The effects of natural preconditioning (source wood), wood species, and previous exposure of wood to two types of fungi on the feeding rates and protozoa survival in the Pacific dampwood termite Zootermopsis angusticollis (Isoptera: Termospidae) were examined under laboratory conditions. Termites were exposed to four wood species that had been treated previously with a non-wood decay fungus or a wood decay fungus for various lengths of time, or were untreated. Termite feeding was measured in forced feeding and choice feeding tests, after which two types of gut protozoa (Trichomitopsis spp. and Trichonympha spp.) were counted. Wood species and previous fungal exposure both affected consumption rates and protozoa numbers in Z. angusticollis. The results indicated that pre-conditioning did not affect the amount of wood consumed or protozoa numbers in forced feeding tests, but sometimes affected protozoa numbers in choice feeding tests. Exposure of various conifer woods to an early colonizing white rot fungus, Stereum sanguinolentum, affected how much wood of a particular species was consumed by dampwood termites in both forced and choice feeding tests. Exposure of these woods to a non-wood decay fungus, Trichoderma viride, had little effect on wood consumption but did affect the numbers of one type of gut protozoan, Trichoniitopsis, in choice testing. / Graduation date: 1993

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A Biopolpação é definida como o pré-tratamento de cavacos de madeira, designado como um processo de fermentação em estado sólido, para a produção de polpas mecânicas e químicas. Apesar dos resultados promissores obtidos pelo pré-tratamento com fungos seguido de reações de polpação, não há correlação entre o padrão de biodegradação dos componentes da madeira e o aumento na eficiência dos métodos de polpação subseqüentemente utilizados. Esta falta de correlação sugere que os benefícios do biotratamento dependem mais do tipo de modificação induzida na madeira do que da extensão da mineralização de seus componentes. Dentro deste contexto, este estudo visa o entendimento dos mecanismos químicos e bioquímicos, que poderiam explicar as alterações estruturais ocorridas nos componentes principais da madeira durante a etapa de biopolpação. Pinus taeda foi degradado por Ceriporiopsis subvermispora por períodos de 15 a 90 dias em condições de fermentação sólida. O fungo degradou lignina e extrativos extensivamente, sem remover grandes quantidades de glucana. As polioses foram significativamente removidas após 60 dias de degradação (7%), chegando a 31 % após 90 dias. A lignina e os polissacarídeos residuais , provenientes dos cavacos de madeira degradados e não degradados, foram caracterízados. A fração de lignina residual foi avaliada por técnicas de degradação in situ e por análises efetuadas na lignina de madeira moída e lignina liberada enzimaticamente, que foram isoladas das madeiras biodegradadas. A compilação dos resultados mostrou que a principal reação ocorrida na estrutura da lignina durante a biodegradação foi a quebra de ligações β-O-4 . Esta reação de oxidação gerou despolimerização da macromolécula e foi seguida do aumento nos teores de dímeros conectados por ligações C-C e 4-0-5 e pelo aparecimento de novos carbonos saturados não-oxigenados nas cadeias laterais. Após longos períodos de biodegradação, reações de abertura de anéis aromáticos também puderam ser sugeridas . A despolimerização de celulose foi avaliada através da preparação de amostras de acelulose provenientes dos cavacos de madeira biodegradados. O perfil de eluição dos derivados tricarbanilados das preparações de α-celuloses foi determinado por cromatografia de exclusão. Os rendimentos de α-celulose e os perfis de eluição indicaram alguma despolimerização da fração de celulose após trinta dias de biodegradação. Este resultado mostrou que reações de degradação da cadeia de celulose começaram a ocorrer antes que a mineralização fosse detectada como perda de glicose. As enzimas hidrolíticas e ligninolíticas relacionadas à degradação de madeira foram extraídas e quantificadas. Durante os primeiros trinta dias de biodegradação, os altos valores de atividades xilanolítica não produziram degradação extensiva da fração de polioses, indicando