SANTIAGO,S.P. Estudo de polimorfismos de genes de reparo do DNA em lesão de fita simples e sua associação com aspectos clínicos e laboratoriais de portadores de síndrome mielodisplásica, 2015. 76 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,2015 / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-08-02T13:51:15Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_sps.pdf: 1634505 bytes, checksum: 2c0be85cb65dbcfc46ac2c970cd10bab (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-08-03T12:31:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_sps.pdf: 1634505 bytes, checksum: 2c0be85cb65dbcfc46ac2c970cd10bab (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-03T12:31:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_sps.pdf: 1634505 bytes, checksum: 2c0be85cb65dbcfc46ac2c970cd10bab (MD5) Previous issue date: 2015-12-16 / Myelodysplastic Syndrome (MDS) is a group of clonal diseases of hematopoietic progenitor cells, characterized by peripheral cytopenia (s), dysplasia of one or more myeloid cell lines and increased risk of developing acute myeloid leukemia. The pathogenesis of SMD involves DNA damage in hematopoietic stem cells likely to be affected by single-stranded DNA damage and the Nucleotide Excision Repair (NER) as one of the main mechanisms to ensure the genomic stability of cells -trunk. This case-control study of candidate genes proposed to evaluate the association of the polymorphisms XPA rs1800975, XPC rs2228000, XPD rs1799793 and XPF rs1800067 with the clinical variables of patients with Myelodysplastic Syndrome. This analysis used real-time quantitative PCR as a technique for genotyping between bone marrow samples from 95 MDS patients from the Walter Cantídio University Hospital and peripheral blood samples from 94 healthy elderly volunteers. For the polymorphism XPC rs2228000, we obtained, in relation to hemoglobin, in the genotypic distribution, that the CT genotype is associated with a higher odds ratio of hemoglobin levels below 8.0 g / dL (p = 0.010, OR 3.385, CI 1.343- 8,529); (P = 0.027, OR 2.75, CI 1.125-6.722) and in the dominant heterozygosis model (p = 0.013). In the present study, the genotype CC was associated with a higher odds ratio of Hb ≥ 8g / dL in the dominance model , OR 3.333, CI: 1.293-8.591); In relation to neutrophil counts we have that the mutant TT genotype has a higher odds ratio of neutrophil counts below 800 / mm3 (p = 0.017, OR 8,750, CI 1,470-52,098), that the CC genotype is associated with the highest ratio (P = 0.032, OR 2,833, CI 1,096-7,327) and in the homozygous model (p = 0.013, OR 17,500, CI 1,828-167,558) and that the combination CC + CT Of the recessive model was also associated with a higher odds ratio of neutrophils ≥ 800 / mm³ (p = 0.025, OR 12,500, CI 1,381-113,177). We also found that for genotype XPD rs1799793 the GG genotype is associated with a lower odds ratio of SMD in the dominance model (p = 0.009, OR 0.445, CI 0.242-0.816) and in the dominant heterozygosis model (p = 0.010, OR 0.440 , IC 0.235-0.825), and the same genotype seems to have a lower odds ratio for bone marrow ring sideroblast counts ≥ 15% in three different models: genotype distribution (p = 0.027, OR 0.980, CI 0.013-0.768) , Dominance (p = 0.027, OR, 4,643, CI 1,195-18,034) and dominant heterozygosity (p = 0.022, OR 5,000, CI 1,265-19,762). We did not find a significant association between the XPF polymorphisms rs1800067 and XPA rs1800975 and the clinical variables for patients with MDS. This study suggests that polymorphisms of DNA repair genes by nucleotide excision are associated with clinical features of patients with myelodysplastic syndrome. / A Síndrome Mielodisplásica (SMD) é um grupo de doenças clonais das células progenitoras hematopoéticas, caracterizadas por citopenia(s) periférica(s), displasia de uma ou mais linhagens celulares mielóides e aumento do risco de desenvolvimento de leucemia mielóide aguda. A patogênese da SMD envolve danos no DNA nas células-tronco hematopoéticas acometidos provavelmente pelos danos de fita simples no DNA tendo o processo de reparo por excisão de nucleotídeos (Nucleotide excision repair – NER) como um dos principais mecanismos para garantir a estabilidade genômica das células-tronco. Este estudo de caso-controle de genes candidatos propôs avaliar a associação dos polimorfismos XPA rs1800975, XPC rs2228000, XPD rs1799793 e XPF rs1800067 com as variáveis clínicas de pacientes com Síndrome Mielodisplásica. Esta análise utilizou PCR quantitativo em tempo real como técnica de genotipagem entre amostras de medula óssea de 95 pacientes com SMD, oriundos