Introdução: Um fator que pode contribuir para o desenvolvimento da dor neuropática é a modulação negativa da via descendente da dor pelo aumento da degradação do triptofano pela ativação da enzima indoleamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1) ou a ativação da via descendente facilitatória da dor por um agonista glutamatérgicos produzido pela enzima quinurenina 3 monoxigenase (KMO). Objetivo: Foi avaliar a participação das enzimas IDO1 e a KMO presente na substância cinzenta periaquedutal (PAG) e no bulbo rostral ventromedial (RVM) no desenvolvimento da dor neuropática em camundongos induzida pelo modelo SNI. Metodologia: A indução da neuropatia experimental foi realizada de acordo com (Bourquin et al., 2006). A expressão da IDO1 e KMO foi realizada pela técnica de Western blotting. A administração de drogas foi realizada por via oral, intraperitoneal, intratecal e intracerebroventricular (i.c.v.). Resultados: Foi observado o aumento da expressão da enzima IDO1 no RVM (7 dias) e PAG (3, 7, 14 e 21 dias) após SNI. A microinjeção de Norharmane no espaço i.c.v. reduziu a hipersensibilidade mecânica no 7, 14 e 21 dias após SNI. Corroborando com esses achados, animais deficientes para a enzima IDO1 submetidos a SNI não desenvolvem a hipersensibilidade mecânica. Além disso, a expressão da enzima KMO aumenta significativamente no 7 e 14 dias no RVM e 7 dias na PAG após SNI. Por conseguinte, a administração oral de JM6, pró-droga de liberação lenta do Ro61-8048, ou Ro61-8048 (inibidor da KMO) no espaço i.c.v. reduziu significativamente a hipersensibilidade mecânica nos dias 7, 14 ou 21 após SNI. Sabendo que a expressão da enzima IDO1 é modulada pela citocina IFN-, verificamos que os animais deficientes para a citocina IFN- apresentam hipersensibilidade mecânica reduzida. Ainda, os animais IFN- KO possuem expressão reduzida da IDO1 no RVM 7 dias e na PAG 14 dias após a SNI. Em adição, a microinjeção de doses crescentes de IFN- no espaço i.c.v. induz uma hipernocicepção mecânica em camundongos naives. Constatamos também que animais CD4+ KO, mas não os animais CD8+ KO apresentam reduzida expressão da enzima IDO1 no RVM e na PAG e consequentemente menor hipersensibilidade mecânica após SNI. A microinjeção dos metabolitos da via das quinureninas, no espaço i.c.v. de camundongos causou hipersensibilidade mecânica, sendo o QUIN o mais potente. Sugerimos que a ativação da via das quinureninas seja dependente da ativação do receptor NMDA, visto que o pré-tratamento local com o MK801 (antagonista seletivos dos receptores NMDA) reverte os efeitos nociceptivos induzidos pelos metabólitos. Além disso, o efeito nociceptivo induzido por QUIN depende ativação da via descendente facilitatória. Constatamos que os animais neuropáticos exibem um comportamento do tipo depressivo e esse comportamento não é observado em animais IFN- KO e CD4KO. Por último, avaliamos a participação da via das quinureninas no desenvolvimento do comportamento depressivo associado à SNI e constatamos que esse comportamento depende da ativação das enzimas IDO1 e KMO. Conclusão: Os resultados sugerem que as enzimas IDO1 e KMO, localizadas em regiões supraespinais desempenham um importante papel no desenvolvimento da dor neuropática, assim como da comorbidade depressão. Além disso, a expressão da IDO1 é dependente da sinalização via citocina IFN- e células CD4+. O mecanismo responsável pelo desenvolvimento da hipersensibilidade neuropática deve-se tanto a redução dos níveis de triptofano/5-HT, diminuição da eficiência da via descendente inibitória, quanto ao aumento dos níveis de QUIN, que ativa a via descendente facilitatória da dor. / Introduction: One factor that may contribute to the development of neuropathic pain is the negative modulation of the descending pain pathway by increased degradation of the activation of tryptophan by enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase1 (IDO1) or activation of the descending facilitatory pain pathway for a glutamate agonist produced by the enzyme kynurenine 3 monooxygenase (KMO). Aim: We evaluate the role of IDO1 and KMO in the periaqueductal gray (PAG) and the rostral ventromedial medulla (RVM) in the development of neuropathic pain in mice induced by SNI model. Methods: Induction of experimental neuropathy was performed according to (Bourquin et al. 2006). The expression of IDO1 and KMO was carried out by Western blotting technique. The drug administration was performed orally, intraperitoneally and intracerebroventricularly (i.c.v) Results. We observed increased IDO1 expression in the RVM (7 days) and PAG (3, 7, 14 and 21 days) after SNI. The microinjection Norharmane in i.c.v. space reduced mechanical hypersensitivity in the 7, 14 and 21 days after SNI. Corroborating these findings, mice deficient for the enzyme