que o processo de biodegradação foi limitado pela baixa porosidade das paredes celulares da madeira. Por outro lado, algumas reações mediadas enzimaticamente parecem ter sido responsáveis pela despolimerização de lignina e celulose nos estágios iniciais de degradação. / Biopulping is the fungaI pretreatment of wood chips designed as a solid-state fermentation process for production of mechanical or chemical pulps. Although promising results have been obtained by combining fungaI pretreatment with chemical pulping methods, there is no relationship between the pattern of biodegradation of the wood components and the increase in efficiency of pulp methods subsequently adopted. This study presents some efforts to elucidate changes in the structure of residual components and enzymes produced during the wood biotreatment. Softwood Pinus taeda was degraded by Ceriporiopsis subvermispora for periods from 15 to 90 days under solid-state fermentation. The fungus degraded lignin and extractives extensively without removing large amounts of glucan. Polyoses were significantly removed (7%) only after 60 days of degradation, reaching 31 % after 90 days . Decayed and undecayed wood chips were characterized as to their residual lignin and polysaccharides. Residual lignin fraction was evaluated by using in situ techniques and analysis performed on milled wood lignin and enzymatically-liberated lignin isolated from biodegraded wood. Compiled data suggested that the main reaction taking place on the lignin moiety during biodegradation was the cleavage of β-0-4 linkages. This oxidation reaction generates lignin depolymerization, which is followed by an increase in the amount of dimmers connected by C-C and 4-0-5 linkages and the appearance of new saturated-carbons at the side chain. After longer biodegradation periods, ring-opening reactions can also occur. Depolymerization of cellulose was evaluated by preparing α-cellulose samples from biotreated wood chips. High performance size exclusion chromatography of tricarbanyl derivatives of these α-cellulose samples was also evaluated. Both, acellulose yield and elution profiles indicated some depolymerization of the cellulose fraction starting from the 30th day of biodegradation. This result suggests that degradation reactions started at the cellulose backbone before mineralization has been detected as glucan loss. Hydrolytic and ligninolytic enzymes were extracted from the cultures and quantified.· During the first 30 days of biodegradation, high xylanolytic activities did not produce an extensive degradation of the polyoses fractions indicating that the biodegradation process was limited by the low porosity of the wood ceIl walls. On the other hand, some enzimatically-mediated reactions are suggested to be responsible for cellulose and lignin depolymerization at an early decay stage.

A Biopolpação é definida como o pré-tratamento de cavacos de madeira, designado como um processo de fermentação em estado sólido, para a produção de polpas mecânicas e químicas. Apesar dos resultados promissores obtidos pelo pré-tratamento com fungos seguido de reações de polpação, não há correlação entre o padrão de biodegradação dos componentes da madeira e o aumento na eficiência dos métodos de polpação subseqüentemente utilizados. Esta falta de correlação sugere que os benefícios do biotratamento dependem mais do tipo de modificação induzida na madeira do que da extensão da mineralização de seus componentes. Dentro deste contexto, este estudo visa o entendimento dos mecanismos químicos e bioquímicos, que poderiam explicar as alterações estruturais ocorridas nos componentes principais da madeira durante a etapa de biopolpação. Pinus taeda foi degradado por Ceriporiopsis subvermispora por períodos de 15 a 90 dias em condições de fermentação sólida. O fungo degradou lignina e extrativos extensivamente, sem remover grandes quantidades de glucana. As polioses foram significativamente removidas após 60 dias de degradação (7%), chegando a 31 % após 90 dias. A lignina e os polissacarídeos residuais , provenientes dos cavacos de madeira degradados e não degradados, foram caracterízados. A fração de lignina residual foi avaliada por técnicas de degradação in situ e por análises efetuadas na lignina de