Eine der für die biotechnologische Nutzung interessanten Eigenschaften der Hefe Yarrowia (Y.) lipolytica ist ihr Vermögen, unter bestimmten Kultivierungsbedingungen große Mengen an organischen Säuren, darunter auch Citronensäure (CS), ins extrazelluläre Medium zu sekretieren. Aufgrund ihrer Apathogenität, ihres breiten Substratspektrums und ihrer guten molekulargenetischen und verfahrenstechnischen Handhabbarkeit, stellt sie einen idealen Mikroorganismus zur biotechnologischen Gewinnung von Citronensäure dar. Bei der durch eine Stickstofflimitation ausgelösten Überproduktion von CS mit Y. lipolytica kommt es parallel auch zur Ausscheidung von Isocitronensäure (ICS), deren Anteil am Gesamtsäureprodukt in Abhängigkeit von der C-Quelle in Wildtypstämmen zwischen 10 % (Glucose, Saccharose, Glycerol) und 40-55 % (Pflanzenöle, Alkan) liegt. In der Literatur beschriebene Mutantenstämme von Y. lipolytica besitzen ein von Wildtypstämmen abweichendes Produktmuster und können sowohl weniger (2-5 % auf Glucose, 5-10 % Alkan und Pflanzenöl) als auch mehr ICS (15-35 % Glu¬cose, 65-75 % Alkan, Ethanol bzw. Pflanzenöl) sekretieren. Die gezielte Überexpression des für die Isocitratlyase codierenden Gens ICL1 durch die Erhöhung der Kopiezahl führte zu einer drastischen Erhöhung der Enzymaktivität in den entsprechenden ICL1 multicopy Transformanden (10-15fach gegenüber Wildtyp) aufgrund des Gen-Dosis-Effektes. Auf den getesteten hydrophilen C-Quellen Glucose, Glycerol und Saccharose verringerte sich der ICS-Anteil von durchschnittlich 10-12 % auf 3-5 %, auf den hydrophoben C-Quellen Hexadecan und Sonnenblumenöl sogar von durchschnittlich 40-55 % auf Werte um 5-10 %. Im Ergebnis dieser Untersuchungen entstand ein Patent (DE10333144A1), welches ein Verfahren zur Gewinnung von CS mit einer genetisch veränderten Hefe Y. lipolytica beschreibt. Die Zerstörung des Leserahmens des ICL1 Gens in Mutantenstämmen bewirkte das Ausbleiben der Synthese einer funktionell aktiven Isocitratlyase, was den Verlust der Fähigkeit zur Verwertung gluconeogenetischer C-Quellen wie Ethanol, Alkan und Pflanzenölen zur Folge hatte. Auf Glucose bzw. Glycerol zeigten diese Mutantenstämme im Vergleich zum Wildtypstamm jedoch nur eine geringe Erhöhung des ICS-Anteils um durchschnittlich 2-5 Prozentpunkte. Die Zerstörung des Leserahmens des IDP2 Gens, codierend für die NADP-abhängigen Isocitratdehydrogenase, führte zur Glutamat-Auxotrophie des entsprechenden Mutantenstammes auf allen getesteten C-Quellen. In der Produktbildung zeigte diese Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm eine Verringerung des ICS-Anteils um durchschnittlich 2-4 Prozentpunkte. Es konnte gezeigt werden, dass Saccharose ein geeignetes Substrat zur Gewinnung von CS mit rekombinanten Stämmen von Y. lipolytica darstellt, die das für die Invertase codierende SUC2 Gens aus Saccharomyces cerevisiae exprimieren. Natürlicherweise kann Y. lipolytica diesen Zucker aufgrund des Fehlens des Enzyms Invertase nicht verwerten. Im Schüttelkolben wurden aus 100 g/l Saccharose unter nicht optimierten Bedingungen bereits 56 g/l CS+ICS gewonnen. Nach der Optimierung durch die Reduktion des für die Invertaseexpression durch pXPR2 notwendigen Peptonanteils von 1,7 auf 0,4 g/l erhöhte sich die Produktkonzentration auf 77 g/l. Die Übertragung des Produktionsprozesses in den Bioreaktor hatte die Verdopplung der Produktbildungsraten (RZA von 0,4 auf 0,85 g/l*h, r von 46 auf 89 mg/g*h) zur Folge, bedingt durch die Aufhebung der Sauerstofflimitation. Die Steigerung der Invertaseaktivität, die sich unter Bioreaktorbedingungen als ein Limi¬tationsfaktor her¬ausstellte, konnte durch die Anhebung des pH-Wertes von 5,0 auf 6,0 bzw. 6,8 er¬reicht werden. Dadurch konnten die Produktbildungsrate RZA um bis zu 80 % von 0,42 auf 0,76 g/l*h, die biomassespezifische Produktbildungsge¬schwin¬digkeit r um bis zu 70 % von 0,06 auf 0,1 g/g*h und die Ausbeute um bis zu 64 % von 0,5 auf 0,82 g/g gesteigert werden. Einen weiteren Limitationsfaktor für den CS-Bildungsprozess aus Saccharose stellt bei ausreichender Invertaseexpression offenbar die Aufnahme von Glucose und Fructose dar. Die Hefe Y. lipolytica zeigte höchste Produktbildungsraten aus Pflanzenölen, wie Sonnenblumen- oder Rapsöl, als nachwachsende