IDO1 undergoing SNI did not develop mechanical hypersensitivity. Furthermore, the KMO expression was significantly increased in the 7 and 14 days in the RVM and 7 days in PAG after SNI. Therefore, oral administration of JM6, prodrug slow release from Ro61-8048 or Ro61-8048 (KMO inhibitors) within i.c.v. significantly reduced the mechanical hypersensitivity at day 7, 14 or 21 after SNI. Knowing that the expression of IDO1 enzyme is modulated by IFN- cytokine, it was found that animals deficient for IFN- cytokine have reduced mechanical hypersensitivity. Moreover, IFN- ko animals have reduced expression of IDO1 RVM 7 days and 14 days after SNI in the PAG. In addition, microinjection of increasing doses of IFN- in i.c.v. induced mechanical hyperalgesia. We also found that CD4 + KO animals, but not CD8 + KO animals showed reduced expression of the enzyme IDO1 RVM and PAG and consequently lower mechanical hypersensitivity after SNI. The microinjection of the main metabolites of kynurenine pathway into the i.c.v. spaces induced mechanical hypersensitivity, QUIN being the most potent. We suggest that the activation of the kynurenine pathway was dependent of NMDA receptor activation, whereas the spot pre-treatment with MK801 (selective NMDA receptor antagonist) reverses the effects induced by noxious metabolites. After that, the microinjection into i.c.v. spaces of MK801 reduced mechanical hypersensitivity after SNI. Furthermore, nociceptive effect induced by QUIN depends activation of the descending facilitatory. We found that the neuropathic animals exhibit depressive-like behavior and this behavior is not observed in IFN- KO and CD4KO mice. Finally, we evaluate the participation of kynurenine pathway in the development of depressive-like behavior associated with SNI and found that this behavior depends on the activation of IDO1 and KMO Conclusion: These results suggest that IDO1 and KMO enzyme, located in supraspinal regions play a role in the development of neuropathic pain as well as comorbidity depression. Furthermore, the expression of IDO1 are dependent on signaling via cytokine IFN- and CD4+ cells. The mechanism responsible for the development of neuropathic hypersensitivity is due to both reduced levels of tryptophan/5-HT decrease the descending inhibitory pain pathway efficiency, as the increased levels of QUIN, which activates the descending facilitatory pain pathway.

Introdução: Um fator que pode contribuir para o desenvolvimento da dor neuropática é a modulação negativa da via descendente da dor pelo aumento da degradação do triptofano pela ativação da enzima indoleamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1) ou a ativação da via descendente facilitatória da dor por um agonista glutamatérgicos produzido pela enzima quinurenina 3 monoxigenase (KMO). Objetivo: Foi avaliar a participação das enzimas IDO1 e a KMO presente na substância cinzenta periaquedutal (PAG) e no bulbo rostral ventromedial (RVM) no desenvolvimento da dor neuropática em camundongos induzida pelo modelo SNI. Metodologia: A indução da neuropatia experimental foi realizada de acordo com (Bourquin et al., 2006). A expressão da IDO1 e KMO foi realizada pela técnica de Western blotting. A administração de drogas foi realizada por via oral, intraperitoneal, intratecal e intracerebroventricular (i.c.v.). Resultados: Foi observado o aumento da expressão da enzima IDO1 no RVM (7 dias) e PAG (3, 7, 14 e 21 dias) após SNI. A microinjeção de Norharmane no espaço i.c.v. reduziu a hipersensibilidade mecânica no 7, 14 e 21 dias após SNI. Corroborando com esses achados, animais deficientes para a enzima IDO1 submetidos a SNI não desenvolvem a hipersensibilidade mecânica. Além disso, a expressão da enzima KMO aumenta significativamente no 7 e 14 dias no RVM e 7 dias na PAG após SNI. Por conseguinte, a administração oral de JM6, pró-droga de liberação lenta do Ro61-8048, ou Ro61-8048 (inibidor da KMO) no espaço i.c.v. reduziu significativamente a hipersensibilidade mecânica nos dias 7, 14 ou 21 após SNI. Sabendo que a expressão da enzima IDO1 é modulada pela citocina IFN-, verificamos que os animais deficientes para a citocina IFN- apresentam hipersensibilidade mecânica reduzida. Ainda, os animais IFN- KO possuem expressão reduzida da IDO1 no RVM 7 dias e na PAG 14 dias após a SNI. Em adição, a microinjeção de doses crescentes de IFN- no espaço i.c.v. induz uma hipernocicepção mecânica em camundongos naives. Constatamos também que animais CD4+ KO, mas não os animais CD8+ KO apresentam reduzida expressão da enzima IDO1 no RVM e na PAG e consequentemente menor hipersensibilidade mecânica após SNI. A microinjeção dos metabolitos da via das quinureninas, no espaço i.c.v. de camundongos causou hipersensibilidade mecânica, sendo o QUIN o mais potente. Sugerimos que a ativação