do Hospital Universitário Walter Cantídio, e amostras de sangue periférico de 94 idosos voluntários sadios. Para o polimorfismo XPC rs2228000 obtivemos, em relação a hemoglobina, na distribuição genotípica, que o genótipo CT é associado a maior razão de chances de apresentar níveis de hemoglobina abaixo de 8,0g/dL (p= 0,010, OR 3,385, IC 1,343-8,529); por sua vez, o genótipo CC associa-se a maior razão de chances de Hb ≥ 8g/dL no modelo de dominância (p= 0,027, OR 2,75, IC 1,125-6,722) e no modelo de heterozigose dominante (p= 0,013, OR 3,333, IC: 1,293-8,591); em relação a contagem de neutrófilos temos que o genótipo mutante TT tem maior razão de chances de contagem de neutrófilos abaixo de 800/mm3 (p= 0,017, OR 8,750, IC 1,470-52,098), que o genótipo CC associa-se a maior razão de chances de neutrófilos ≥ 800/mm3 no modelo de dominância (p= 0,032, OR 2,833, IC 1,096-7,327) e no modelo de homozigose (p= 0,013, OR 17,500, IC 1,828-167,558) e que a combinação CC+CT do modelo de recessividade também associou-se com maior razão de chances de neutrófilos ≥ 800/mm³ (p= 0,025, OR 12,500, IC 1,381-113,177). Constatamos ainda que para o polimorfismo XPD rs1799793 o genótipo GG se associa a menor razão de chances de SMD no modelo de dominância (p= 0,009, OR 0,445, IC 0,242-0,816) e no modelo de heterozigose dominante (p= 0,010, OR 0,440, IC 0,235-0,825), e o mesmo genótipo parece ter menor razão de chances de contagem de sideroblastos em anel em medula óssea ≥ 15% em três modelos distintos: de distribuição genotípica (p= 0,027, OR 0,980, IC 0,013-0,768), de dominância (p= 0,027, OR 4,643, IC 1,195-18,034) e de heterozigose dominante (p= 0,022, OR 5,000, IC 1,265-19,762). Não obtivemos associação significante entre os polimorfismos XPF rs1800067 e XPA rs1800975 e as variáveis clínicas para os pacientes com SMD. Este estudo sugere que os polimorfismos de genes de reparo do DNA por excisão de nucleotídeos são associados a características clínicas de pacientes com Síndrome Mielodisplásica.

A via de Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é responsável pelo reparo das lesões causadas pela luz ultravioleta (UV) e de outras lesões capazes de distorcer a dupla hélice, bloqueando a replicação e a transcrição. Os pacientes que apresentam as síndromes recessivas raras Xeroderma Pigmentosum (XP), tricotiodistrofia (TTD) e síndrome de Cockayne (CS) possuem mutações em algum dos 11 genes relacionados ao NER e à transcrição basal. Mutações na proteína XPD levam ao surgimento de diferentes fenótipos: XP, TTD, XP/CS ou COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), uma forma rara de CS. Os pacientes XP apresentam alta incidência de câncer de pele, o que não ocorre com os pacientes TTD e CS, além de poderem apresentar perda neuronal progressiva, enquanto todos os CS e TTD apresentam uma diminuição na mielinização do cérebro. As neuropatologias são provavelmente associadas a problemas no reparo de danos endógenos no DNA das células nervosas. Diversos trabalhos mostraram o envolvimento do NER no reparo desses danos, os quais pensava-se serem reparados apenas por outro mecanismo, o Reparo por Excisão de Base. Neste trabalho mostramos que fibroblastos de pacientes XP-D, XP-D/CS e TTD, portadores de mutações em XPD, são sensíveis ao estresse oxidativo induzido pelo tratamento com azul de metileno fotoativado, apresentando bloqueio prolongado no ciclo celular e permanência da sinalização de danos ao DNA. A complementação das diferentes linhagens com o gene XPD/ERCC2 foi capaz de restaurar a sobrevivência celular. Foram detectadas diferenças importantes na capacidade de reparo/retomada da transcrição após danos gerados por estresse oxidativo em DNA plasmidial, além da ativação de vias diferentes de morte celular: fibroblastos XP-D apresentam maior capacidade de reparo e apresentam morte por apoptose após estresse oxidativo, enquanto os fibroblastos XP-D/CS e TTD apresentam menor capacidade de reparo ativação de mais de uma via de morte celular (apoptose e necrose), diferenças que podem estar ligadas ao fenótipo dos pacientes. Mutações no gene codificante para a DNA polimerase n, POLH, estão associadas à forma variante de XP (XP-V). Pol n é uma polimerase especializada na síntese translesão (TLS) de fotoprodutos, além de estar implicada na TLS de outros tipos de lesões como bases oxidadas, e em vias não relacionadas à TLS como a hipermutação somática e à replicação de regiões de DNA com arquiteturas não-canônicas. Neste trabalho mostramos que os fibroblastos de pacientes XP-V apresentam sensibilidade ao estresse oxidativo. Mostramos uma indução