Rohstoffe. Um zu prüfen, ob die Produktivität der CS-Bildung aus Pflanzenölen mit Y. lipolytica gesteigert werden kann, sollte die Triglyceridverwertung durch die Erhöhung der extrazellulären Lipaseaktivität verbessert werden. Dazu wurden zum einen Insertionsmutantenstämme, die auf eine erhöhte extrazelluläre Lipaseaktivität im Plattentest hin selektiert wurden, charakterisiert. Zum anderen wurde das für die extrazelluläre Lipase codierende LIP2 Gen in Y. lipolytica überexprimiert. Die erhaltenen LIP2 multicopy Transformanden zeigten eine bis zu 400fach erhöhte Lipaseaktivität im Vergleich zum Wildtypstamm (von 400 U/l auf bis zu 150000 U/l). Eine Verbesserung der Triglyceridverwertung aufgrund der Erhöhung der extrazellulären Lipaseaktivität in den untersuchten Insertionsmutanten und LIP2 multicopy Transformanden wurde nicht festgestellt. Die erhaltenen Daten für die Produktbildungsrate RZA (0,9-1,1 g/l*h), die biomassespezifische Produktbildungsgeschwindigkeit r (0,08-0,14 g/g*h) und die Ausbeuten (1,3-1,5 g/g) waren innerhalb der untersuchten Stämme vergleichbar und ließen keine verbesserte Produktbildung erkennen. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt liegt offenbar nicht bei der Hydrolyse der Triglyceride durch Lipasen, sondern bei der Aufnahme und dem Transport der Fettsäuren und/oder deren Katabolismus.

Les levures non conventionnelles, dont Yarrowia lipolytica, sont devenues desusines cellulaires attractives pour la production de protéines recombinantes. Lasélection de promoteurs régulés impliqués dans le métabolisme de substratshydrophobes est d'un grand intérêt pour une telle application. Dans ce cadre,l’objectif de ce projet est de mieux comprendre la régulation des promoteurs desgènes POX2 et LIP2 dans le but d’améliorer la production de protéinesrecombinantes chez Y. lipolytica.D’un point de vue biotechnologique, l'analyse à l’échelle cellulaire est devenueune approche répandue pour l’analyse et l’optimisation des bioprocédés. Ainsi,l'objectif de la première partie de ce projet vise le développement d’une méthoded’analyse en ligne des paramètres de culture Y. lipolytica dans un milieu contenantde l’acide oléique. Cette technique consiste au couplage d’un bioréacteur à uncytomètre en flux via une interface d’échantillonnage automatique. Cetteméthodologie a conduit principalement à une analyse rapide de la croissancecellulaire, de l'accumulation des lipides, du dimorphisme ainsi qu’à l'analyse duniveau d’induction des promoteurs chez Y. lipolytica.Les systèmes d’expression basés sur les promoteurs LIP2 et POX2 sont difficilesà manipuler, principalement en raison de l’utilisation de substrats insolubles dansl’eau (acide oléique) comme inducteur. Dans ce travail, il a été clairement démontréque pLIP2 est le promoteur de choix à utiliser pour développer un procédé deproduction de protéines recombinantes par culture de Y. lipolytica dans un milieucomplexe. De plus, l’utilisation d’un mélange acide oléique-glucose 60/40 (w/w) aconduit à une amélioration du niveau d’induction du promoteur LIP2 par un facteurde 10 par rapport à utilisation l'acide oléique. De plus, l’analyse à l’échelle cellulairemontre que ces deux substrats sont co-consommés par les cellules.Enfin, la dernière partie de cette thèse a eu pour but d'étudier la régulation dupromoteur LIP2 par rapport à la transition dimorphique. Nos résultats ont clairement montré que le changement morphologique chez Y. lipolytica n'a pas d'impact sur larégulation de pLIP2.L’ensemble de ces études a conduit à une meilleure compréhension de laphysiologie de Y. lipolytica, soulignant son potentiel avéré de production desprotéines recombinantes. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les composés hydrophobes sont connus comme des sources de carbone qui peuvent être utilisées par les levures comme Yarrowia lipolytica pour de multiples applications. Ces composés causent parfois des perturbations aux levures mais sont aussi rapportés comme conférant aux cellules une certaine résistance contre les stress environnementaux. