Angeborene lymphatische Zellen (ILC) sind wichtige Effektorzellen der angeborenen Immunantwort, deren Entwicklung und Aktivierungswege attraktive therapeutische Ziele darstellen. Sie bestehen aus ILC der Gruppe 1 (Natürliche Killerzellen (NK) und ILC1), ILC2 und ILC3. Neben T-Zellen leisten ILCs einen entscheidenen Beitrag zu den Typ-1-, Typ-2- und Typ-3-Immunantworten. Die Entwicklung von ILCs beim Menschen wurde jedoch noch nicht systematisch untersucht, und frühere in vitro Untersuchungen stützten sich auf die Analyse einiger weniger Marker oder Zytokine, die für die Bestimmung der Identität der verschiedenen ILC-Linien suboptimal sind. Um diese Mängel zu beheben, stellen wir hier eine Plattform vor, die zuverlässig alle menschlichen ILC-Linien aus CD34+ CD45RA+ hämatopoetischen Vorläuferzellen, gewonnen aus Nabelschnurblut und Knochenmark, erzeugt. Mit einem systematischen Ansatz zeigt diese Arbeit, dass eine einzige Kulturbedingung nicht ausreicht, um alle ILC-Untergruppen zu generieren, sondern stattdessen bestimmte Kombinationen von Zytokinen und Notch-Signalen für die Entscheidung über das Schicksal der Linien wesentlich ist. Eine umfangreiche Analyse des Transkriptoms ergab, dass der Erwerb von CD161 robust eine globale ILC-Signatur identifiziert und in vitro ILCs von T-Zell-Signaturen trennt. Die Identität spezifischer in vitro generierter ILC-Linien (NK-Zellen und ILC1, ILC2 und ILC3) wurde durch Proteinexpression, funktionelle Assays und Transkriptomanalysen auf globaler sowie auf Einzelzellebene umfassend validiert. Diese in vitro erzeugten ILC-Linien rekapitulieren die Signaturen und Funktionen ihrer ex vivo isolierten ILC-Pendants. Des Weiteren, behandeln diese Daten die Einschränkungen der Unterscheidung von menschlichen NK Zellen und ILC1 sowohl in vitro als auch ex vivo an. Darüber hinaus löst diese Plattform gängige Probleme bei der Untersuchung menschlicher ILCs, wie z. B. unzureichende Zellzahlen oder die mangelnde Verfügbarkeit von Gewebeproben. Insgesamt stellt diese Arbeit eine Ressource dar, die nicht nur zur Klärung der Biologie und Differenzierung menschlicher ILCs beiträgt, sondern auch als wichtiges Instrument zur Untersuchung der Dysregulation von ILC-Funktionen dient, die bei verschiedenen entzündlichen Erkrankungen des Menschen eine Rolle spielen. / Innate lymphoid cells (ILCs) are critical effectors of innate immunity and inflammation that consist of Group 1 ILCs (natural killer (NK) cells and ILC1), ILC2, and ILC3. As tissue resident lymphocytes, they play a crucial role type 1, type 2 and type 3 immune responses, respectively. Importantly, dysregulated ILC populations have been linked to the pathogenesis of a variety of chronic inflammatory diseases and thus represent attractive therapeutic targets with a potential for autologous cell therapies. However, human ILC generation has not been systematically explored, and previous in vitro investigations have relied on the analysis of few markers or cytokines, which are suboptimal to assign lineage identity and full functional capacity. To address these faults, we present here an effective in vitro platform, which reliably generates the core human ILC lineages from CD34+ CD45RA+ hematopoietic progenitors derived from cord blood and bone marrow. With a systematic approach, this work shows that a single culture condition is insufficient to generate all ILC subsets, and instead, distinct combinations of cytokines and Notch signaling are essential for lineage fate making decisions. In depth transcriptomic analysis revealed that acquisition of CD161 robustly identifies a global ILC signature and separates them from T cell signatures in vitro. The identity of specific ILC subsets, (NK cells and ILC1, ILC2, and ILC3) generated in vitro was validated extensively by protein expression, functional assays, and both global and single-cell transcriptome analysis. These in vitro generated ILC subsets recapitulate the signatures and functions of their ex vivo ILC counterparts. Finally, these data shed light on the limitations in untying the identity of human NK cells and ILC1 in vitro, similarly correlating to lineage identification difficulties ex vivo. Additionally, this platform tackles common problems in human ILC studies such as insufficient cell numbers and scarce availability of tissue samples. Altogether, this work presents a resource not only to aid in clarifying human ILC biology and differentiation, but also to serve as an important tool to study dysregulation of ILC functions, which have been implied in various inflammatory diseases in humans.