madeira moída e lignina liberada enzimaticamente, que foram isoladas das madeiras biodegradadas. A compilação dos resultados mostrou que a principal reação ocorrida na estrutura da lignina durante a biodegradação foi a quebra de ligações β-O-4 . Esta reação de oxidação gerou despolimerização da macromolécula e foi seguida do aumento nos teores de dímeros conectados por ligações C-C e 4-0-5 e pelo aparecimento de novos carbonos saturados não-oxigenados nas cadeias laterais. Após longos períodos de biodegradação, reações de abertura de anéis aromáticos também puderam ser sugeridas . A despolimerização de celulose foi avaliada através da preparação de amostras de acelulose provenientes dos cavacos de madeira biodegradados. O perfil de eluição dos derivados tricarbanilados das preparações de α-celuloses foi determinado por cromatografia de exclusão. Os rendimentos de α-celulose e os perfis de eluição indicaram alguma despolimerização da fração de celulose após trinta dias de biodegradação. Este resultado mostrou que reações de degradação da cadeia de celulose começaram a ocorrer antes que a mineralização fosse detectada como perda de glicose. As enzimas hidrolíticas e ligninolíticas relacionadas à degradação de madeira foram extraídas e quantificadas. Durante os primeiros trinta dias de biodegradação, os altos valores de atividades xilanolítica não produziram degradação extensiva da fração de polioses, indicando que o processo de biodegradação foi limitado pela baixa porosidade das paredes celulares da madeira. Por outro lado, algumas reações mediadas enzimaticamente parecem ter sido responsáveis pela despolimerização de lignina e celulose nos estágios iniciais de degradação. / Biopulping is the fungaI pretreatment of wood chips designed as a solid-state fermentation process for production of mechanical or chemical pulps. Although promising results have been obtained by combining fungaI pretreatment with chemical pulping methods, there is no relationship between the pattern of biodegradation of the wood components and the increase in efficiency of pulp methods subsequently adopted. This study presents some efforts to elucidate changes in the structure of residual components and enzymes produced during the wood biotreatment. Softwood Pinus taeda was degraded by Ceriporiopsis subvermispora for periods from 15 to 90 days under solid-state fermentation. The fungus degraded lignin and extractives extensively without removing large amounts of glucan. Polyoses were significantly removed (7%) only after 60 days of degradation, reaching 31 % after 90 days . Decayed and undecayed wood chips were characterized as to their residual lignin and polysaccharides. Residual lignin fraction was evaluated by using in situ techniques and analysis performed on milled wood lignin and enzymatically-liberated lignin isolated from biodegraded wood. Compiled data suggested that the main reaction taking place on the lignin moiety during biodegradation was the cleavage of β-0-4 linkages. This oxidation reaction generates lignin depolymerization, which is followed by an increase in the amount of dimmers connected by C-C and 4-0-5 linkages and the appearance of new saturated-carbons at the side chain. After longer biodegradation periods, ring-opening reactions can also occur. Depolymerization of cellulose was evaluated by preparing α-cellulose samples from biotreated wood chips. High performance size exclusion chromatography of tricarbanyl derivatives of these α-cellulose samples was also evaluated. Both, acellulose yield and elution profiles indicated some depolymerization of the cellulose fraction starting from the 30th day of biodegradation. This result suggests that degradation reactions started at the cellulose backbone before mineralization has been detected as glucan loss. Hydrolytic and ligninolytic enzymes were extracted from the cultures and quantified.· During the first 30 days of biodegradation, high xylanolytic activities did not produce an extensive degradation of the polyoses fractions indicating that the biodegradation process was limited by the low porosity of the wood ceIl walls. On the other hand, some enzimatically-mediated reactions are suggested to be responsible for cellulose and lignin depolymerization at an early decay stage.

