Der ABC-Transporter ABCA1 ist unmittelbar in die zelluläre Lipidhomeostasie einbezogen, in dem er die Freisetzung von Cholesterol an plasmatische Rezeptoren, wie ApoA-I, vermittelt. Trotz intensiver Untersuchungen ist dieser molekulare Mechanismus nicht verstanden. Verschiedene Studien deuten daraufhin, dass durch die Aktivität von ABCA1 bedingte Veränderungen in der Lipidphase der äußeren Hälfte der Plasmamembran (PM) wichtig für die Freisetzung des Cholesterols sind. In der vorliegenden Arbeit wird die Lipidumgebung von ABCA1 in der PM lebender Säugetierzellen unter Anwendung der Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie von fluoreszierenden Lipidsonden untersucht. Es wurde eine breite Verteilung der Fluoreszenzlebenszeiten der Sonden gefunden, die sensitiv gegenüber Veränderungen der lateralen und transversalen Organisation der Lipide ist. Im Einklang mit Studien an riesengroßen unilamellaren Vesikeln und Plasmamembranvesikeln weisen unsere Ergebnisse die Existenz einer größeren Vielfalt submikroskopischer Lipiddomänen auf. Die FLIM-Untersuchungen an ABCA1 exprimierenden HeLa-Zellen weisen eine die Lipidphase destabilisierende Funktion des Transportes aus. Dieses wurde unterstützt durch die Lipidanalyse von Fraktionen der PM. Auf der Basis unserer Untersuchungen und früheren Daten stellen wir die Hypothese auf, dass die Exponierung von Phosphatidylserin (PS) auf der Zelloberfläche ein zentrales Ereignis der ABCA1 bedingten Veränderungen ist. Allerdings zeigen vergleichende Studien an ABCA7 exprimierenden Zellen, dass dies nicht ausreicht, um die ABCA1 verursachten Veränderungen in der Lipidpackung der PM zu erklären. Unsere Ergebnisse beweisen, dass die Fähigkeit von ABCA1, den Cholesterolefflux zu vermitteln, auf durch den Transporter bedingte Veränderungen in der LP der PM zurückzuführen sind, die unabhängig von der Bindung von ApoA-1 sind und dieser vorausgehen. Diese Veränderungen sind notwendig für die Lipidierung von ApoA-1 und der Generierung von HDL-Partikeln. / The ABCA1 transporter organizes cellular lipid homeostasis by promoting the release of cholesterol to plasmatic acceptors such as ApoA-I. Despite intensive investigation, the molecular mechanism of such a process has not yet been clarified. In the present study we report on the analysis of the ABCA1 lipid microenvironment at the plasma membrane of living cells, by a novel approach based on fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). In the plasma membrane of mammalian cells, a broad fluorescence lifetime distribution sensitive to treatments interfering with the membrane lateral and transbilayer organization was found. In agreement with investigations in giant unilamellar vesicles and giant plasma membrane vesicles, our results are consistent with the existence of a large variety of submicroscopic lipid domains. Based on that, FLIM in HeLa cells expressing ABCA1 revealed the destabilizing function of the transporter on the lipid arrangement at the membrane, indicating that lipid packing was a primary target of ABCA1 activity. This was corroborated by the analysis of plasma membrane fractions isolated by density fractionation. On the basis of our analysis and previous data, we speculate that the exposure of phosphatidylserine on the cell surface is a central event for ABCA1-dependent modifications. However, a comparative study of cells expressing ABCA7, the member of the ABCA subfamily with the highest homology to ABCA1, revealed that exposure of PS alone cannot account for the detected effects. Collectively, our data suggest that the ability of ABCA1 to promote cholesterol efflux is independent and precedes its actual binding to ApoA-I. Rather, ABCA1-induced plasma membrane modifications are necessary for the lipidation of ApoA-I and the generation of high density lipoprotein particles.

Lipidmembranen ermöglichen die räumliche Anordnung von Biomolekülen. Einerseits repräsentieren Lipidvesikel Kompartimente zur Aufrechterhaltung chemischer Milieus und dienen der Verkapselung verschiedenster Substanzen. Anderseits stellen inhomogene Membranen Matrizen für eine laterale Organisation von Membrankomponenten dar. In der vorliegenden Arbeit wurden lipophile Nukleinsäuren zum Aufbau kompartimentalisierter Strukturen auf der Basis von Lipidmembranen benutzt, erstens, für die geordnete, dreidimensionale Assemblierung von Vesikeln, zweitens, für eine spezifische Funktionalisierung inhomogener Lipidmembranen. Definierte Schichten stabiler Lipidvesikel wurden auf „layer-by-layer“ beschichteten Silikapartikeln angeordnet. Mit Hilfe einer optischen Pinzette wurde der gerichtete Transport der mit Vesikeln beschichteten Partikel demonstriert. Moleküle konnten in den Vesikeln verkapselt und bei Bedarf vor Ort freigesetzt werden. Zudem wurde die kontrollierte Fusion der immobilisierten Veskel gezeigt, die eine Durchmischung von verschiedenen Membrankomponenten zur Folge hatte. Lipophile Nukleinsäuren wurden in die Membranen von lipiddomänenbildenden Vesikeln inkorporiert. Cholesterolbasierte DNS verteilte sich hierbei homogen über die gesamte Membran. Palmitoylierte Peptid-Nukleinsäure konzentrierte sich hingegen in der flüssig-geordneten Phase von flüssig-flüssig phasenseparierten Membranen, welche sogenannten Lipid Rafts in Zellmembranen ähnelt. Mittels der palmitoylierten Peptid-Nukleinsäure und tocopherolmodifizierter DNS wurden lateral inhomogene Membranen domänenspezifisch funktionalisiert. Beide Konstrukte konnten temperaturabhängig vermischt und separiert werden. / Lipid membranes are versatile tools for the spatial organization of biomolecules. On one hand, lipid vesicles represent enclosed compartments to maintain chemical environments and allow the efficient entrapment of substances. On the other hand, lateral inhomogeneous membranes provide the two dimensional sorting of membrane-bound compounds. In this work, lipophilic nucleic acids were used to build multicompartment systems based on lipid membranes by the controlled assembly of vesicles and the domain specific functionalization of inhomogeneous membranes. Three dimensional architectures of vesicles were formed by the sequential assembly of vesicles on layer-by-layer coated particles. Upon binding of the vesicles to the particles the vesicles remained stable – they did not fuse neither became leaky. Molecules could be entrapped inside the vesicles and released on demand. It was shown that the vesicles assembled on a particle can be transported to a defined destiny using an optical tweezer. Thus, the targeted delivery and the release of encapsulated molecules on site was achieved. It was also shown that vesicles immobilized on the particles can be fused by remote control, resulting in a mixing of membrane associated compounds. Different lipophilic nucleic acids were arranged in two dimensional patterns by incorporation into domain-forming vesicles. Cholesterol-modified DNA revealed an equal distribution to both domains in liquid-liquid phase-separated membranes, whereas palmitoylated peptide nucleic acid partitioned into the liquid-ordered domain, which resembles lipid rafts of cellular membranes. Using the palmitoylated peptide nucleic acid and tocopherol-modified DNA both domains of liquid-liquid phase-separated vesicles were functionalized with different DNA recognitions sites. Both constructs could be mixed and separated by temperature control.