da via das quinureninas seja dependente da ativação do receptor NMDA, visto que o pré-tratamento local com o MK801 (antagonista seletivos dos receptores NMDA) reverte os efeitos nociceptivos induzidos pelos metabólitos. Além disso, o efeito nociceptivo induzido por QUIN depende ativação da via descendente facilitatória. Constatamos que os animais neuropáticos exibem um comportamento do tipo depressivo e esse comportamento não é observado em animais IFN- KO e CD4KO. Por último, avaliamos a participação da via das quinureninas no desenvolvimento do comportamento depressivo associado à SNI e constatamos que esse comportamento depende da ativação das enzimas IDO1 e KMO. Conclusão: Os resultados sugerem que as enzimas IDO1 e KMO, localizadas em regiões supraespinais desempenham um importante papel no desenvolvimento da dor neuropática, assim como da comorbidade depressão. Além disso, a expressão da IDO1 é dependente da sinalização via citocina IFN- e células CD4+. O mecanismo responsável pelo desenvolvimento da hipersensibilidade neuropática deve-se tanto a redução dos níveis de triptofano/5-HT, diminuição da eficiência da via descendente inibitória, quanto ao aumento dos níveis de QUIN, que ativa a via descendente facilitatória da dor. / Introduction: One factor that may contribute to the development of neuropathic pain is the negative modulation of the descending pain pathway by increased degradation of the activation of tryptophan by enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase1 (IDO1) or activation of the descending facilitatory pain pathway for a glutamate agonist produced by the enzyme kynurenine 3 monooxygenase (KMO). Aim: We evaluate the role of IDO1 and KMO in the periaqueductal gray (PAG) and the rostral ventromedial medulla (RVM) in the development of neuropathic pain in mice induced by SNI model. Methods: Induction of experimental neuropathy was performed according to (Bourquin et al. 2006). The expression of IDO1 and KMO was carried out by Western blotting technique. The drug administration was performed orally, intraperitoneally and intracerebroventricularly (i.c.v) Results. We observed increased IDO1 expression in the RVM (7 days) and PAG (3, 7, 14 and 21 days) after SNI. The microinjection Norharmane in i.c.v. space reduced mechanical hypersensitivity in the 7, 14 and 21 days after SNI. Corroborating these findings, mice deficient for the enzyme IDO1 undergoing SNI did not develop mechanical hypersensitivity. Furthermore, the KMO expression was significantly increased in the 7 and 14 days in the RVM and 7 days in PAG after SNI. Therefore, oral administration of JM6, prodrug slow release from Ro61-8048 or Ro61-8048 (KMO inhibitors) within i.c.v. significantly reduced the mechanical hypersensitivity at day 7, 14 or 21 after SNI. Knowing that the expression of IDO1 enzyme is modulated by IFN- cytokine, it was found that animals deficient for IFN- cytokine have reduced mechanical hypersensitivity. Moreover, IFN- ko animals have reduced expression of IDO1 RVM 7 days and 14 days after SNI in the PAG. In addition, microinjection of increasing doses of IFN- in i.c.v. induced mechanical hyperalgesia. We also found that CD4 + KO animals, but not CD8 + KO animals showed reduced expression of the enzyme IDO1 RVM and PAG and consequently lower mechanical hypersensitivity after SNI. The microinjection of the main metabolites of kynurenine pathway into the i.c.v. spaces induced mechanical hypersensitivity, QUIN being the most potent. We suggest that the activation of the kynurenine pathway was dependent of NMDA receptor activation, whereas the spot pre-treatment with MK801 (selective NMDA receptor antagonist) reverses the effects induced by noxious metabolites. After that, the microinjection into i.c.v. spaces of MK801 reduced mechanical hypersensitivity after SNI. Furthermore, nociceptive effect induced by QUIN depends activation of the descending facilitatory. We found that the neuropathic animals exhibit depressive-like behavior and this behavior is not observed in IFN- KO and CD4KO mice. Finally, we evaluate the participation of kynurenine pathway in the development of depressive-like behavior associated with SNI and found that this behavior depends on the activation of IDO1 and KMO Conclusion: These results suggest that IDO1 and KMO enzyme, located in supraspinal regions play a role in the development of neuropathic pain as well as comorbidity depression. Furthermore, the expression of IDO1 are dependent on signaling via cytokine IFN- and CD4+ cells. The mechanism responsible for the development of neuropathic hypersensitivity is due to both reduced levels of tryptophan/5-HT decrease the descending inhibitory pain pathway efficiency, as the increased levels of QUIN, which activates the descending facilitatory pain pathway.