da proteína pol n em fibroblastos primários após danos genotóxicos, associada ao aumento da capacidade de lidar com a parada na forquilha de replicação, possibilitando a continuidade da replicação do DNA e ao aumento da sobrevivência celular. Mostramos uma diferença na estabilidade genômica nos genes das imunoglobulinas dos pacientes XP-V idosos em comparação com os pacientes jovens e controles de idade pareada, mostrando que a ausência dessa polimerase pode estar ligada ao aumento da instabilidade genômica nesses genes / The Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is responsible for the repair of UV photoproducts and other bulky lesions that block both replication and transcription. Patients with the rare recessive disorders Xeroderma Pigmentosum (XP), trichothiodystrophy (TTD) and Cockayne Syndrome (CS) carry mutations in one of the 11 NER genes, linked to repair and basal transcription. Mutations in XPD lead to different phenotypes: XP, TTD, XP/CS or COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), a rare form of CS. XP patients have high incidence of skin cancer, which does not occur in TTD or CS patients, although ther may present neurodegeneration, while all CS and TTD patients have neurodevelopmental symptoms linked to dysmielynation. The pathology of these neurological diseases is probably associated with deficient repair of DNA lesions in nervous cells, generated by endogenous processes. Many groups including ours have demonstrated the involvement of NER in the repair of these lesions, previously thought to be exclusively repaired by Base Excision Repair. In this work we show high sensitivity of both primary and transformed XP-D, XP-D/CS and TTD human fibroblasts in response to oxidative stress generated by photoactivated methylene blue, with prolonged cell cycle arrest and DNA damage signaling. The complementation of the three different cell lines with the XPD/ERCC2 gene was able to restore cell survival. We detected important differences in repair capacity/transcription resumption after damage generated by oxidative stress in plasmid DNA, besides the activation of different cell death pathways: XP-D cells have higher repair capacity and die by apoptosis, while XP-D/CS and TTD cells have little repair capacity and activate more than one death pathway (apoptosis and necrosis). We believe these differences can be related to the patients\' phenotypes. Mutations in DNA polymerase n coding gene, POLH, are associated with the variant form of XP (XP-V). Pol n is a translesion synthesis (TLS) polymerase specialized in the TLS past CPD photoproducts, besides other lesions like oxidized bases, and in other processes like somatic hypermutation and DNA replication in structured regions. In this work we show XP-V human fibroblasts are sensitive to oxidative stress. We detected an induction of pol n after genotoxic stress in primary cells, associated with increased ability to deal with the stalled replication fork, and consequently to DNA replication restart and cell survival. In addition, we detected a difference in genomic stability in immunoglobulin genes in aged XP-V patients in comparison to both young patients and age-matched controls, showing the absence of this polymerase may be linked to increased genomic instability in these genes

A via de Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é responsável pelo reparo das lesões causadas pela luz ultravioleta (UV) e de outras lesões capazes de distorcer a dupla hélice, bloqueando a replicação e a transcrição. Os pacientes que apresentam as síndromes recessivas raras Xeroderma Pigmentosum (XP), tricotiodistrofia (TTD) e síndrome de Cockayne (CS) possuem mutações em algum dos 11 genes relacionados ao NER e à transcrição basal. Mutações na proteína XPD levam ao surgimento de diferentes fenótipos: XP, TTD, XP/CS ou COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), uma forma rara de CS. Os pacientes XP apresentam alta incidência de câncer de pele, o que não ocorre com os pacientes TTD e CS, além de poderem apresentar perda neuronal progressiva, enquanto todos os CS e TTD apresentam uma diminuição na mielinização do cérebro. As neuropatologias são provavelmente associadas a problemas no reparo de danos endógenos no DNA das células nervosas. Diversos trabalhos mostraram o envolvimento do NER no reparo desses danos, os quais pensava-se serem reparados apenas por outro mecanismo, o Reparo por Excisão de Base. Neste trabalho mostramos que fibroblastos de pacientes XP-D, XP-D/CS e TTD, portadores de mutações em XPD, são sensíveis ao estresse oxidativo induzido