Le virus de la fièvre catarrhale ovine (Bluetongue virus, BTV) est l’agent étiologique de la maladie du même nom, une arbovirose non contagieuse transmise aux ruminants domestiques et sauvages par l’intermédiaire de morsures de moucherons hématophages du genre Culicoides. Il existe actuellement 27 sérotypes décrits de BTV à travers le monde qui se distinguent par les pathologies qu’ils induisent et leur capacité à infecter et se propager chez leur(s) hôte(s) mammifère(s). Le premier objectif de mon projet de thèse visait à identifier les interactions cellulaires spécifiques des sérotypes 8 et 27 pour identifier des facteurs de pathogénicité/virulence et/ou de franchissement de barrière d’espèces. Pour atteindre cet objectif, l’ensemble des protéines virales du BTV a été criblé par la méthode du double-hybride en levure contre deux banques d’ADN complémentaires, l’une d’origine bovine et l’autre d’origine culicoïde. A l’issue de 70 cribles, une centaine de nouvelles interactions virus-hôtes a été mise en évidence et révèle un enrichissement pour quatre processus cellulaires : l’épissage des ARNm, les ribosomes, la SUMOylation et l’apoptose. Cette étude nous a ainsi permis de réaliser le premier interactome pour le BTV qui se poursuit au travers de multiples validations biochimiques et fonctionnelles des interactions identifiées. En parallèle de ce travail de protéomique, le second objectif de mon projet de thèse a été de déterminer l’impact du BTV sur la voie MAPK/ERK, une voie cellulaire essentielle à la prolifération et différenciation cellulaire et classiquement modulée lors d’infections virales. En plus de son rôle antagoniste sur la voie des interférons de type I, nous avons démontré la capacité de la protéine NS3 de BTV à activer la voie MAPK/ERK. En effet, nous avons démontré que NS3 a la capacité d’augmenter le niveau de phosphorylation des protéines kinases ERK1/2 mais également du facteur de traduction eIF4E. Cette fonction, qui semble être spécifique au BTV par rapport aux autres orbivirus, implique l’interaction de NS3 avec la protéine cellulaire BRAF, une protéine MAP3 kinase jouant un rôle majeur dans l’activation de la voie MAPK/ERK. L’activation cette voie par NS3 pourrait être un mécanisme de détournement de la traduction cellulaire au profit de celle du virus mais aussi constituer un élément de réponse pour expliquer l’hyper-inflammation observée dans le cas d’une infection par ce virus / Bluetongue virus (BTV) is the etiological agent of the bluetongue (BT) disease, a non-contagious arbovirus that affects a wide range of wild and domestic ruminants. It is transmitted by blood-feeding midges of the genus Culicoides. There are currently 27 serotypes described of BTV in the world that are distinguished by their differences in term of pathology/virulence and their capacity to infect and disseminate in their mammalian host(s). The first objective of my thesis project was to identify specific cellular interactions of serotype 8 and 27 to reveal new factors of pathogenicity/virulence and/or cross species barrier. To reach this goal, all the proteins encoded by BTV were used as baits to screen, by a high-throughput yeast two-hybrid (Y2H) approach, two complementary DNA libraries originating from hosts naturally infected by BTV : Culicoides and cattle. Therefore, 70 screens were performed to identify a hundred of new virus-host interactions and reveal an enrichment for four cellular processes : mRNA splicing, ribosomes, SUMOylation and apoptosis. This study allowed us to build the first interactome of BTV which continues through multiple biochemical and functional validations of the identified interactions. In parallel to this proteomics work, my second objective was to determine the impact of BTV on the MAPK/ERK pathway, a cellular pathway essential for cell proliferation and differentiation usually modulated during viral infections. In addition to its antagonist role on the type I interferon pathway, we have demonstrated the ability of BTV-NS3 to activate the MAPK/ERK pathway. Indeed, we have demonstrated that NS3 has the ability to increase the level of phosphorylation of ERK1/2 protein and the eIF4E translation factor. This function, which seems to be specific to BTV compared to other orbiviruses, involves the interaction of NS3 with BRAF cellular protein, a MAP3 kinase protein that plays a major role in the regulation of the MAPK/ERK pathway. These results could provide a better understanding of the molecular basis underlying the hijacking of the translation machinery to support virus replication but also constitute a hypothesis to explain the hyperinflammation observed in the BTV infection context