Die Selektion klonal expandierender Zellen mit einzigartigen, somatisch rekombinierten Anti-gen-Rezeptoren und die Langlebigkeit der daraus hervorgehenden Gedächtniszellen sind definierende Eigenschaften adaptiver Immunität. Dahingegen ist das angeborene Immunsystem da-rauf programmiert, mittels einer breiten Palette konservierter Rezeptoren möglichst schnell auf Pathogene zu reagieren und wird dabei auf Populationsebene epigenetisch geprägt. In dieser Arbeit möchte ich dieses Paradigma auf der Basis von Natürlichem Killer (NK) Zell-Gedächtnis an das humane Zytomegalievirus (HCMV) als Beispiel für Pathogen-spezifische Anpassung innerhalb des angeborenen Immunsystems herausfordern. Indem wir multiparametrische Einzel-zellanalysen zur Kartierung von ex vivo NK Zellen mit endogenen Barcodes in Form von soma-tischen Mutationen in mitochondrialer DNA (mtDNA) verknüpfen, können wir drastische klonale Expansionen adaptiver NK Zellen in HCMV+ Spendern nachweisen. NK-Zell-Klonotypen waren durch eine ihnen gemeinsame, inflammatorische Gedächtnissignatur mit AP1 Motiven gekennzeichnet, die eine Reihe einzigartiger Chromatin-Regionen mit Klon-spezifischer Zugänglichkeit überlagerte. NK-Zell-Klone wurden über einen Zeitraum von bis zu 19 Monaten stabil aufrechterhalten und behielten dabei ihre charakteristischen, Klon-spezifischen epigenetischen Signaturen, was die entscheidende Rolle klonaler Vererbung von Chromatin-Zugänglichkeit für die Prägung des epigenetischen Gedächtnis-Repertoires unterstreicht. Insgesamt identifiziert diese Arbeit zum ersten Mal klonale Expansion und Persistenz innerhalb des angeborenen Immunsystems im Menschen und deutet daraufhin, dass diese zentralen Mechanismen zur Ausbildung von immunologischem Gedächtnis evolutionär unabhängig von diversifizierten Antigen-Rezeptoren entstanden sind. / A hallmark of adaptive immunity is the clonal selection and expansion of cells with somatically diversified receptors and their long-term maintenance as memory cells. The innate immune system, in contrast, is wired to rapidly respond to pathogens via a broad set of germline-encoded receptors, acquiring epigenetic imprinting at the population level. The presented work challenges this paradigm by studying Natural Killer (NK) cell memory to human Cytomegalovirus (HCMV) infection as an example of pathogen-specific adaptation within the innate immune system. Leveraging single-cell multi-omic maps of ex vivo NK cells and somatic mitochondrial DNA (mtDNA) mutations as endogenous barcodes, we reveal drastic clonal expansions of adaptive NK cells in HCMV+ individuals. NK cell clonotypes were characterized by a convergent inflammatory memory signature driven by AP1 transcription factor activity, superimposed on a private set of clone-specific accessible chromatin regions. Strikingly, NK cell clones were stably maintained in their specific epigenetic states for up to 19 months, revealing that clonal inheritance of chromatin accessibility shapes the epigenetic memory repertoire. Together, this work presents the first identification of clonal expansion and persistence within the human innate immune system, suggesting these central mechanisms of immune memory have evolved independently of antigen-receptor diversification.