O presente trabalho está inserido dentro de um estudo que pretende entender os mecanismos químicos e bioquímicos envolvidos na biodegradação da madeira por Ceriporiopsis subvermispora. Particularmente avaliou-se a relação entre a atividade redutora de Fe3+ presente em extratos aquosos de cultivos de Ceriporiopsis subvermispora sobre madeira com a iniciação de reações de peroxidação de ácido linoleico. A madeira foi biotratada por períodos de 7, 14 e 28 dias. Após a biodegradação, os cavacos foram extraídos com água e os extratos gerados foram caracterizados quanto a atividade redutora de Fe3+ e a capacidade de peroxidar ácido linoleico in vitro. As reações de peroxidação foram avaliadas a partir do monitoramento do consumo de O2 em um oxímetro. A partir desses ensaios foi possível determinar que tanto a oxidação de íons Fe2+ adicionados diretamente ao meio reacional ou a adição de íons Fe3+ e extratos com atividade redutora foram capazes de gerar radicais hidroperoxila que podem iniciar a peroxidação de ácido linoleico. As reações controle indicaram que a peroxidação não ocorre na presença de Fe3+. A adição de metanol às reações contendo Fe2+ não proporcionou menor capacidade de peroxidação de lipídeos, indicando que a reação não deve ser iniciada por OH radical. Tanto a atividade redutora de Fe+3 como a capacidade de iniciar a peroxidação de ácido linoleico dos extratos aumentaram em função do tempo de cultivo. A ultrafiltação dos extratos através de membranas seletivas associada com estudos de cromatografia de permeação em gel (CPG) indicaram que a maior parte da atividade redutora e da capacidade peroxidativa pode ser atribuída a compostos menores que 5kDa. Entre os compostos orgânicos identificados nas frações menores que 5 kDa, foram identificados, por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), alguns ácidos graxos como o palmítico e o ácido esteárico, além de glicerol e ácido oxálico e compostos aromáticos como a vanilina, e os ácidos vanílico, siríngico e gálico. A vanilina, detectada em todas as amostras em estudo, foi usada como padrão para um estudo comparativo das atividades redutoras de Fe3+ detectadas nos extratos. As concentrações estimadas de vanilina nos extratos foram de 5 a 22 ? moles/L de extrato ultrafiltrado. Soluções padrão de vanilina foram então preparadas em concentrações de 5 a 30 ? M e avaliadas quanto a capacidade de reduzir Fe3+ na presença de ferrozina. Essas misturas levaram à formação de Fe2+ nas concentrações de 0,5 a 0,7 ? M de Fe2+ , após 10 min de reação. A comparação desses dados com a capacidade redutora de Fe3+ encontrada nos ultrafiltrados da amostra de madeira biotratada por 14 dias, 43 ?M de Fe2+ em 10 min, sugeriu que a maior parte da capacidade redutora dos extratos não pode ser atribuída aos compostos detectados por CG/EM e sim deve ser atribuída a compostos que apresentam massa molar próxima àquela obtida pela calibração do sistema de CPG, entre 3 e 5 kDa. Isso sugere que a atividade redutora não estaria presente em compostos de baixa massa molar compatíveis com estruturas contendo 1 ou, no máximo, 2 anéis aromáticos e sim em derivados fenólicos maiores, oriundos da biodegradação da lignina. / The present work is inserted in a broad study aiming to understand the chemical and biochemical mechanisms involved in wood biodegradation by Ceriporiopsis subvermispora. Particularly, the relationship between the Fe3+-reducing activity present in aqueous extracts recovered from Ceriporiopsis subvermispora cultures on wood with the initiation of linoleic acid peroxidation reactions was evaluated. Wood chips were biotreated for periods varying from 7 to 28 days. After biotreatment, the wood chips were extracted with water and the resulting extracts were characterized according to their Fe3+-reducing activity, as well as their capacity to initiate linoleic acid peroxidation reactions in vitro. The peroxidation reactions were monitored through O2 consumption by using an appropriated Oximeter. Based on these assays, it was possible to show that Fe2+ ions added directly to the reaction media or the addition of Fe3+ ions plus aqueous extracts were able to generate hidroperoxil radicals that initiated linoleic acid peroxidation. The control reactions indicated that the peroxidation