La progression tumorale est la conséquence de multiples altérations génotypiques et phénotypiques; L’une d’entre elles, nécessaire à la formation de métastases, est l’acquisition d’une résistance à l’anoïkis, forme d’apoptose induite par la perte d’attachement à la matrice extra-cellulaire. Afin d’étudier l’anoïkis, nous avons utilisé deux lignées colorectales humaines isogéniques : la lignée SW480 dérivée de la tumeur primaire et sensible à l’anoïkis et la lignée SW620 dérivée d’une métastase ganglionnaire de cette même tumeur et résistante à l’anoïkis. Nous avons établi que dans les cellules SW480, l’anoïkis est une forme d’apoptose intrinsèque c'est-à-dire débutant à la mitochondrie et donc sous le contrôle des protéines de la famille Bcl-2. Parmi celles-ci, nous avons trouvé que seule la protéine proapoptotique à BH3-seul Bim était régulée différemment dans les deux lignées : tandis que son expression augmente de manière très significative dans les cellules SW480 cultivées en suspension, elle n’augmente que très peu dans les cellules SW620. De manière très intéressante, et malgré cette différence, les deux lignées se sont montrées être sensibles au BH3-mimétique ABT-737 mais seulement lorsqu’elles sont cultivées en suspension. Ces résultats indiquent que, qu’elles soient sensibles ou non à l’anoïkis, les cellules détachées sont « prédisposées à la mort » et que des composés semblables à l’ABT-737 tels que le Navitoclax ou l’ABT-199 pourraient avoir des propriétés anti-métastiques dans les tumeurs solides. Dans la seconde partie de ce travail, nous montrons que la protéine transmembranaire CDCP1 ( CUB Domain Containing Protein 1) semble nécessaire mais non suffisante pour protéger ces cellules contre l’anoïkis. CDCP1 est un substrat de Src mais sa phosphorylation sur tyrosine n’est pas impliquée dans cette protection. Finalement, nous avons identifié deux nouvelles protéines qui interagissent avec CDCP1 : l’ITGB4 et l’EphA2 / Tumour progression is the consequence of multiple genotypic and phenotypic alterations. One of these, necessary for the formation of metastasis, is acquisition of a resistance to anoïkis, a form of apoptosis triggered by loss of attachment to the extra-cellular matrix. In order to study anoïkis, we used two isogenic human colon cell lines : SW480 cells derived from the primary tumour and sensitive to anoïkis, and SW620 cells derived from a lymph node metastasis in the same patient which are resistant to anoikis. We found that anoikis signaling in SW480 cells is a form of intrinsic apoptosis thus starting at the mitochondria and under the control of Bcl-2 family proteins. Among the members of this family, the BH3-only proapoptotic protein Bim was the only one that we found to be differentially regulated between the two cell lines: whereas Bim expression augments strongly during the culture in suspension of SW480, it only slightly does so in SW620 cells. Most interestingly, despite this difference, both cell lines turned to be sensisitive to the BH3-mimetic ABT-737 but only when they are in suspension. This shows that, whether or not they a sensitive to anoikis, detached colon cancer cells are “primed for death” and thus that ABT-737 related compounds such as Navitoclax or ABT-199 might have anti-metastatic properties in solid tumours. In the second part of this work, we show that the transmembrane protein CDCP1 (CUB Domain Containing Protein 1) appears be necessary but not sufficient to protect these cells against anoïkis. CDCP1 is a Src substrate but its tyrosine phosphorylation is not involved in this protection. Finally, we have identified two new proteins interacting with CDCP1: ITGB4 and EphA2.

