experiments, the possibility to further amplify HCV specific CD8+ T cell responses could be demonstrated by using combined applications of MVA with other experimental gene transfer vaccines based on Semliki Forest virus, adenovirus or plasmid DNA. Overall, the results of this work clearly suggest that recombinant MVA vectors delivering HCV specific antigens, are suitable candidate vaccines for induction of HCV specific cellular immune responses upon immunization. Importantly, the definition of optimized immunization strategies offers a rational basis for further immunization studies in primate models and for the conception of first clinical studies in humans.
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INHIBITING HEPATITIS B VIRUS GENE EXPRESSION WITH HAMMERHEAD RIBOZYMES THAT TARGET THE HBx OPEN READING FRAME

Weinberg, Marc Saul 28 October 2002 (has links)
A thesis submitted to the Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, Johannesburg, in fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy Johannesburg, 2002 / Hepatitis B virus (HBV) infection is endemic to several populous regions and is often complicated by cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Present treatment of chronic HBV infection is usually ineffective and novel therapeutic approaches are an important medical objective. The X open reading frame (ORF) of HBV, HBx, is a conserved sequence that overlaps with the polymerase ORF and viral c/'s-elements, and is present within all viral transcripts. In addition, the HBx ORF encodes a 17 kDa transactivator protein, HBx, which is required for the establishment of viral infection and has been implicated in HBV-associated hepatocarcinogenesis. The HBx sequence thus represents a compelling target for applying nucleic acid hybridisation-based therapeutic agents for the inhibition of HBV gene expression and replication. / IT2018
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The effects of interferon on cultured cells persistently infected with viruses

Crespi, Madeleine 09 September 1986 (has links)
A Thesis Submitted to the Faculty of Medicine University of the Witwatersrand, Johannesburg for the Degree of Doctor of Philosophy in Medicine Johannesburg 1986 / An investigation was done to examine the role of IFN in viral persistence at the cellular level. For this purpose two types of persistent infections were chosen. The first type was cell lines which contained hepatitis B virus (HBV) DNA (PLC/PRF/5 and Hep 3B cells) uninfected control hepatoma cells, (Mahlavu, HA22T and Hep G2 cells) or simian virus 40 (SV40) DNA (C2, C6, Cll cells) and control uninfected (CV-1 cells). In the second type of infection Vero cells persistently infected with SSPE or Sendai virus were used. / IT2018
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Élargissement du spectre de résistance aux potyvirus : utilisation de la plante modèle Arabidopsis thaliana / Enlargement of plants resistance spectrum to RNA viruses using the Arabidopsis thaliana plant model

Bastet, Anna 22 November 2018 (has links)
Pour lutter contre les maladies virales chez les plantes cultivées, il est important de développer des résistances génétiques. Dans ce contexte, les facteurs d’initiation de la traduction eIF4E jouent un rôle majeur dans la mise en place de résistance aux potyvirus, un groupe de virus à ARN nuisible pour les cultures. Fréquemment, des allèles naturels de résistances ont été sélectionnés dans les espèces à intérêt agronomique. Cependant, nombreuses sont les espèces ne possédant pas de résistance naturelle. Pour remédier à ce problème, j’étudie lors de ma thèse le pathosystème Arabidopsis thaliana-potyvirus afin d’élaborer de nouvelles sources de résistances, en vue d’étendre leur application aux plantes cultivables. Pour ceci, je crée artificiellement par mutagénèse dirigée des allèles de résistances dont je teste dans la plante la fonctionnalité ainsi que l’efficacité vis-à-vis de la résistance. En combinant ces allèles de résistance synthétiques avec d’autres résistances liées aux facteurs eIF4E, je vise à élargir le spectre de résistance aux potyvirus ainsi qu’à augmenter la durabilité de ces résistances. Cette étude permettra de prouver la faisabilité de ce système pour obtenir des plantes à large spectre de résistance avant de pouvoir ainsi l’appliquer aux plantes à intérêt agronomique. / The development of genetic resistance is important to avoid viral infections in cultivated crops. In this context, translation initiation factors eIF4E have a major role in resistance to potyviruses, a family of viruses damageable to crops. Although natural resistance alleles are often used in crops breeding, there are still species devoided of such natural resistance, making it impossible to develop genetic resistance. Using the Arabidopsis thaliana-potyviruses pathosystem, I aim at developing new sources of resistances as a proof of concept before considering their application to crop species. For this, I am developing artificial resistance alleles created by directed mutagenesis before testing them for both their functionality and their resistance efficiency in plants. By combining these synthetic resistance alleles with others eIF4E factors-mediated resistance, my aim is to enlarge resistance spectrum to potyviruses as well as to increase the resistance durability. This study will make proof of the feasibility of this system to obtain large spectrum resistance plants with the perspective of extending it to cultivated plants.
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Exploration des interactions virus-hôte et leur importance pour l'adaptation microbienne à travers du CRISPRs / Exploring environmental virus-host interactions and their relevance to microbial adaptation using CRISPRs