A enzima indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) é responsável pela degradação de triptofano (TRP) pela via das quinureninas. O aumento da expressão de IDO é a grande responsável pela resposta de tolerância imunológica e pode ser induzida por IFN-γ e lipopolissacarídeos (LPS). É conhecido que a IDO participa do mecanismo de imuno escape de células tumorais, sendo relatada como marcadora de progressão tumoral. Desta forma, a inibição da atividade da IDO para a restauração da imunidade anti-tumoral do hospedeiro tem sido considerada uma estratégia para a terapêutica antineoplásica. N,N-dimetiltriptamina (DMT) e triptamina (TRY) são compostos indólicos de origem endógena, provenientes de uma rota paralela de metabolismo do triptofano - a rota das triptaminas, que ocorre principalmente no sistema nervoso central. O presente estudo teve como objetivo avaliar se DMT e TRY modulariam a atividade de IDO. Os resultados obtidos demonstraram ações inibitórias para ambos os compostos e as cinéticas enzimáticas revelaram Ki de 506µM para o DMT e de 156µM para a TRY, com perfis inibitórios característicos de inibidores não-competitivos clássicos. A atividade inibitória foi também observada sobre a enzima IDO expressa constitutivamente, ou induzida por IFN-γ, em células da linhagem de glioblastoma humano A172. Nesta mesma linhagem, em estudo paralelo do grupo, foi avaliada a influência de DMT e TRY sobre a expressão gênica da enzima IDO. Concluímos que nas células a ação inibitória dos compostos avaliados é exercida diretamente sobre sua atividade enzimática, sem redução de sua transcrição. Os resultados deste estudo também serviram como base para estudos da atividade inibitória da DMT e TRY em sistema de co-cultura das células A172 com células mononucleares humanas, onde foi observada redução significativa da atividade enzimática e da proliferação das células tumorais. Em conclusão mostramos a possibilidade de que a via das triptaminas, através de seus metabólitos, possa contribuir com a regulação endógena da via das quinureninas e que o DMT e a TRY deveriam ser avaliados como candidatos a inibidores farmacológicos da enzima IDO e/ou como protótipos para a síntese de novos inibidores. / Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) is a tryptophan-degrading enzyme via the kynurenine pathway. Increased IDO expression is largely responsible for the immune tolerance response and can be induced by IFN-γ and lipopolysaccharide (LPS). It is known that IDO participates in the mechanism of tumor immune tolerance and have been reported as a tumor progression marker. Thus, to restore the anti-tumor immunity of the host, IDO inhibition has been considered as a strategy for anticancer therapy. N, N-dimethyltryptamine (DMT) and tryptamine (TRY) are endogenous indolic compounds originated from a parallel route of tryptophan metabolism - the tryptamines route, which occurs mainly in the central nervous system. This study aimed to assess whether DMT and TRY modulate the IDO activity. The results showed inhibitory actions for both compounds and enzyme kinetics revealed Ki = 506µM to DMT and Ki = 156µM to TRY, with inhibitory profiles characteristic of classical non-competitive inhibitors. The inhibitory activity was also observed on the IDO constitutively expressed or induced by IFN-γ in A172 human glioblastom cell line. Using the same line, in parallel group study, we evaluated the influence of DMT and TRY on the IDO gene expression. We conclude that in cells the evaluated compounds inhibitory action is exerted directly on its enzymatic activity without reduction of its transcription. The results of this study also served as the basis for studies of DMT and TRY inhibitory activity in A172 cells with human mononuclear cells co-culture system, in which was observed significant reduction in enzyme activity and tumor cells proliferation. In conclusion we show the possibility that the tryptamines route, through its metabolites, may contribute to quinurenines pathway endogenous regulation and that DMT and TRY should be evaluated as IDO pharmacological inhibitors candidates and / or as prototypes to new inhibitors synthesis.