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié le rôle de l'oléate de méthyle comme source de carbone sur la résistance de la levure Y. lipolytica en réponse au choc d'un composé amphiphile, la -dodécalactone, et au stress thermique. Les résultats obtenus montrent que les cellules ayant poussé sur oléate sont beaucoup plus résistantes au choc lactone ainsi qu'au stress thermique que les cellules ayant poussé sur glucose. L'action de la lactone se trouve au niveau de la membrane où elle cause une fluidification membranaire et une déplétion de stérols qui sont considérés comme la cause de la mort cellulaire. Ce travail met en évidence le rôle des corps lipidiques dans la réponse cellulaire qui se manifeste de différentes manières en réponse à ces stress. Une accumulation des corps lipidiques est importante pour la résistance de la cellule aux stress. Les cellules ayant poussé sur glucose transforment leur stérol libre en esters de stéryle pour former les corps lipidiques en réponse au choc lactone, ce qui augmente leur sensibilité. Tandis que les cellules ayant poussé sur oléate qui ont accumulé des corps lipidiques pendant leur croissance ont tendance à convertir leurs esters de stéryle en stérol libre pour compenser la déplétion de stérol membranaire causée par la lactone ce qui diminue leur sensibilité. L'homéostasie de l'ergostérol, liée à la présence de corps lipidiques, semble donc jouer un rôle clé dans la résistance cellulaire à ces stress. Ce travail relève aussi que la présence de lipides modifie le processus de mort cellulaire programmée de Y. lipolytica en réponse à un stress thermique.

University, Diss., 2004--Frankfurt (Main). / Zsfassung in engl. und dt. Sprache.

University, Diss., 2005--Frankfurt (Main). / Zsfassung in engl. und dt. Sprache.

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L’érythritol est un polyol aux propriétés édulcorantes utilisé comme substitut de sucre par l’industrie agroalimentaire. Le but principal du projet est l’amélioration du procédé de production d’érythritol par génie métabolique. L’idée est de construire des souches surexprimant les gènes liés à la voie de synthèse de l’érythritol. L’objectif principal est donc d’identifier les gènes clés permettant d’augmenter la synthèse d’érythritol et d’évaluer cette dernière en bioréacteur.Parallèlement à cela, un autre objectif est d’identifier les gènes liés au catabolisme de l’érythritol. En effet, Y. lipolytica est capable de produire de l’érythritol, mais aussi de le reconsommer en cas d’absence d’autre source de carbone. L’objectif est donc d’identifier les gènes liés au catabolisme de l’érythritol afin de les déléter, et ainsi obtenir une souche capable de produire de grandes quantités d’érythritol sans le reconsommer en fin de culture.Les résultats obtenus ont permis d’identifier les étapes clés de la voie de synthèse de l’érythritol et d’obtenir des souches à haut rendement et productivité par génie génétique. Par ailleurs, deux gènes de la voie de dégradation de l’érythritol ont pu être identifiés pour la première fois chez une levure. En combinant la surexpression de gènes liés à la synthèse de l’érythritol et la délétion de gènes liés à sa dégradation, une souche présentant une productivité 74% plus importante que la souche sauvage a pu être créée. Par ailleurs, une souche capable de convertir l’érythritol en érythrulose, un autre composé d’intérêt, a également pu être construite. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Diploma thesis was aimed at studying of lipolytic activity of seven microorganisms, at which this activity was previously assumed or already confirmed. Theoretical part deals with the general characteristics of lipoyltic enzymes, specifics of microbial lipases and their industrial application, with an emphasis on food industry. Experimental part deals with the study of seven microorganisms and their lipolytic activity at the presence of a carbohydrate (glucose) or a lipid (canola oil) or both, as a source of carbon. For further testing were singled out Rhodotorula minuta nad Yarrowia lipolytica. This yeasts were subsequently tested for lipolytic aktivity at the presence of different vegetable oils (olive, sunflower, canola oil and waste cooking oil), nitrogen sources of organic and inorganic origin (urea, yeast extract, amonnium chloride, amonnium sulfate) and also a addition of detergent, which is commonly used in food industry or other food facilities.