did not occur in the presence of Fe3+ ions alone. Addition of methanol to the reaction media containing Fe2+ did not diminish the lipid peroxidation extent, suggesting that the reaction should not depend on the formation of hydroxyl radical. The Fe3+-reducing activity and the capacity to initiate linoleic acid peroxidation increased in the aqueous wood extracts as a function of culturing time. The ultrafiltration of the extracts associated with gel permeation chromatography (GPC) studies indicated that most of the reducing activity and the peroxidation capacity present in the extracts were assigned to compounds presenting molecular mass lower than 5 kDa. In the fraction lower than 5 kDa some organic compounds were identified by using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS). Palmitic and estearic acids, glycerol, oxalic acid and some aromatic compounds such as vanillin, vanillic, gallic and syringic acids were identified. Vanillin, detected in all the studied samples, was used as a standard for comparative evaluation of the Fe3+-reducing activities detected in the extracts. The estimated concentrations of vanillin in the extracts varied from 5 to 22 μmol/L of ultrafiltrated extract. Therefore, 5 to 30 μM standard solutions of va nillin were assayed for their Fe3+-reducing activity. These solutions reduced 0.5 to 0.7?M of Fe3+ after 10 min reaction. The comparison of these data with the Fe3+-reducing capacity found in the ultrafiltrated aqueous extract from the 14-day biotreated sample, 43 ? M of Fe3+ reduced after 10 min reaction, suggested that most of the reducing capacity in the extracts could not be attributed to compounds detect by GC/MS. Conversely, the Fe3+-reducing capacity could be assigned to compounds with higher molar mass as already observed in the GPC studies (3 to 5 kDa). These data suggest that the reducing activity detected in the aqueous extracts would not be compatible with low molar mass compounds containing 1 or, at least 2, aromatic rings. Instead, the Fe3+-reducing capacity should be assigned to high molar mass phenolic derivatives produced during the lignin biodegradation.

O presente trabalho está inserido dentro de um estudo que pretende entender os mecanismos químicos e bioquímicos envolvidos na biodegradação da madeira por Ceriporiopsis subvermispora. Particularmente avaliou-se a relação entre a atividade redutora de Fe3+ presente em extratos aquosos de cultivos de Ceriporiopsis subvermispora sobre madeira com a iniciação de reações de peroxidação de ácido linoleico. A madeira foi biotratada por períodos de 7, 14 e 28 dias. Após a biodegradação, os cavacos foram extraídos com água e os extratos gerados foram caracterizados quanto a atividade redutora de Fe3+ e a capacidade de peroxidar ácido linoleico in vitro. As reações de peroxidação foram avaliadas a partir do monitoramento do consumo de O2 em um oxímetro. A partir desses ensaios foi possível determinar que tanto a oxidação de íons Fe2+ adicionados diretamente ao meio reacional ou a adição de íons Fe3+ e extratos com atividade redutora foram capazes de gerar radicais hidroperoxila que podem iniciar a peroxidação de ácido linoleico. As reações controle indicaram que a peroxidação não ocorre na presença de Fe3+. A adição de metanol às reações contendo Fe2+ não proporcionou menor capacidade de peroxidação de lipídeos, indicando que a reação não deve ser iniciada por OH radical. Tanto a atividade redutora de Fe+3 como a capacidade de iniciar a peroxidação de ácido linoleico dos extratos aumentaram em função do tempo de cultivo. A ultrafiltação dos extratos através de membranas seletivas associada com estudos de cromatografia de permeação em gel (CPG) indicaram que a maior parte da atividade redutora e da capacidade peroxidativa pode ser atribuída a compostos menores que 5kDa. Entre os compostos orgânicos identificados nas frações menores que 5 kDa, foram identificados, por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), alguns ácidos graxos como o palmítico e o ácido esteárico, além de glicerol e ácido oxálico e compostos aromáticos como a vanilina, e os ácidos vanílico, siríngico e gálico. A vanilina, detectada em todas as amostras em estudo, foi usada como padrão para um estudo comparativo das atividades redutoras de