Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El uso de micropartículas de polímeros naturales ha sido descrito como una innovadora técnica de formulación de adyuvantes para diversas vacunas. En este estudio se prepararon micropartículas de quitosano (MPQ) y de carragenina (MPC) como también de diferentes proporciones volumétricas (1:1; 1:3; 3:1) usando soluciones de quitosano de 0.1 a 1% (p/v) y carragenina al 0.83% (p/v), respectivamente, las cuales se utilizaron como adyuvantes en forma de micropartículas para una vacuna peptídica contra la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I). Las micropartículas de quitosano y carragenina (MPQC) fueron obtenidas mediante una técnica combinada de coacervación compleja, usando agitación mecánica y ultrasonicación y la técnica de secado por atomización. Lográndose un método optimizado de formación de micropartículas. Se determinó el porcentaje de rendimiento (R) de las micropartículas y se caracterizaron las propiedades de tamaño, morfología y potencial zeta. Adicionalmente, se evaluaron los parámetros de eficiencia de encapsulación (EE), capacidad de carga (CC) en estudios in vitro de encapsulación. Así mismo se estudió la cinética de liberación in vitro de las proteínas de albúmina sérica de bovino (BSA) y de un análogo de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH G/Q) en solución de buffer fosfato de pH 7.4 a 37 ºC. Las micropartículas MPQC obtenidas por la técnica de ultrasonicación fueron elegidas para el presente estudio. El análisis morfológico mediante microscopia SEM de las MP mostró diversas morfologías y tamaños, siendo las MPQC (3:1) de forma elíptica, bordes definidos, superficie lisa, las características más constantes, cuyos tamaños fluctuaron entre 4 a 7 μm. Los resultados de Z potencial confirmaron la carga neta positiva del quitosano con valores promedios para las MPQ de +47,91 mV y de -52,86 mV para la carga negativa de carragenina. Los valores de Z potencial de las micropartículas MPQC fueron +49,89, + 27,88 y -41,79 para las relaciones de 3:1, 1:1 y 1:3. Los tamaños obtenidos por el analizador de tamaño de partículas fluctúo entre 1495,9 nm y 13302,6 nm, siendo mayor para las MPQC. El valor de R mayor fue de las MPQ. Los valores de EE y CC fue mayor en MP compuestas por complejos poliiónicos cargadas con GnRH G/Q. La cinética de liberación in vitro presentó dos picos de liberación a los 7 y 14 días aprox. de estudio. En conclusión, fue posible la obtención de MP en base a quitosano-carragenina con diferentes formas, tamaños y potencial zeta. A su vez las MP compuestas por complejos poliiónicos presentaron valores elevados de EE y CC, como también una sostenida y prolongada cinética de liberación in vitro, concluyéndose que esta formulación de complejos poliiónicos podría utilizarse como una nueva opción de adyuvante para la vacuna peptídica contra GnRH-I / Proyecto FONDEF D08I1085

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / El quitosano es un polímero natural muy estudiado actualmente, este material deriva de la quitina, que es el biopolímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa y el componente principal del exoesqueleto de crustáceos e insectos, y paredes celulares de algunas bacterias y hongos. El quitosano es también un polisacárido cuya principal fuente de producción es la hidrólisis de la quitina en medio alcalino. Este polímero parcialmente desacetilado, está constituido por copolímeros de β-(1-4)-D-glucosamina (unidades desacetiladas) y N-acetil-D-glucosamina (unidades acetiladas). El quitosano es biodegradable, carece de toxicidad, posee actividad inmunogénica y alta viscosidad, lo que lo hace un excelente candidato como un adyuvante de depósito. El objetivo de la presente memoria de título fue evaluar la capacidad adyuvante del quitosano por medio de la vacunación de ratas con una vacuna peptídica anti GnRH inoculada parenteralmente. Si bien esto ya se ha realizado en otros estudios, no se habían evaluado anteriormente otras soluciones de quitosano como el quitosano de bajo peso molecular, o el quitosano fosforilado. Para determinar la inmunogenicidad del quitosano como adyuvante, se inoculó un grupo de ratas macho con la proteína GnRX G/Q (capaz de neutralizar el GnRH, desarrollada en el Laboratorio Biovetec de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile) junto con las soluciones de quitosano a evaluar, otro grupo de ratas con Adyuvante completo de Freund (ACF) como adyuvante y otras con la proteína suspendida en PBS como grupo