Sauerstoffmangel spielt in der Pathophysiologie zahlreicher Erkrankungen mit gro§er klinischer Relevanz wie z.B. Herzinfarkte und SchlaganfŠlle eine zentrale Rolle. Eine Anpassung an Hypoxie wird durch die Familie der Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) vermittelt. Als Transkriptionsfaktoren sind HIF-1alpha und HIF-2alpha entscheidende Regulatoren von Genen, die durch niedrige Sauerstoffspannung aktiviert werden und Anpassungen wie z.B. Angiogenese (VEGF) und Umstellung auf anaeroben Energiemetabolismus (glykolytische Enzyme) bewirken. HIF ist ein Heterodimer, bestehend aus einer Alpha- und Beta-Untereinheit. WŠhrend die Beta-Untereinheit konstitutiv prŠsent ist, reprŠsentiert die Alpha-Untereinheit die sauerstoffregulierte Komponente von HIF, welche unter Normoxie proteasomal degradiert wird. Unter hypoxischen Bedingungen werden beide Faktoren in Zellinien stabilisiert. Das gleiche gilt fŸr HIF-1alpha in vivo. Bisher waren die Organe und Zellen der Expression von HIF-2alpha im lebenden Organismus unbekannt. Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich daher auf die Charakterisierung der HIF-2alpha -Expression in vivo. Unter normoxischen Kontrollbedingungen war HIF-2alpha nicht nachweisbar. Es zeigte sich jedoch nach Stimulation mit 0,1 % CO (funktionelle AnŠmie) eine Induktion von HIF-2alpha in allen untersuchten Organen einschlie§lich Hirn, Leber, Lunge, Darm, Herz und Niere. Sowohl der zeitliche Verlauf des Anstiegs (1-6 Stunden) als auch die IntensitŠt der Induktion variierten in den einzelnen Organen, was durch Immunoblotting nachgewiesen werden konnte. Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte gezeigt werden, in welchen Zellen der verschiedenen Gewebe eine nukleŠre Akkumulation von HIF-2alpha erfolgte. In Niere und Hirn erfolgte eine Induktion in nicht-parenchymatšsen Zellen, in Leber und Darm hingegen fand sich eine vorwiegende Expression in parenchymatšsen Zellen. Eine gleiche Verteilung zwischen den beiden verschiedenen Zelltypen fand sich im Herz. Durch Untersuchungen der mRNA mittels RNA Protection Assay konnte bestŠtigt werden, dass die Regulation von HIF-2alpha posttranslational erfolgt, da keine Hochregulation der mRNA festgestellt werden konnte. Die Daten zeigen, dass HIF-2alpha eine wichtige Rolle bei der transkriptionellen Antwort auf verminderte SauerstoffverfŸgbarkeit in vivo spielt und dass seine Rolle zu der von HIF-1alpha verschieden ist. / Deficiency of oxygen plays a central role in the pathophysiology of diseases with great clinical relevance like heart failure and stroke. An adaptation to hypoxia is mediated by the family of hypoxia-inducible factors (HIF). As transcription-factors HIF-1alpha and HIF-2alpha are regulators of genes that are activated by low oxygen tension and that cause adaptations to hypoxia like angiogenesis (VEGF) and change to anaerobic energy-metabolism (glycolytic enzymes). HIF is a heterodimer, consisting of an Alpha- and Beta-subunit. Whereas the Beta-subunit is constitutively present, the Alpha-subunit represents the oxygen-regulated component of HIF, which is degraded in the proteasom under normoxia. Under hypoxic conditions both subunits are stabilized in cell lines and HIF-1alpha is widely expressed in vivo. In contrast, regulation and sites of HIF-2alpha expression in vivo were unknown. Therefore this work concentrates on the characterisation of the expression of HIF-2alpha in vivo. Although HIF-2alpha was not detectable under baseline conditions, marked hypoxic induction occurred in all organs investigated, in brain, liver, kidney, lung, intestine and heart after stimulation with 0,1% CO (functional anaemia). Time course and amplitude varied between organs. Immunohistochemistry revealed nuclear accumulation in distinct cell populations of each tissue, which were exclusively non-parenchymal in kidney and brain, predominantly parenchymal in liver and intestine or equally distributed in the heart. These data indicate that HIF-2alpha plays an important role in the transcriptional response to hypoxia in vivo and is complementary to rather than redundant with HIF-1alpha.

