Bei neun von vierzehn Serogruppen der Subspezies E. coli Flexneri (SF) konnte ein pHS-2-Plasmid nachgewiesen werden. Es besteht eine positive Korrelation zwischen pHS-2-positiven SF und dem Auftreten einer Reaktiven Arthritis, eine Komplikation der bakteriellen Ruhr. Verschiedene Autoren führen das gehäufte Auftreten der Reaktiven Arthritis bei pHS-2-positiven SF auf eine erhöhte Serumresistenz zurück, die den Bakterien durch das cld(pHS-2)-Gen vermittelt wird. Das cld(pHS-2)-Gen als längstes aller 18 "open reading frames" auf dem pHS-2-Plasmid kodiert für ein 35 kD großes Protein, das aufgrund seiner Funktion als "chain length determinant" (Cld(pHS-2)) bezeichnet wurde. Cld(pHS-2) ist maßgeblich an der Produktion von Lipopolysacchariden vom VL-Typ beteiligt. LPS vom VL-Typ produzieren O-Seitenketten mit mehr als 70 bis 80 Oligosaccharideinheiten und sollen die bakterielle Membran vor einer Komplementbindung und Serum-Antikörpern schützen, wodurch den Bakterien eine erhöhte Serumresistenz vermittelt werde. In dieser Arbeit wurde cld(pHS-2) in einen pHS-2-negativen Stamm der SF Serogruppe 6 integriert, um nachzuweisen, dass cld(pHS-2) das LPS-Muster pHS-2-negativer SF in charakteristischer Weise modifiziert. Während der Expressionsnachweis von cld(pHS-2) als Einzelprotein misslang, war eine Expression von cld(pHS-2) als Fusionsprotein in SF Serogruppe 6 erfolgreich. Im Vergleich zu pHS-2-negativen SF war unsere SF Serogruppe 6-Mutante nun in der Lage, LPS vom VL-Typ in Form einer zusätzlichen Bande mit ca. 80 Oligosaccharideinheiten zu produzieren. Diese phänotypische Veränderung war zwar nur gering ausgeprägt, konnte jedoch den spezifischen Einfluss von cld(pHS-2) als Fusionsprotein auf das LPS-Muster pHS-2-negativer SF nachweisen. / In nine out of fourteen serogroups of E. Coli Flexneri (SF) a pHS-2 plasmid has been isolated. There is a positive correlation between pHS-2-positive SF and the occurence of reactive arthritis (ReA) which is a complication of bacterial dysentery. Different authors reduce the widespread appearance of ReA by pHS-2-positive SF to an increased serum resistance caused by a cld(pHS-2)-gene. The cld(pHS-2)-gene ist the longest of 18 open reading frames in pHS-2 and it is the coding for a 35 kD protein which has been identified as a chain length determinant because of its function. Cld(pHS-2) plays a decisive role in the production of lipopolysaccharides (LPS) of the VL-type. LPS of the VL-type produce O antigen with more than 70-80 repeat units, and protect the bacterial outer membrane from complement factors and serum antibodies by a higher serum resistance. In this research the cld(pHS-2)-gene was integrated in a pHS-2-negative SF serogroup 6 to prove that cld(pHS-2) is able to modify the LPS pattern (destribution) of pHS-2-negative SF in a characteristic manner. The expression of cld(pHS-2) in SF serogroup 6 as an isolated protein failed, but the expression of cld(pHS-2) as a fusion protein was successful. In contrast to the pHS-2-negative SF our SF serogroup 6 mutant was able to produce LPS of the VL-type with 80-90 repeat units. Despite the slight effect, a specific influence of cld(pHS-2) as a fusion protein on LPS pattern and the bacterial phaenotype has to be confirmed.

