Esse trabalho teve como objetivo a determinação da estrutura tridimensional do inibidor de tripsina purificado de sementes de Enterolobium contortisiliquum (EcTI) e a modelagem molecular dos complexos EcTItripsina, EcTI-quimotripsina , EcTI-trombina, EcTI-fator Xa, e suas análises. O EcTI possui 19kDa de peso molecular inibe tripsina, quimotripsina, calicreína plasmática humana, plasmina humana e fator Xlla, mas não inibe fator Xa e ativador de plasminogênio. Monocristais apropriados à coleta de dados de difração de raios-X foram obtidos na condição 50 do fatorial da Hampton (PEG8000 - 0,5M, LiSO4 - 0,5M) através da técnica de acupuntura em gel à temperatura constante de 15&#176C após três semanas. O grupo espacial encontrado foi o P21 com uma molécula na unidade assimétrica. Os dados de difração foram coletados num detetor de placas de imagem MAR345 na linha de Cristalografia de Proteínas (PCr) no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) em Campinas até uma resolução de 1,96&#197, completeza de 87% e Rsym=10,3%. A estrutura foi resolvida por Substituição Molecular tendo-se como molde a estrutura do inibidor de tripsina proveniente de Erythrina caffra que apresenta 39% de identidade seqüencial com a seqüência primária do EcTI. Divergências entre a seqüência primária esperada e a observada no mapa de densidade eletrônica levaram à suposição da existência de isoformas para este inibidor. Acatando esta hipótese e supondo que a isoforma cristalizada era diferente da isoforma cuja seqüência foi publicada, mudanças na seqüência guiadas pelo mapa de densidades foram realizadas. Um total de 33 substituições e 1 inserção foram feitos. Diferentemente das tentativas de refinamento com a seqüência original, após as substituições o refinamento convergiu para valores aceitáveis de Rfactor=17% e Rfree=25%. A estrutura apresenta o enovelamento &#946-trefoil com uma pseudo simetria de ordem 3. Os grampos de cabelo presentes na estrutura são espiralados mas isto não é resultado de repetições sistemáticas nos ângulo &#934/&#936 como esperado. Baseado nesta estrutura cristalográfica, um modelo da seqüência original foi construído por modelagem por homologia. A avaliação do modelo em termos de estereoquímica e compatibilidade estrutura-seqüência mostra uma boa qualidade, mesmo existindo a formação de uma ponte salina enterrada no núcleo hidrofóbico da molécula. Estruturas cristalográficas de complexos entre tripsina, quimotripsina, fator Xa e trombina foram usados para gerar modelos de complexos entre as serinoproteases correspondentes e o EcTI. A falta de atividade de EcTI contra fator Xa e trombina pode ser atribuída à incompatibilidade química e estrutural na interface do complexo. / The principal objective of this work was the 3D structural determination of a Trypsin inhibitor from Enterolobium contortisiliquum (EcTI) seeds as well as the modeling of the complexes between EcTI and trypsin, chymotrypsin, thrombin and factor Xa and their subsequent analysis. The inhibitor has a molecular weight of 19.5 kDa and inhibits trypsin, chymotrypsin, human plasma kallikrein, human plasmin and factor Xlla but not factor Xa and tissue type plasminogen activator. A single crystal appropriate for X-ray data collection was grown using condition 50 of Hampton\'s Research fatorial (PEG8000 - 15%, LiSO4 - 0.5mM) by the gel acupuncture technique at 15&#176C. The crystal grew in three weeks in the space group P21 with one molecule in the assymetric unit. Crystallographic data were acquired using an image plate detector MAR345 on the Protein Crystallography beam line at the Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), Campinas, out to 1,96&#197 resolution, with a completeness of 87% and Rsym= 10.3%. The structure was solved by the Molecular Replacement method using the previous determined structure of the trypsin inhibitor from Erythrina caffra which presented 39% sequence identity to EcTI. Discrepancies in the primary structure, as observed in the electron density map led to the supposition of the existence of isoforms for this particular inhibitor. In total 33 substitutions and 1 insertion were made. In contrast with the attempts made with the original sequence, after the amino acids were substituted the refinement converged to acceptable values for Rfactor=17% and Rfree=25%. The 3D fold of EcTI is a &#946-trefoil as expected. The hairpins present in this fold are coiled coils, but not as a result of the systematic alternation of the &#934/&#936 angles as expected. Using the crystallographic structure as a template a homology model for the original sequence was built. The model evaluation in terms of stereochemistry and structure-sequence compatibility showed it to be of generally good quality, despite the presence of a salt bridge buried in the hydrophobic core. Docking experiments using crystallographic structures of trypsin, chymotripsin, factor Xa and thrombin complexed with their respective inhibitors were undertaken. The lack of EcTI activity against factor Xa and thrombin is predicted to be due to chemical and structural incompatibility at the complex interface.