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Résumé en français : Notre équipe étudie les mécanismes de l’apoptose induite par la nutline-3, une molécule capable de se fixer sur MDM2 et d’activer la p53, dans différents types de lymphomes associés au virus d’Epstein-Barr (EBV) comme le lymphome de Burkitt (LB) ou syndromes lymphoprolifératifs post-transplantation (PTLD). Nos résultats montrent que la nutline-3 induit l’apoptose des cellules de LB EBV (-) alors que les cellules EBV (+) en latence de type III sont résistantes. Mon travail de thèse a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans ce phénomène de résistance afin de mettre en place des stratégies pour les contourner. Une première étude initiée par les résultats d’une analyse transcriptomique, effectuée après traitement avec la nutline-3 de deux lignées qui ne diffèrent que par leur statut EBV, nous a permis de montrer que : 1) l’autophagie est induite en réponse au traitement dans les cellules EBV (+) en latence de type III ; 2) ces cellules expriment fortement Bécline-1 et présentent une activation constitutive de l’autophagie ; 3) l’autophagie contribue à la résistance de ces cellules à l’apoptose. Par ailleurs, nos résultats indiquent que la protéine anti-apoptotique Bcl-2 est également impliquée dans la résistance de ces cellules et que l’utilisation d’ABT-737, un inhibiteur de Bcl-2, restaure leur sensibilité à la nutline-3. L’efficacité de ce composé a donc été évaluée in vivo, seul ou en combinaison avec des traitements conventionnels (Cyclophosphamide pour le LB et Rituximab pour les PTLD). Les résultats obtenus lors de ces études pré-cliniques montrent que : 1) ABT-737 réduit considérablement la croissance tumorale et augmente la survie de souris xénogreffées avec des cellules d’une lignée lymphoblastoïde (LCL, utilisées comme modèle pour les PTLD) alors qu’il n’a pas d’effets chez les souris xénogreffées avec une lignée de LB ; 2) la combinaison BT-737/Cyclophosphamide permet de limiter la croissance tumorale durant le traitement mais n’améliore pas la survie des souris xénogreffées avec une lignée de LB ; 3) l’association ABT-737/Rituximab est très efficace et induit une rémission complète chez 70% des souris xénogreffées avec la lignée de LCL / - Résumé en anglais : Our team is working on the mechanisms of apoptosis induced by nutlin-3, a small molecule which binds to MDM2 and activates p53, in different lymphomas associated with Epstein-Barr virus such as Burkitt lymphoma (BL) or Post-transplant lymphoproliferative disorder (PTLD). Our results show that nutlin-3 strongly induce apoptosis in EBV (-) cells whereas EBV (+) latency III cells are much more resistant. The aim of my PhD project was to study the mechanisms involved in the resistance of EBV (+) latency III cells to apoptosis and to develop new therapeutic strategies to bypass these mechanisms. A transcriptomic analysis was realized after treatment with nutlin-3 of two cell lines which only differs by their EBV status. Based on the results obtained, a study was performed which allow us to show that: 1) autophagy is induced after nutlin-3 treatment in EBV (+) latency III cells; 2) these cells strongly expressed beclin-1 and present a constitutively high level of autophagy; 3) autophagy is involved in the resistance of apoptosis observed in these cells. Furthermore, our results demonstrate that Bcl-2 also contributes to the resistance of EBV (+) latency III cells and that treatment with ABT-737, a Bcl-2 inhibitor, restores their susceptibility to nutlin-3 treatment. We thus assessed the efficiency of this compound in vivo, in monotherapy or associated with conventional treatments (Cyclophosphamide for BL and Rituximab for PTLD). Results obtained during these pre-clinical studies show that: 1) ABT-737 reduces tumor growth and increase the overall survival of mice xenografted with a lymphoblastoïd cell line (LCL, used as a model for PTLD studies) but has no effects on mice xenografed with BL cell lines; 2) the association ABT-737/Cyclophosphamide reduces tumor growth during treatment but doesn’t improve the overall survival of mice xenografed with BL cell lines; 3) the association ABT-737/Rituximab is very efficient and induces 70% of complete remission in mice xenografted with LCL.