Yarrowia lipolytica é uma levedura estritamente aeróbia e oleaginosa, pertencente ao filo Ascomycota. Atualmente é uma das espécies de levedura não convencional mais estudadas para aplicações biotecnológicas. Se comparada a outras leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, observam-se notáveis distinções relacionadas a sua fisiologia, genética e filogenia. É conhecida sua capacidade de excretar altas quantidades de ácidos orgânicos (ácidos cítrico, isocítrico, cetoglutárico e pirúvico) e de secretar diferentes enzimas (lipases, proteases etc.), permitindo a degradação de diferentes substratos, incluindo os de caráter hidrofóbico. O presente trabalho teve como objetivo implementar técnicas de cultivo em meio sólido ou líquido para a levedura Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682, que permitissem avaliar sua capacidade em utilizar diferentes fontes de carbono, além de calcular os principais parâmetros da fisiologia celular, como velocidades específicas e fatores de conversão. Nos cultivos em meio sólido, verificou-se que esta levedura apresenta fraco ou nenhum crescimento nas fontes de carbono sacarose, xilose, citrato e acetato. Além disto, observou-se que a tiamina é fator de crescimento essencial ao desenvolvimento desta levedura quando cultivada em glicose e glicerol. Verificou-se também que esta linhagem apresenta maior tolerância ao NaCl, se comparada à linhagem Y. lipolytica W29 (tradicionalmente empregada nos estudos acadêmicos). Nos cultivos em meio líquido, foi estabelecida uma composição de meio de cultivo totalmente definido, que permitiu o crescimento desta levedura com velocidade específica máxima de 0,35 h-1 em glicose e 0,46 h-1 em glicerol, como únicas fontes de carbono. Nestes cultivos, os fatores de conversão de substrato a células, durante a fase exponencial de crescimento, foram 0,32 g de massa seca de células/g glicose e 0,48 g de massa seca de células/g glicerol. Durante os cultivos em meio líquido, que foram realizados a 28 oC e 200 rotações por minuto em incubador rotativo, empregando frascos do tipo erlenmeyer com deflectores, fechados com algodão e um quinto do volume ocupado com meio líquido e 2,5 g.l-1 iniciais da fonte de carbono, não foi observada a formação de nenhum metabólito extracelular, o que é indicativo de um metabolismo energético puramente respiratório. Nestas condições, usando-se ureia como fonte de nitrogênio, o pH permaneceu estável do início ao final dos cultivos. Observou-se também que a levedura estudada não é capaz de crescer em pH menor que 2,0. / Yarrowia lipolytica is a dimorphic, strictly aerobic and oleaginous yeast belonging to the phylum Ascomycota. It is currently one of the non-conventional yeast species most studied for biotechnological applications. If compared to other yeasts, such as S. cerevisiae, notable distinctions are observable related to its physiology, genetics and phylogeny. It is well known for its ability to secrete high quantities of organic acids (citric acid, isocitric acid, ketoglutaric acid and pyruvic acid) and innate ability to secrete various enzymes (lipases, proteases etc.), which allows the species to degrade different substrates, including hydrophobic ones. The present work aimed at the implementation of cultivation techniques in solid or liquid media for the yeast Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682, enabling to assess its ability to assimilate different carbon sources, and to calculates the main parameters of cellular physiology, such as specific growth rate and specific yields. In solid media assays, it was found that Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 presents a weak to almost null growth when sucrose, xylose, citrate and acetate are used as sole carbon sources. Furthermore, it was observed that thiamine is an essential growth factor for the proper assimilation of the carbon sources glucose and