Einleitung: Das Probiotikum E. coli Nissle 1917 (EcN) wird seit einigen Jahren erfolgreich in der Behandlung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen angewendet, der zugrunde liegende Wirkmechanismus ist jedoch nur unzureichend geklärt. T-Zellen spielen in der intestinalen Immunhomöostase und der Pathogenese von CED eine zentrale Rolle. Ziel: Den Einfluss von EcN auf humane T-Zellen weitergehend zu charakterisieren. Methoden: CD3-stimulierte periphere und Lamina propria T-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen eines E. coli Nissle 1917 konditionierten Mediums (EcN-CM) oder aber hitzeinaktivierten E. coli Nissle 1917 (hi-EcN) kultiviert. Die Expression von zellzyklus- und apoptoseassoziierten Regulationsproteinen sowie DNA-Gehalt, Zellzykluskinetik, Apoptoserate und Zellexpansion wurden durchflusszytometrisch und im Western Blot bestimmt. Die Sekretion von Cytokinen wurde mit dem Cytometric Bead Assay bestimmt. Ergebnisse: EcN-CM, nicht aber hitzeinaktivierte E. coli Nissle 1917 hemmt die Zellzyklusprogression und die Expansion von stimulierten, humanen peripheren T-Zellen. Ursächlich hierfür ist eine verminderte Expression der Cykline A, B1, D2 und E mit einer konsekutiv verminderten Phosphorylierung des Retinoblastomaproteins. Periphere T-Zellen sezernieren unter EcN-CM vermindert IL-2, IFN-gamma und TNF-alpha, während die Sekretion des antiinflammatorischen IL-10 durch EcN-CM heraufreguliert wird. Im Gegensatz zur potenten Beeinflussung des Zellzyklus, wurde die Apoptose von PBT durch E. coli Nissle 1917 nicht moduliert. Während periphere T-Zellen durch EcN-CM in ihrer Zellzyklusprogression und Expansion gehemmt wurden, zeigte sich kein derartiger Effekt auf ortständige Lamina propria T-Lymphozyten. Diskussion: Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt es zu einer Rekrutierung und Aktivierung von peripheren T-Zellen in die intestinale Mukosa. Durch die differenzielle Beeinflussung des Immunsystems, bei der aktivierte periphere T-Zellen inhibiert, die ortsständigen T-Zellen jedoch in ihrer Funktion nicht gestört werden, könnte E. coli Nissle 1917 dazu beitragen, die mukosale Entzündungsreaktion zu limitieren, während die intestinale Immunhomöostase gewahrt bleibt. Als wirksames Agens kommen kleine, hitzestabile bakterielle Produkte wie Lipopolysaccharide, bakterielle Lipoproteine, CPG-DNA, Lipoteichonsäuren und Peptidoglykane in Frage. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern weitere Hinweise, dass Probiotika einen breiten Einfluss auf das humane Immunsystem haben und decken zugrundeliegende Mechanismen auf. / Introduction: Although probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) has been proven to be efficacious for the treatment of inflammatory bowel diseases, the underlying mechanisms of action still remain elusive. T cells play a major role in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Aims: To analyze the effects of E. coli Nissle 1917 on cell cycling and apoptosis of peripheral blood and lamina propria T cells. Methods: Anti-CD3-stimulated peripheral or lamina propria T cells were treated with E. coli Nissle 1917-conditioned medium (EcN-CM) or heat-inactivated E. coli Nissle 1917. Expression of cell cycle or apoptosis related proteins was determined by immunoblotting, DNA content, cell cycle kinetics, cell expansion and apoptosis were measured by flow cytometry. Cytokine levels in culture supernatants were assessed by cytometrc bead array. Results: EcN-CM but not heat-inactivated EcN inhibits cell cycling and expansion of peripheral T cells. EcN-CM decreases expression of Cyclin A, B1, D2 and E and thus reduces phosphorylation of retinoblastomaprotein in CD3-stimulated peripheral T cells. Further, secretion of proinflammatory cytokines IL-2, IFN-gamma and TNF-alpha is reduced while antiinflammatory IL-10 is increased under treatment with EcN-CM. In contrast to peripheral T cells, expansion and cell cycle progression of lamina propria T cells was not affected by EcN-CM. Apoptosis of was not modulated by EcN-CM. Discussion: The differential reaction of circulating and tissue-bound T cells towards E. coli Nissle 1917 may explain the beneficial effect of EcN in intestinal inflammation. EcN may downregulate the expansion of newly recruited T cells into the mucosa and thus limit intestinal inflammation, while already activated tissue-bound T cells may eliminate deleterious antigens in order to maintain immunological homeostasis. Possible agents, for which immunomodulatory effects are known, include heat-stable bacterial products like lipopolysaccharids, bacterial lipoproteins or bacterial DNA-motifs.