Sanguino Casado, Laura 10 November 2015 (has links)
Les interactions entre les membres d'une communauté microbienne peuvent être un moyen d'adaptation dans l'environnement. Parmi les nombreuses interactions qui ont lieu dans un écosystème et qui joue un rôle majeur sur la diversité et la dynamique des populations microbiennes est celui des virus procaryotes et leurs hôtes. Les virus peuvent également arbitrer le transfert de matériel génétique entre les procaryotes (transduction), qui pourrait être un mécanisme d'adaptation rapide. Afin de déterminer l'impact potentiel des virus et la transduction, nous avons besoin d'une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre virus et leurs hôtes dans l'environnement. Les données sur les virus de l'environnement sont rares, et les méthodes pour le suivi de leurs interactions avec les procaryotes sont nécessaires. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs), qui contiennent des séquences virales dans les génomes bactériens, pourraient aider à documenter l'histoire des interactions virus-hôte dans l'environnement. Ainsi, cette thèse vise à explorer les interactions virus-hôte dans un environnement donné à travers du séquences CRISPR.Les virus de la cryosphère sont considérés comme abondantes, très actif et avec de larges gammes d'hôtes. Ces caractéristiques pourraient faire de la transduction virale, un facteur clé pour l’adaptation microbienne dans ces environnements. Des métagénomes publics créés à partir des environnements avec une gamme de températures différents ont été examinés. De cette manière, certaines dynamiques d'interactions virus-hôte se sont révélées comme ayant une corrélation avec la température. Un flux de travail a ensuite été développé pour créer un réseau reliant les virus et leurs hôtes en utilisant des séquences CRISPR obtenus à partir de données métagénomiques de la glace des glaciers et du sol de l'Arctique. La création de réseaux d'infection à traves du CRISPRs a fourni une nouvelle perspective sur les interactions virus-hôte. En outre, nous avons cherché des événements de transduction dans les données métagénomiques par la recherche de séquences virales contenant de l'ADN microbien. L’analyse indiquée que les bactériophages du Ralstonia pourraient être des agents de transduction dans la glace des glaciers de l'Arctique. / Interactions between the members of a microbial community can be a means of adaptation in the environment. Among the many interactions that take place in an ecosystem and have been seen to play a major role on microbial diversity and population dynamics is that of prokaryotic viruses and their hosts. Viruses can also mediate the transfer of genetic material between prokaryotes (transduction), which could be a mechanism for rapid adaptation. In order to determine the potential impact of viruses and transduction, we need a better understanding of the dynamics of interactions between viruses and their hosts in the environment. Data on environmental viruses are scarce, and methods for tracking their interactions with prokaryotes are needed. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs), which contain viral sequences in bacterial genomes, might help document the history of virus-host interactions in the environment. Thus, this thesis aimed to explore virus-host interactions in a given environment through CRISPRs. Viruses in the cryosphere have been seen to be abundant, highly active and with broad host ranges. These characteristics could make viral transduction a key driver of adaptation in these environments. Public metagenomes created from environments over a range of temperatures were examined through sequence and CRISPR analysis. In this fashion, certain virus-host interaction dynamics were found to have a correlation with temperature. A workflow was then developed to create a network linking viruses and their hosts using CRISPR sequences obtained from metagenomic data from Arctic glacial ice and soil. The creation of CRISPR-based infection networks provided a new perspective on virus-host interactions in glacial ice. Moreover, we searched for transduction events in metagenomic data by looking for viral sequences containing microbial DNA. Further analysis of the viral sequences in the CRISPRs indicated that Ralstonia phages might be agents of transduction in Arctic glacial ice.

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