control. Estas ratas fueron inoculadas 2 veces, el día 0 y 30 días después y se les extrajo sangre cada 15 días por 75 días, para medir los niveles de testosterona sérica y estimar la cantidad de inmunoglobulinas por medio de ELISA. Los resultados revelaron que las tres soluciones de quitosano en estudio fueron superiores en la generación de IgG1 al ACF, y al grupo control. Y quedó en evidencia que la proteína GnRX G/Q no es inmunogénica por si sola. También fue posible demostrar que la vacuna con quitosano como adyuvante disminuye los niveles de testosterona sérica llegando a ser más efectiva que la vacuna con ACF como adyuvante. De esta manera fue posible dar aprobada la hipótesis planteada de que el quitosano mejora la respuesta inmune en un modelo de vacuna peptídica.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente estudio se determinaron los cambios histológicos gonadales e hipotalámico-hipofisiarios en ratones hembra Balb/c inmunizados con una vacuna peptídica contra la hormona GnRH-I, basada en el antígeno recombinante GnRX/ GQ y quitosano como adyuvante, en una formulación soluble y una estrategia de micropartículas. Los animales inmunizados (días 1 y 30) desarrollaron anticuerpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a contra el antígeno recombinante desde la primera vacunación y contra la hormona nativa GnRH-I desde la revacunación. Se observó una disminución del número de cuerpos lúteos y folículos preovulatorios en el parénquima ovárico de los individuos inmunizados, principalmente en el grupo donde se utilizó quitosano soluble como adyuvante. Por otro lado, en los animales inmunizados se determinó mediante inmunohistoquímica, un aumento de células positivas para GnRH-I en la zona hipotalámico-hipofisiaria, sin embargo, en estudios futuros se debe complementar la inmunohistoquímica de encéfalo con un método cuantitativo como qPCR, debido a la difícil estandarización y cuantificación de los resultados obtenidos mediante inmunohistoquímica encefálica en ratones

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La inmunocastración surge como una herramienta valiosa para el control de la fertilidad y la actividad reproductiva en animales de producción, silvestres y de compañía. El objetivo de la presente memoria de título fue evaluar el patrón de inmunidad adquirida en animales inmunizados con una vacuna peptídica contra la hormona GnRH-I (proteína recombinante GnRXG/Q) inoculada por vía parenteral, analizando las inmunoglobulinas y citoquinas producidas. Se utilizaron tres estrategias adyuvantes distintas. Un grupo de ratones hembras de la cepa Balb/c fue vacunado con la proteína recombinante y quitosano de alto peso molecular como adyuvante (HMW), en un segundo grupo se utilizó la proteína recombinante y quitosano de bajo peso molecular como adyuvante (LMW) para la vacunación y en el tercer grupo la inmunización con la proteína recombinante y adyuvante incompleto de Freund (IFA). El grupo control fue inoculado solo con quitosano. Las inmunizaciones fueron realizadas en los días 0 y 30. Se realizaron extracciones de sangre cada 15 días, obteniendo el suero de los animales inmunizados para la determinación de los niveles de inmunoglobulinas mediante una prueba de ELISA indirecto. Al día 90 del estudio se realizó el sacrificio de los animales, con el objetivo de obtener sus linfocitos, los cuales fueron llevados a un cultivo celular primario que permitió la posterior determinación del patrón de citoquinas producidas por cada grupo experimental mediante una prueba de ELISA tipo “sándwich”. Al momento de la eutanasia se realizó también una ovariohisterectomía para el posterior estudio histológico del parénquima ovárico. Los resultados obtenidos revelaron que al utilizar quitosano HMW se induce una respuesta inmune de tipo TH2, debido a que se observaron mayores niveles de IgG isotipo 1 y un patrón de citoquinas con mayores niveles de IL-10 e IL-4. En cambio, al usar quitosano LMW como adyuvante, la respuesta inmune obtenida fue de tipo TH1, con un mayor nivel de IgG isotipo 2a y un patrón de citoquinas con mayores niveles de IFN-γ e IL-2. EL adyuvante incompleto de Freund (IFA) produjo una respuesta de tipo TH1, pero con niveles de IgG isotipo 2a contra la hormona GnRH-I menores que los obtenidos al usar quitosano LMW. Los cambios histológicos en el parénquima ovárico sugieren que la vacunación con la proteína recombinante GnRXG/Q genera una inhibición en la actividad ovárica, efecto que fue más marcado al usar quitosano LMW como estrategia adyuvante