Les cancers des voies aéro-digestives supérieures (VADS) sont des cancers de mauvais pronostic avec 50% de rechute des patients dans les deux ans qui suivent leur traitement. La surexpression des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 est un des marqueurs corrélés avec la résistance aux divers traitements. L’objectif de ce travail a été d’évaluer l’efficacité d’une approche thérapeutique associant l’irradiation à un inhibiteur des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, l’ABT-737 (Laboratoires Abbott), ceci à la fois sur des lignées issues de cancers de VADS, mais également sur une sous-population de cellules souches cancéreuses (CSC).La première partie de ce travail a démontré que cette association thérapeutique provoque une radio-sensibilisation des lignées cellulaires étudiées in vitro, avec augmentation de la mort cellulaire par apoptose. Cet effet synergique fait intervenir la mitochondrie, module le métabolisme des céramides et modifie l’expression de certaines protéines de la famille Bcl-2 dont l’équilibre est déterminant dans la destinée de la cellule cancéreuse. De plus, le traitement par l’ABT-737 permet de ralentir très sensiblement la croissance tumorale après irradiation sur un modèle in vivo.La deuxième partie de ce travail a permis de révéler une efficacité cytotoxique encore plus importante de l’ABT-737 sur une sous-population de CSC, résistante à l’apoptose, proliférante et tumorigène, dont le rôle dans la résistance aux divers traitements fait l’objet de nombreux travaux. A cette efficacité cytotoxique s’ajoute une diminution de la migration et de l’invasion des CSC, effet très prometteur dans la lutte contre la récidive locale et la dissémination métastatique, caractéristiques des cancers de VADS de haut grade / Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) are frequently characterized by chemotherapy and radiation resistance and 5-year survival rates have lingered around 50% for several decades. The frequent resistance of HNSCC is due, in large part, to aberrant inhibition of apoptosis and overexpression of antiapoptotic members of the Bcl-2 protein family. The aim of this study was to examine, in association with radiation, the impact of ABT-737, a potent small-molecule inhibitor of Bcl-XL and Bcl-2, on HNSCC cells and cancer stem cells (CSC).The first part of our work demonstrated that ABT-737 strongly synergized with radiotherapy to promote HNSCC cell death and loss of clonogenic survival. This effect involves mitochondrial damage, modulates ceramide metabolism and modify the expression of some proteins of the Bcl-2 family whose interactions with other family members determine cell fate. Moreover, we found that this combination is able to significantly slow tumor growth.The second part of our work revealed that ABT-737, even without radiation, had a preferential cytotoxic activity in vitro towards CSC. Thus, as CSC have a greater capacity for tumor relapse, increased motility and invasiveness, our data suggest that ABT-737 could effectively complement a first line of therapy with chemotherapy or radiotherapy in order to target residual quiescent HNSCC CSC

Bcl-2 family members are important regulators of apoptosis, and their tampered expression is often involved in oncogenesis. Of particular importance are the levels of Bcl-2 family members in forming lymphomas. We studied two groups of murine thymic T cell lymphomas derived from either Bcl-2 or Bax overexpression in order to predict their sensitivity and resistance to treatments. While the growth rate and histological characteristics were similar for both lymphoma groups, Bax-derived lymphomas failed to undergo cell cycle arrest following radiation treatment and had frequent p53 mutations. In contrast, Bcl-2-derived lymphomas often halted proliferation following radiation delivery and rarely had p53 mutations. Bax-derived lymphomas were uniformly sensitive to treatment with 2-deoxy-D-glucose (2DG) while all Bcl-2-derived lymphomas were resistant. This led us to hypothesize that the Bcl-2 family is involved in 2DG-induced cell death. Focusing on the mechanism of 2DG toxicity in Bax-derived lymphomas, our studies demonstrate the following: cell death involved the activation of proapoptotic Bax, was effectively blocked by anti-apoptotic Bcl-2, and was mediated, at least in part, by the BH3-only family member Bim. Based on these results, we explored whether a BH3 mimetic (ABT-737) could sensitize lymphomas to 2DG killing. Indeed, a combination of ABT-737 with 2DG enhanced killing in Bax-derived lymphomas and resensitized Bcl-2-overexpressing lymphomas to 2DG. Since both 2DG and BH3 mimetics are currently in clinical trials, understanding their killing mechanisms and optimal combinations are of potential clinical significance. The work in this dissertation demonstrates a novel role of Bcl-2 family member proteins in regulating 2DG toxicity and may predict response to 2DG treatment. The information found presents a new strategy of combining 2DG with BH3 mimetics to improve existing lymphoma therapies.