Einleitung: Das Probiotikum E. coli Nissle 1917 (EcN) wird seit einigen Jahren erfolgreich in der Behandlung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen angewendet, der zugrunde liegende Wirkmechanismus ist jedoch nur unzureichend geklärt. T-Zellen spielen in der intestinalen Immunhomöostase und der Pathogenese von CED eine zentrale Rolle. Ziel: Den Einfluss von EcN auf humane T-Zellen weitergehend zu charakterisieren. Methoden: CD3-stimulierte periphere und Lamina propria T-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen eines E. coli Nissle 1917 konditionierten Mediums (EcN-CM) oder aber hitzeinaktivierten E. coli Nissle 1917 (hi-EcN) kultiviert. Die Expression von zellzyklus- und apoptoseassoziierten Regulationsproteinen sowie DNA-Gehalt, Zellzykluskinetik, Apoptoserate und Zellexpansion wurden durchflusszytometrisch und im Western Blot bestimmt. Die Sekretion von Cytokinen wurde mit dem Cytometric Bead Assay bestimmt. Ergebnisse: EcN-CM, nicht aber hitzeinaktivierte E. coli Nissle 1917 hemmt die Zellzyklusprogression und die Expansion von stimulierten, humanen peripheren T-Zellen. Ursächlich hierfür ist eine verminderte Expression der Cykline A, B1, D2 und E mit einer konsekutiv verminderten Phosphorylierung des Retinoblastomaproteins. Periphere T-Zellen sezernieren unter EcN-CM vermindert IL-2, IFN-gamma und TNF-alpha, während die Sekretion des antiinflammatorischen IL-10 durch EcN-CM heraufreguliert wird. Im Gegensatz zur potenten Beeinflussung des Zellzyklus, wurde die Apoptose von PBT durch E. coli Nissle 1917 nicht moduliert. Während periphere T-Zellen durch EcN-CM in ihrer Zellzyklusprogression und Expansion gehemmt wurden, zeigte sich kein derartiger Effekt auf ortständige Lamina propria T-Lymphozyten. Diskussion: Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt es zu einer Rekrutierung und Aktivierung von peripheren T-Zellen in die intestinale Mukosa. Durch die differenzielle Beeinflussung des Immunsystems, bei der aktivierte periphere T-Zellen inhibiert, die ortsständigen T-Zellen jedoch in ihrer Funktion nicht gestört werden, könnte E. coli Nissle 1917 dazu beitragen, die mukosale Entzündungsreaktion zu limitieren, während die intestinale Immunhomöostase gewahrt bleibt. Als wirksames Agens kommen kleine, hitzestabile bakterielle Produkte wie Lipopolysaccharide, bakterielle Lipoproteine, CPG-DNA, Lipoteichonsäuren und Peptidoglykane in Frage. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern weitere Hinweise, dass Probiotika einen breiten Einfluss auf das humane Immunsystem haben und decken zugrundeliegende Mechanismen auf. / Introduction: Although probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) has been proven to be efficacious for the treatment of inflammatory bowel diseases, the underlying mechanisms of action still remain elusive. T cells play a major role in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Aims: To analyze the effects of E. coli Nissle 1917 on cell cycling and apoptosis of peripheral blood and lamina propria T cells. Methods: Anti-CD3-stimulated peripheral or lamina propria T cells were treated with E. coli Nissle 1917-conditioned medium (EcN-CM) or heat-inactivated E. coli Nissle 1917. Expression of cell cycle or apoptosis related proteins was determined by immunoblotting, DNA content, cell cycle kinetics, cell expansion and apoptosis were measured by flow cytometry. Cytokine levels in culture supernatants were assessed by cytometrc bead array. Results: EcN-CM but not heat-inactivated EcN inhibits cell cycling and expansion of peripheral T cells. EcN-CM decreases expression of Cyclin A, B1, D2 and E and thus reduces phosphorylation of retinoblastomaprotein in CD3-stimulated peripheral T cells. Further, secretion of proinflammatory cytokines IL-2, IFN-gamma and TNF-alpha is reduced while antiinflammatory IL-10 is increased under treatment with EcN-CM. In contrast to peripheral T cells, expansion and cell cycle progression of lamina propria T cells was not affected by EcN-CM. Apoptosis of was not modulated by EcN-CM. Discussion: The differential reaction of circulating and tissue-bound T cells towards E. coli Nissle 1917 may explain the beneficial effect of EcN in intestinal inflammation. EcN may downregulate the expansion of newly recruited T cells into the mucosa and thus limit intestinal inflammation, while already activated tissue-bound T cells may eliminate deleterious antigens in order to maintain immunological homeostasis. Possible agents, for which immunomodulatory effects are known, include heat-stable bacterial products like lipopolysaccharids, bacterial lipoproteins or bacterial DNA-motifs.