pelo tratamento com azul de metileno fotoativado, apresentando bloqueio prolongado no ciclo celular e permanência da sinalização de danos ao DNA. A complementação das diferentes linhagens com o gene XPD/ERCC2 foi capaz de restaurar a sobrevivência celular. Foram detectadas diferenças importantes na capacidade de reparo/retomada da transcrição após danos gerados por estresse oxidativo em DNA plasmidial, além da ativação de vias diferentes de morte celular: fibroblastos XP-D apresentam maior capacidade de reparo e apresentam morte por apoptose após estresse oxidativo, enquanto os fibroblastos XP-D/CS e TTD apresentam menor capacidade de reparo ativação de mais de uma via de morte celular (apoptose e necrose), diferenças que podem estar ligadas ao fenótipo dos pacientes. Mutações no gene codificante para a DNA polimerase n, POLH, estão associadas à forma variante de XP (XP-V). Pol n é uma polimerase especializada na síntese translesão (TLS) de fotoprodutos, além de estar implicada na TLS de outros tipos de lesões como bases oxidadas, e em vias não relacionadas à TLS como a hipermutação somática e à replicação de regiões de DNA com arquiteturas não-canônicas. Neste trabalho mostramos que os fibroblastos de pacientes XP-V apresentam sensibilidade ao estresse oxidativo. Mostramos uma indução da proteína pol n em fibroblastos primários após danos genotóxicos, associada ao aumento da capacidade de lidar com a parada na forquilha de replicação, possibilitando a continuidade da replicação do DNA e ao aumento da sobrevivência celular. Mostramos uma diferença na estabilidade genômica nos genes das imunoglobulinas dos pacientes XP-V idosos em comparação com os pacientes jovens e controles de idade pareada, mostrando que a ausência dessa polimerase pode estar ligada ao aumento da instabilidade genômica nesses genes / The Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is responsible for the repair of UV photoproducts and other bulky lesions that block both replication and transcription. Patients with the rare recessive disorders Xeroderma Pigmentosum (XP), trichothiodystrophy (TTD) and Cockayne Syndrome (CS) carry mutations in one of the 11 NER genes, linked to repair and basal transcription. Mutations in XPD lead to different phenotypes: XP, TTD, XP/CS or COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), a rare form of CS. XP patients have high incidence of skin cancer, which does not occur in TTD or CS patients, although ther may present neurodegeneration, while all CS and TTD patients have neurodevelopmental symptoms linked to dysmielynation. The pathology of these neurological diseases is probably associated with deficient repair of DNA lesions in nervous cells, generated by endogenous processes. Many groups including ours have demonstrated the involvement of NER in the repair of these lesions, previously thought to be exclusively repaired by Base Excision Repair. In this work we show high sensitivity of both primary and transformed XP-D, XP-D/CS and TTD human fibroblasts in response to oxidative stress generated by photoactivated methylene blue, with prolonged cell cycle arrest and DNA damage signaling. The complementation of the three different cell lines with the XPD/ERCC2 gene was able to restore cell survival. We detected important differences in repair capacity/transcription resumption after damage generated by oxidative stress in plasmid DNA, besides the activation of different cell death pathways: XP-D cells have higher repair capacity and die by apoptosis, while XP-D/CS and TTD cells have little repair capacity and activate more than one death pathway (apoptosis and necrosis). We believe these differences can be related to the patients\' phenotypes. Mutations in DNA polymerase n coding gene, POLH, are associated with the variant form of XP (XP-V). Pol n is a translesion synthesis (TLS) polymerase specialized in the TLS past CPD photoproducts, besides other lesions like oxidized bases, and in other processes like somatic hypermutation and DNA replication in structured regions. In this work we show XP-V human fibroblasts are sensitive to oxidative stress. We detected an induction of pol n after genotoxic stress in primary cells, associated with increased ability to deal with the stalled replication fork, and consequently to DNA replication restart and cell survival. In addition, we detected a difference in genomic stability in immunoglobulin genes in aged XP-V patients in comparison to both young patients and age-matched controls, showing the absence of this polymerase may be linked to increased genomic instability in these genes