Notre équipe étudie les mécanismes de l'apoptose induite par la nutline-3, une molécule capable de se fixer sur MDM2 et d'activer la p53, dans différents types de lymphomes associés au virus d'Epstein-Barr (EBV) comme le lymphome de Burkitt (LB) ou syndromes lymphoprolifératifs post-transplantation (PTLD). Nos résultats montrent que la nutline-3 induit l'apoptose des cellules de LB EBV (-) alors que les cellules EBV (+) en latence de type III sont résistantes. Mon travail de thèse a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans ce phénomène de résistance afin de mettre en place des stratégies pour les contourner. Une première étude initiée par les résultats d'une analyse transcriptomique, effectuée après traitement avec la nutline-3 de deux lignées qui ne diffèrent que par leur statut EBV, nous a permis de montrer que : 1) l'autophagie est induite en réponse au traitement dans les cellules EBV (+) en latence de type III ; 2) ces cellules expriment fortement Bécline-1 et présentent une activation constitutive de l'autophagie ; 3) l'autophagie contribue à la résistance de ces cellules à l'apoptose. Par ailleurs, nos résultats indiquent que la protéine anti-apoptotique Bcl-2 est également impliquée dans la résistance de ces cellules et que l'utilisation d'ABT-737, un inhibiteur de Bcl-2, restaure leur sensibilité à la nutline-3. L'efficacité de ce composé a donc été évaluée in vivo, seul ou en combinaison avec des traitements conventionnels (Cyclophosphamide pour le LB et Rituximab pour les PTLD). Les résultats obtenus lors de ces études pré-cliniques montrent que : 1) ABT-737 réduit considérablement la croissance tumorale et augmente la survie de souris xénogreffées avec des cellules d'une lignée lymphoblastoïde (LCL, utilisées comme modèle pour les PTLD) alors qu'il n'a pas d'effets chez les souris xénogreffées avec une lignée de LB ; 2) la combinaison BT-737/Cyclophosphamide permet de limiter la croissance tumorale durant le traitement mais n'améliore pas la survie des souris xénogreffées avec une lignée de LB ; 3) l'association ABT-737/Rituximab est très efficace et induit une rémission complète chez 70% des souris xénogreffées avec la lignée de LCL

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La progression tumorale est la conséquence de multiples altérations génotypiques et phénotypiques; L'une d'entre elles, nécessaire à la formation de métastases, est l'acquisition d'une résistance à l'anoïkis, forme d'apoptose induite par la perte d'attachement à la matrice extra-cellulaire. Afin d'étudier l'anoïkis, nous avons utilisé deux lignées colorectales humaines isogéniques : la lignée SW480 dérivée de la tumeur primaire et sensible à l'anoïkis et la lignée SW620 dérivée d'une métastase ganglionnaire de cette même tumeur et résistante à l'anoïkis. Nous avons établi que dans les cellules SW480, l'anoïkis est une forme d'apoptose intrinsèque c'est-à-dire débutant à la mitochondrie et donc sous le contrôle des protéines de la famille Bcl-2. Parmi celles-ci, nous avons trouvé que seule la protéine proapoptotique à BH3-seul Bim était régulée différemment dans les deux lignées : tandis que son expression augmente de manière très significative dans les cellules SW480 cultivées en suspension, elle n'augmente que très peu dans les cellules SW620. De manière très intéressante, et malgré cette différence, les deux lignées se sont montrées être sensibles au BH3-mimétique ABT-737 mais seulement lorsqu'elles sont cultivées en suspension. Ces résultats indiquent que, qu'elles soient sensibles ou non à l'anoïkis, les cellules détachées sont " prédisposées à la mort " et que des composés semblables à l'ABT-737 tels que le Navitoclax ou l'ABT-199 pourraient avoir des propriétés anti-métastiques dans les tumeurs solides. Dans la seconde partie de ce travail, nous montrons que la protéine transmembranaire CDCP1 ( CUB Domain Containing Protein 1) semble nécessaire mais non suffisante pour protéger ces cellules contre l'anoïkis. CDCP1 est un substrat de Src mais sa phosphorylation sur tyrosine n'est pas impliquée dans cette protection. Finalement, nous avons identifié deux nouvelles protéines qui interagissent avec CDCP1 : l'ITGB4 et l'EphA2