A enzima indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) é responsável pela degradação de triptofano (TRP) pela via das quinureninas. O aumento da expressão de IDO é a grande responsável pela resposta de tolerância imunológica e pode ser induzida por IFN-γ e lipopolissacarídeos (LPS). É conhecido que a IDO participa do mecanismo de imuno escape de células tumorais, sendo relatada como marcadora de progressão tumoral. Desta forma, a inibição da atividade da IDO para a restauração da imunidade anti-tumoral do hospedeiro tem sido considerada uma estratégia para a terapêutica antineoplásica. N,N-dimetiltriptamina (DMT) e triptamina (TRY) são compostos indólicos de origem endógena, provenientes de uma rota paralela de metabolismo do triptofano - a rota das triptaminas, que ocorre principalmente no sistema nervoso central. O presente estudo teve como objetivo avaliar se DMT e TRY modulariam a atividade de IDO. Os resultados obtidos demonstraram ações inibitórias para ambos os compostos e as cinéticas enzimáticas revelaram Ki de 506µM para o DMT e de 156µM para a TRY, com perfis inibitórios característicos de inibidores não-competitivos clássicos. A atividade inibitória foi também observada sobre a enzima IDO expressa constitutivamente, ou induzida por IFN-γ, em células da linhagem de glioblastoma humano A172. Nesta mesma linhagem, em estudo paralelo do grupo, foi avaliada a influência de DMT e TRY sobre a expressão gênica da enzima IDO. Concluímos que nas células a ação inibitória dos compostos avaliados é exercida diretamente sobre sua atividade enzimática, sem redução de sua transcrição. Os resultados deste estudo também serviram como base para estudos da atividade inibitória da DMT e TRY em sistema de co-cultura das células A172 com células mononucleares humanas, onde foi observada redução significativa da atividade enzimática e da proliferação das células tumorais. Em conclusão mostramos a possibilidade de que a via das triptaminas, através de seus metabólitos, possa contribuir com a regulação endógena da via das quinureninas e que o DMT e a TRY deveriam ser avaliados como candidatos a inibidores farmacológicos da enzima IDO e/ou como protótipos para a síntese de novos inibidores. / Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) is a tryptophan-degrading enzyme via the kynurenine pathway. Increased IDO expression is largely responsible for the immune tolerance response and can be induced by IFN-γ and lipopolysaccharide (LPS). It is known that IDO participates in the mechanism of tumor immune tolerance and have been reported as a tumor progression marker. Thus, to restore the anti-tumor immunity of the host, IDO inhibition has been considered as a strategy for anticancer therapy. N, N-dimethyltryptamine (DMT) and tryptamine (TRY) are endogenous indolic compounds originated from a parallel route of tryptophan metabolism - the tryptamines route, which occurs mainly in the central nervous system. This study aimed to assess whether DMT and TRY modulate the IDO activity. The results showed inhibitory actions for both compounds and enzyme kinetics revealed Ki = 506µM to DMT and Ki = 156µM to TRY, with inhibitory profiles characteristic of classical non-competitive inhibitors. The inhibitory activity was also observed on the IDO constitutively expressed or induced by IFN-γ in A172 human glioblastom cell line. Using the same line, in parallel group study, we evaluated the influence of DMT and TRY on the IDO gene expression. We conclude that in cells the evaluated compounds inhibitory action is exerted directly on its enzymatic activity without reduction of its transcription. The results of this study also served as the basis for studies of DMT and TRY inhibitory activity in A172 cells with human mononuclear cells co-culture system, in which was observed significant reduction in enzyme activity and tumor cells proliferation. In conclusion we show the possibility that the tryptamines route, through its metabolites, may contribute to quinurenines pathway endogenous regulation and that DMT and TRY should be evaluated as IDO pharmacological inhibitors candidates and / or as prototypes to new inhibitors synthesis.