Esse trabalho teve como objetivo a determinação da estrutura tridimensional do inibidor de tripsina purificado de sementes de Enterolobium contortisiliquum (EcTI) e a modelagem molecular dos complexos EcTItripsina, EcTI-quimotripsina , EcTI-trombina, EcTI-fator Xa, e suas análises. O EcTI possui 19kDa de peso molecular inibe tripsina, quimotripsina, calicreína plasmática humana, plasmina humana e fator Xlla, mas não inibe fator Xa e ativador de plasminogênio. Monocristais apropriados à coleta de dados de difração de raios-X foram obtidos na condição 50 do fatorial da Hampton (PEG8000 - 0,5M, LiSO4 - 0,5M) através da técnica de acupuntura em gel à temperatura constante de 15&#176C após três semanas. O grupo espacial encontrado foi o P21 com uma molécula na unidade assimétrica. Os dados de difração foram coletados num detetor de placas de imagem MAR345 na linha de Cristalografia de Proteínas (PCr) no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) em Campinas até uma resolução de 1,96&#197, completeza de 87% e Rsym=10,3%. A estrutura foi resolvida por Substituição Molecular tendo-se como molde a estrutura do inibidor de tripsina proveniente de Erythrina caffra que apresenta 39% de identidade seqüencial com a seqüência primária do EcTI. Divergências entre a seqüência primária esperada e a observada no mapa de densidade eletrônica levaram à suposição da existência de isoformas para este inibidor. Acatando esta hipótese e supondo que a isoforma cristalizada era diferente da isoforma cuja seqüência foi publicada, mudanças na seqüência guiadas pelo mapa de densidades foram realizadas. Um total de 33 substituições e 1 inserção foram feitos. Diferentemente das tentativas de refinamento com a seqüência original, após as substituições o refinamento convergiu para valores aceitáveis de Rfactor=17% e Rfree=25%. A estrutura apresenta o enovelamento &#946-trefoil com uma pseudo simetria de ordem 3. Os grampos de cabelo presentes na estrutura são espiralados mas isto não é resultado de repetições sistemáticas nos ângulo &#934/&#936 como esperado. Baseado nesta estrutura cristalográfica, um modelo da seqüência original foi construído por modelagem por homologia. A avaliação do modelo em termos de estereoquímica e compatibilidade estrutura-seqüência mostra uma boa qualidade, mesmo existindo a formação de uma ponte salina enterrada no núcleo hidrofóbico da molécula. Estruturas cristalográficas de complexos entre tripsina, quimotripsina, fator Xa e trombina foram usados para gerar modelos de complexos entre as serinoproteases correspondentes e o EcTI. A falta de atividade de EcTI contra fator Xa e trombina pode ser atribuída à incompatibilidade química e estrutural na interface do complexo. / The principal objective of this work was the 3D structural determination of a Trypsin inhibitor from Enterolobium contortisiliquum (EcTI) seeds as well as the modeling of the complexes between EcTI and trypsin, chymotrypsin, thrombin and factor Xa and their subsequent analysis. The inhibitor has a molecular weight of 19.5 kDa and inhibits trypsin, chymotrypsin, human plasma kallikrein, human plasmin and factor Xlla but not factor Xa and tissue type plasminogen activator. A single crystal appropriate for X-ray data collection was grown using condition 50 of Hampton\'s Research fatorial (PEG8000 - 15%, LiSO4 - 0.5mM) by the gel acupuncture technique at 15&#176C. The crystal grew in three weeks in the space group P21 with one molecule in the assymetric unit. Crystallographic data were acquired using an image plate detector MAR345 on the Protein Crystallography beam line at the Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), Campinas, out to 1,96&#197 resolution, with a completeness of 87% and Rsym= 10.3%. The structure was solved by the Molecular Replacement method using the previous determined structure of the trypsin inhibitor from Erythrina caffra which presented 39% sequence identity to EcTI. Discrepancies in the primary structure, as observed in the electron density map led to the supposition of the existence of isoforms for this particular inhibitor. In total 33 substitutions and 1 insertion were made. In contrast with the attempts made with the original sequence, after the amino acids were substituted the refinement converged to acceptable values for Rfactor=17% and Rfree=25%. The 3D fold of EcTI is a &#946-trefoil as expected. The hairpins present in this fold are coiled coils, but not as a result of the systematic alternation of the &#934/&#936 angles as expected. Using the crystallographic structure as a template a homology model for the original sequence was built. The model evaluation in terms of stereochemistry and structure-sequence compatibility showed it to be of generally good quality, despite the presence of a salt bridge buried in the hydrophobic core. Docking experiments using crystallographic structures of trypsin, chymotripsin, factor Xa and thrombin complexed with their respective inhibitors were undertaken. The lack of EcTI activity against factor Xa and thrombin is predicted to be due to chemical and structural incompatibility at the complex interface.