Fe3+ detectadas nos extratos. As concentrações estimadas de vanilina nos extratos foram de 5 a 22 ? moles/L de extrato ultrafiltrado. Soluções padrão de vanilina foram então preparadas em concentrações de 5 a 30 ? M e avaliadas quanto a capacidade de reduzir Fe3+ na presença de ferrozina. Essas misturas levaram à formação de Fe2+ nas concentrações de 0,5 a 0,7 ? M de Fe2+ , após 10 min de reação. A comparação desses dados com a capacidade redutora de Fe3+ encontrada nos ultrafiltrados da amostra de madeira biotratada por 14 dias, 43 ?M de Fe2+ em 10 min, sugeriu que a maior parte da capacidade redutora dos extratos não pode ser atribuída aos compostos detectados por CG/EM e sim deve ser atribuída a compostos que apresentam massa molar próxima àquela obtida pela calibração do sistema de CPG, entre 3 e 5 kDa. Isso sugere que a atividade redutora não estaria presente em compostos de baixa massa molar compatíveis com estruturas contendo 1 ou, no máximo, 2 anéis aromáticos e sim em derivados fenólicos maiores, oriundos da biodegradação da lignina. / The present work is inserted in a broad study aiming to understand the chemical and biochemical mechanisms involved in wood biodegradation by Ceriporiopsis subvermispora. Particularly, the relationship between the Fe3+-reducing activity present in aqueous extracts recovered from Ceriporiopsis subvermispora cultures on wood with the initiation of linoleic acid peroxidation reactions was evaluated. Wood chips were biotreated for periods varying from 7 to 28 days. After biotreatment, the wood chips were extracted with water and the resulting extracts were characterized according to their Fe3+-reducing activity, as well as their capacity to initiate linoleic acid peroxidation reactions in vitro. The peroxidation reactions were monitored through O2 consumption by using an appropriated Oximeter. Based on these assays, it was possible to show that Fe2+ ions added directly to the reaction media or the addition of Fe3+ ions plus aqueous extracts were able to generate hidroperoxil radicals that initiated linoleic acid peroxidation. The control reactions indicated that the peroxidation did not occur in the presence of Fe3+ ions alone. Addition of methanol to the reaction media containing Fe2+ did not diminish the lipid peroxidation extent, suggesting that the reaction should not depend on the formation of hydroxyl radical. The Fe3+-reducing activity and the capacity to initiate linoleic acid peroxidation increased in the aqueous wood extracts as a function of culturing time. The ultrafiltration of the extracts associated with gel permeation chromatography (GPC) studies indicated that most of the reducing activity and the peroxidation capacity present in the extracts were assigned to compounds presenting molecular mass lower than 5 kDa. In the fraction lower than 5 kDa some organic compounds were identified by using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS). Palmitic and estearic acids, glycerol, oxalic acid and some aromatic compounds such as vanillin, vanillic, gallic and syringic acids were identified. Vanillin, detected in all the studied samples, was used as a standard for comparative evaluation of the Fe3+-reducing activities detected in the extracts. The estimated concentrations of vanillin in the extracts varied from 5 to 22 μmol/L of ultrafiltrated extract. Therefore, 5 to 30 μM standard solutions of va nillin were assayed for their Fe3+-reducing activity. These solutions reduced 0.5 to 0.7?M of Fe3+ after 10 min reaction. The comparison of these data with the Fe3+-reducing capacity found in the ultrafiltrated aqueous extract from the 14-day biotreated sample, 43 ? M of Fe3+ reduced after 10 min reaction, suggested that most of the reducing capacity in the extracts could not be attributed to compounds detect by GC/MS. Conversely, the Fe3+-reducing capacity could be assigned to compounds with higher molar mass as already observed in the GPC studies (3 to 5 kDa). These data suggest that the reducing activity detected in the aqueous extracts would not be compatible with low molar mass compounds containing 1 or, at least 2, aromatic rings. Instead, the Fe3+-reducing capacity should be assigned to high molar mass phenolic derivatives produced during the lignin biodegradation.