Bcl-xL et Mcl-1 sont deux protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 dont dépendent les cancers de l’ovaire pour leur survie, leur inhibition semble donc être une stratégie pertinente. La molécule BH3-mimétique ABT 737 (ou son analogue oral, l’ABT-263), est un puissant inhibiteur de Bcl-xL mais l’inhibition de Mcl-1 reste problématique. Les voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK régulent l’expression et l’activité de cette dernière protéine et de ses partenaires BH3-only (Bim, Puma, Noxa). Nous nous sommes donc intéressés à l’intérêt de leur inhibition pour sensibiliser les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737. La première étude menée avec le BEZ235, double inhibiteur PI3K/mTOR développé par le laboratoire Novartis, montre qu’il inhibe l’expression de Mcl-1 et induit celle de Puma, et qu’il sensibilise les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737 à condition que l’expression de Bim soit également induite. La deuxième étude a évalué les effets de l’AZD8055, inhibiteur du site actif de mTOR développé par le laboratoire AstraZeneca, et du trametinib, inhibiteur allostérique de MEK développé par le laboratoire GlaxoSmithKline et actuellement en clinique, sur trois lignées cancéreuses ovariennes. L’inhibition de l’expression de Mcl-1 et l’induction de celle de Puma par l’AZD8055 ne permettent pas de diminuer suffisamment le ratio [Mcl-1/protéines BH3-only] pour sensibiliser les cellules à l’ABT-737. En revanche, la forte induction de Bim sous forme active déphosphorylée par le trametinib permet de diminuer suffisamment ce ratio pour sensibiliser deux des trois lignées testées à l’ABT-737. C’est cependant la triple combinaison AZD8055/trametinib/ABT-737 qui est la plus efficace pour induire une apoptose massive dans les trois lignées. Par ailleurs, de façon intéressante, l’association de l’AZD8055 et du trametinib est cytotoxique sans ABT 737 dans une des lignées testées. Ces résultats mettent en évidence l’efficacité de différentes stratégies thérapeutiques multi-cibles et la nécessité de définir des marqueurs prédictifs de la réponse afin d’évoluer vers un traitement personnalisé pour améliorer la prise en charge des cancers de l’ovaire. / Ovarian cancers depend on Bcl-xL and Mcl-1, two anti-apoptotic protein of the Bcl-2 family, for their survival and their inhibition seems to by a relevant strategy. The BH3-mimetic molecule ABT-737 (or its oral form, ABT-263), is a strong Bcl-xL inhibitor, but Mcl-1 inhibition remains problematic. Signaling pathways PI3K/Akt/mTOR and MAPK/ERK regulate expression and activity of Mcl-1 and its BH3-only partners (Bim, Puma, Noxa). We focused on the interest of their inhibition to sensitize ovarian cancer cells to ABT-737. The first study with BEZ235, a PI3K/mTOR dual inhibitor developed by Novartis, inhibits Mcl-1 expression and induces the one of Puma, and sensitizes ovarian cancer cells to ABT-737 provided that Bim expression is induced. The second study evaluated the effects of AZD8055, mTOR active site inhibitor developed by AstraZeneca, and of trametinib, MEK allosteric inhibitor developed by GlaxoSmithKline and currently in clinic, on three ovarian cancer cell lines. Mcl-1 expression inhibition and Puma expression induction by AZD8055 does not sufficiently reduce [Mcl-1/BH3-only proteins] ratio to sensitize cells to ABT-737. On the other hand, strong Bim induction in its active dephosphorylated form by trametinib sufficiently reduce this ratio to sensitize two of the three cell lines tested to ABT-737. Nevertheless, the triple combination AZD8055/trametinib/ABT-737 is the most efficient to induce massive apoptosis in the three cell lines. Besides, interestingly, AZD8055 and trametinib association is cytotoxic without ABT-737 in one of the tested cell lines. These results highlight the efficacy of different multi-targets therapeutic strategies and the need of predictive marker definition of the response to develop personalized treatment and to improve ovarian cancer management.

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