Bcl-xL et Mcl-1 sont deux protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 dont dépendent les cancers de l’ovaire pour leur survie, leur inhibition semble donc être une stratégie pertinente. La molécule BH3-mimétique ABT 737 (ou son analogue oral, l’ABT-263), est un puissant inhibiteur de Bcl-xL mais l’inhibition de Mcl-1 reste problématique. Les voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK régulent l’expression et l’activité de cette dernière protéine et de ses partenaires BH3-only (Bim, Puma, Noxa). Nous nous sommes donc intéressés à l’intérêt de leur inhibition pour sensibiliser les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737. La première étude menée avec le BEZ235, double inhibiteur PI3K/mTOR développé par le laboratoire Novartis, montre qu’il inhibe l’expression de Mcl-1 et induit celle de Puma, et qu’il sensibilise les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737 à condition que l’expression de Bim soit également induite. La deuxième étude a évalué les effets de l’AZD8055, inhibiteur du site actif de mTOR développé par le laboratoire AstraZeneca, et du trametinib, inhibiteur allostérique de MEK développé par le laboratoire GlaxoSmithKline et actuellement en clinique, sur trois lignées cancéreuses ovariennes. L’inhibition de l’expression de Mcl-1 et l’induction de celle de Puma par l’AZD8055 ne permettent pas de diminuer suffisamment le ratio [Mcl-1/protéines BH3-only] pour sensibiliser les cellules à l’ABT-737. En revanche, la forte induction de Bim sous forme active déphosphorylée par le trametinib permet de diminuer suffisamment ce ratio pour sensibiliser deux des trois lignées testées à l’ABT-737. C’est cependant la triple combinaison AZD8055/trametinib/ABT-737 qui est la plus efficace pour induire une apoptose massive dans les trois lignées. Par ailleurs, de façon intéressante, l’association de l’AZD8055 et du trametinib est cytotoxique sans ABT 737 dans une des lignées testées. Ces résultats mettent en évidence l’efficacité de différentes stratégies thérapeutiques multi-cibles et la nécessité de définir des marqueurs prédictifs de la réponse afin d’évoluer vers un traitement personnalisé pour améliorer la prise en charge des cancers de l’ovaire. / Ovarian cancers depend on Bcl-xL and Mcl-1, two anti-apoptotic protein of the Bcl-2 family, for their survival and their inhibition seems to by a relevant strategy. The BH3-mimetic molecule ABT-737 (or its oral form, ABT-263), is a strong Bcl-xL inhibitor, but Mcl-1 inhibition remains problematic. Signaling pathways PI3K/Akt/mTOR and MAPK/ERK regulate expression and activity of Mcl-1 and its BH3-only partners (Bim, Puma, Noxa). We focused on the interest of their inhibition to sensitize ovarian cancer cells to ABT-737. The first study with BEZ235, a PI3K/mTOR dual inhibitor developed by Novartis, inhibits Mcl-1 expression and induces the one of Puma, and sensitizes ovarian cancer cells to ABT-737 provided that Bim expression is induced. The second study evaluated the effects of AZD8055, mTOR active site inhibitor developed by AstraZeneca, and of trametinib, MEK allosteric inhibitor developed by GlaxoSmithKline and currently in clinic, on three ovarian cancer cell lines. Mcl-1 expression inhibition and Puma expression induction by AZD8055 does not sufficiently reduce [Mcl-1/BH3-only proteins] ratio to sensitize cells to ABT-737. On the other hand, strong Bim induction in its active dephosphorylated form by trametinib sufficiently reduce this ratio to sensitize two of the three cell lines tested to ABT-737. Nevertheless, the triple combination AZD8055/trametinib/ABT-737 is the most efficient to induce massive apoptosis in the three cell lines. Besides, interestingly, AZD8055 and trametinib association is cytotoxic without ABT-737 in one of the tested cell lines. These results highlight the efficacy of different multi-targets therapeutic strategies and the need of predictive marker definition of the response to develop personalized treatment and to improve ovarian cancer management.