L’analyse protéomique par spectrométrie de masse s’est imposée comme une méthode incontournable pour la caractérisation des protéines. Grâce aux progrès de l’instrumentation et de la bioinformatique, l’interprétation automatisée des spectres MS/MS permet aujourd’hui d’identifier des milliers de protéines dans un type cellulaire. Cependant, cette méthodologie s’applique encore difficilement aux organismes dont les génomes n’ont pas été séquencés, et donc pour lesquels il n’existe pas de banques de séquences peptidiques de référence. Notre travail a porté sur le développement et l’application d’une méthodologie d’interprétation des données MS/MS pour les organismes à génomes non séquencés. Cette méthodologie est basée sur le séquençage de novo suivi de recherche MS-BLAST. Ainsi nous avons pu : Identifier les différents partenaires de complexes protéiques tels que les protéines des complexes TgGAP50, TgAlba, TgSORTLR impliqués dans la motilité, la virulence ou le trafic intracellulaire des protéines du parasite Toxoplasma gondii, Identifier et caractériser des variants d’hémoglobine humaine, Identifier les protéines différentiellement exprimées lors des interactions vigne et champignons à génomes non séquencés dans la maladie de l’esca, Caractériser finement la N-glycosylation de l’invertase vacuolaire du raisin. Nous avons pu réaliser nos études sur des échantillons d’origines très différentes : homme, plantes, champignons, parasites et nous avons apporté des éléments de réponses moléculaires aux questions biologiques. / The proteomic analysis by mass spectrometry is now an essential method for the characterization of proteins. Thanks to advances in instrumentation and bioinformatics, automated interpretation of MS/MS spectra can now identify thousands of proteins in a cell type. However, this methodology remains poorly applied to the organisms that genomes are not sequenced and therefore where there is no database of reference for peptides sequences. Our work has focused on the development and application of a methodology for the interpretation of MS/MS data for the organisms that genomes are not sequenced. This methodology is based on the de novo sequencing followed by MS-BLAST search. Thus we have: Identify different partners of protein complexes such as proteins TgGAP50, TgAlba and TgSORTLR complex, involved in motility, virulence or intracellular protein trafficking of Toxoplasma gondii, Identify and characterize human hemoglobin variants, Identify the proteins differentially expressed during interaction of vines and fungi that genomes are not sequenced in esca disease, Finely characterize the N-glycosylation of the grape vacuolar invertase. We have achieved our studies on samples of very different origins: human, plants, fungi, parasites, and we provided evidence of molecular responses to biological questions.