Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) induit une activation généralisée des réponses de l'hôte impliquant les lymphocytes T mais aussi les cellules du microenvironnement comme les cellules endothéliales. Les microvésicules (MV) sont des vésicules extracellulaires impliquées dans la communication intercellulaire décrites comme des vecteurs de microARNs (miARNs). Dans ce travail, nous avons émis l'hypothèse que l'infection par le VIH-1 induit l'expression de miARNs dans les lymphocytes T CD4 qui peuvent être vectorisés par les MV et transférés de manière paracrine aux CE. Ces MV joueraient un rôle important dans la pathogenèse de l’infection en contrôlant à distance l'homéostasie endothéliale. Nos résultats montrent que le miR-146-5p est uprégulé à la fois dans les lymphocytes T CD4 de patients infectés par le VIH-1, naïfs de traitement et dans les MV issues de ces lymphocytes. En utilisant un modèle de MV d’une lignée lymphocytaire T enrichie en miR-146-5p (miR-146b-MV), nous montrons que ces MV sont capables de : 1) de protéger leur contenu en miARNs de la dégradation par les RNases, 2) de transférer le miR-146b-5p mimic à des HUVEC et 3) réduire la réponse inflammatoire endothéliale in vitro et in vivo, dans les poumons de souris qui ont reçu une injection systémique de miR-146b-MV. Ce transfert est responsable d’une diminution de l’expression d’ICAM-1 et VCAM-1, à travers une down-régulation d’IRAK1 et de TRAF6. L’ensemble de ces résultats montre que le miR-146-5p transféré par des MV peut diminuer les réponses inflammatoires endothéliales et constituer ainsi un mécanisme de défense de l’hôte contre les altérations vasculaires induites par le VIH-1. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) promotes a generalized activation of host responses that involves CD4 T cells, but also cells of the micro-environnement that are not directly infected such as endothelial cells. Microvesicles (MV), implicated in cell-to-cell communication, have been recently described as vectors of microRNAs (miRNAs). We hypothesized that HIV-1 infection induce cellular miRNAs expression in CD4 T cells which may be vectorized by MV and transferred in a paracrine manner to endothelial cells to regulate vascular homeostasis. Using a miRNome quantitative RT-PCR analysis, we showed that HIV-1 infection leads to a dysregulation of several miRNAs and identified miR-146b-5p as upregulated in both CD4 T cells and CD4 T cells derived-MV from antiretroviral therapy (ART)-naive HIV-1 infected patients, compared to age- and sex-matched healthy subjects. Using a CEM T cell line transfected with miR-146b-5p mimic, we demonstrated that MV from CEM overexpressing miR-146b-5p mimic (miR-146b-MV): 1/ protect their miRNA cargo from RNase degradation, 2/ transfer miR-146b-5p mimic into HUVEC, and 3/ reduce endothelial inflammatory response in vitro and in vivo, in lungs from mice injected with miR-146b-MV. This paracrine control of endothelial inflammatory response mediated by MV involved a decreased expression of NF-κB responsive molecules ICAM-1 and VCAM-1, through down-regulation of IRAK1 and TRAF6. Collectively, these findings demonstrate that miR-146b-5p transferred by MV counteract IRAK1- and TRAF6-mediated endothelial inflammatory responses in HIV-1 infection and could be considered as a host defence mechanism against HIV-1-associated vascular alterations.

L'épissage est une étape clef de la multiplication du VIH-1. Par utilisation de 4 sites donneurs et 8 sites accepteurs d'épissage, plus de 40 ARNm différents sont produits. Une approche protéomique nous a permis d'identifier de nouvelles protéines interagissant avec la région de l'ARN viral contenant le site A7. Nous avons démontré l'interaction directe avec l'ARN viral de 5 des protéines identifiées (nucléoline, hnRNP A1/B, hnRNP H et hnRNP K). Nous avons montré que hnRNP K a plusieurs sites de fixation dans la région du site A7 et que hnRNP A1et hnRNP K se lient de façon coopérative. Nous avons montré un effet inhibiteur de hnRNP K sur l'épissage au site A7. Comme la protéine hnRNP A1 est un régulateur négatif de plusieurs sites accepteurs d'épissage (A1, A2, A3, A7), nous avons testé si la protéine hnRNP K pouvait renforcer l'inhibition à ces sites. En fait, hnRNP K active l'épissage in vitro des introns entre le site donneur D1 et les sites accepteurs A1, A2 et A3. Nous avons montré que la protéine hnRNP K renforce fortement l'activité de ASF/SF2 au site A2, ce qui indique que selon le contexte, la protéine hnRNP K peut être activatrice ou inhibitrice de l'épissage du VIH-1. J'ai observé de plus que la surexpression de la protéine hnRNP K dans des cellules HeLa, transfectées avec le plasmide p PSP contenant le virus VIH-1 dépourvu de ses capacités d'encapsidation, produit un changement très marqué de l'épissage alternatif de l'ARN PSP, ce qui confirme la forte influence de hnRNP K sur l'épissage alternatif du VIH-1. L'augmentation de la concentration cellulaire de hnRNP K dans les cellules HeLa conduit aussi à une diminution de la protéine virale Nef. La protéine hnRNP K intervient donc non seulement dans la régulation du site A7, mais aussi dans celle de la majorité des sites d'épissage régulés de l'ARN du VIH. L'action de cette protéine sur plusieurs des sites d'épissage montre que la protéine hnRNP K est probablement un régulateur général de l'épissage de VIH-1 / HIV-1 pre-mRNA splicing depends upon 4 donor and 8 acceptor sites, which are used in combination to produce more than 40 different mRNAs. To further characterize nuclear factors involved in these processes, we purified RNP complexes formed by incubation of SLS2-A7 transcripts in HeLa cell nuclear extracts by affinity chromatography to identify new associated proteins. We showed that, in addition to the well known hnRNP A1 inhibitor of site A7, nucleolin, hnRNP H and hnRNP K interact directly with SLS2-A7 RNA. We demonstrated that hnRNP K has multiple binding sites in the vicinity of site A7 and that binds cooperatively to hnRNP A1 to the A7 RNA region and limits the A7 utilization in vitro. As hnRNP A1 is a negative regulator of several HIV-1 splicing sites (A1, A2, A3), we tested whether hnRNP K may also reinforce hnRNP A1 inhibition at these sites. Surprisingly, hnRNP K activated in vitro splicing of the D1-A1, D1-A2 and D1-A3 introns. Interestingly, hnRNP K was found to reinforce strongly the ASF/SF2 activity at site A2, which indicates that depending on the splicing site hnRNP K can be a splicing activator or inhibitor. To test how hnRNP K influences the relative utilization of HIV-1 splicing sites in cellulo, we used plasmid p PSP containing all the HIV-1 splicing sites and tested the effect of over-expression in HeLa cells on alternative splicing of the PSP RNA. Doubling the amount of hnRNP K in HeLa cells led to a drastic change of the PSP RNA alternative splicing, which confirms the strong influence of hnRNP K on alternative splicing. Moreover, increase of cellular concentration of hnRNP K strongly decrease the viral Nef protein production. hnRNP K protein affects A7 splicing regulation but also regulates the majority of regulated splicing sites of HIV. By extension of the study of hnRNP K effect to other HIV-1 splicing sites, we discovered that hnRNP K is a general regulator of HIV-1 splicing