glycerol. Response towards osmotic stress was assessed in complex solid media, in which the strain Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 exhibited higher halotolerance, up to 1,0 M NaCl, if compared to the other strain Yarrowia lipolytica W29 (traditionally employed in academic studies). A defined liquid medium composition was adapted, enabling the assessment of the specific growth rates for both strains, of which Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 exhibited specific growth rates of 0.35 h-1 on glucose and 0.46 h-1 on glycerol, when used individually as sole carbon sources. On those assays, the substrate to biomass yields, during the exponential growth phase, was 0.32 g cell dry weight/g glucose and 0.48 g cell dry weight/g glycerol. During the cultivations in liquid medium, which were carried out in thermostatted orbital shaker incubator at 200 rpm and 28 oC, employing baffled cotton capped erlenmeyer flasks with a fifth of its volume occupied with the growth medium and 2.5 g.l-1 of the carbon source of choice, it was not observed any extracellular metabolic formation, indicating a pure respiratory metabolism. The addition of urea as nitrogen source was crucial at maintaining a stable pH during the whole cultivations. It was also observed that the studied yeast strains are not capable of growing at a pH lower than 2.0.

Yarrowia lipolytica é uma levedura estritamente aeróbia e oleaginosa, pertencente ao filo Ascomycota. Atualmente é uma das espécies de levedura não convencional mais estudadas para aplicações biotecnológicas. Se comparada a outras leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, observam-se notáveis distinções relacionadas a sua fisiologia, genética e filogenia. É conhecida sua capacidade de excretar altas quantidades de ácidos orgânicos (ácidos cítrico, isocítrico, cetoglutárico e pirúvico) e de secretar diferentes enzimas (lipases, proteases etc.), permitindo a degradação de diferentes substratos, incluindo os de caráter hidrofóbico. O presente trabalho teve como objetivo implementar técnicas de cultivo em meio sólido ou líquido para a levedura Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682, que permitissem avaliar sua capacidade em utilizar diferentes fontes de carbono, além de calcular os principais parâmetros da fisiologia celular, como velocidades específicas e fatores de conversão. Nos cultivos em meio sólido, verificou-se que esta levedura apresenta fraco ou nenhum crescimento nas fontes de carbono sacarose, xilose, citrato e acetato. Além disto, observou-se que a tiamina é fator de crescimento essencial ao desenvolvimento desta levedura quando cultivada em glicose e glicerol. Verificou-se também que esta linhagem apresenta maior tolerância ao NaCl, se comparada à linhagem Y. lipolytica W29 (tradicionalmente empregada nos estudos acadêmicos). Nos cultivos em meio líquido, foi estabelecida uma composição de meio de cultivo totalmente definido, que permitiu o crescimento desta levedura com velocidade específica máxima de 0,35 h-1 em glicose e 0,46 h-1 em glicerol, como únicas fontes de carbono. Nestes cultivos, os fatores de conversão de substrato a células, durante a fase exponencial de crescimento, foram 0,32 g de massa seca de células/g glicose e 0,48 g de massa seca de células/g glicerol. Durante os cultivos em meio líquido, que foram realizados a 28 oC e 200 rotações por minuto em incubador rotativo, empregando frascos do tipo erlenmeyer com deflectores, fechados com algodão e um quinto do volume ocupado com meio líquido e 2,5 g.l-1 iniciais da fonte de carbono, não foi observada a formação de nenhum metabólito extracelular, o que é indicativo de um metabolismo energético puramente respiratório. Nestas condições, usando-se ureia como fonte de nitrogênio, o pH permaneceu estável do início ao final dos cultivos. Observou-se também que a levedura estudada não é capaz de crescer em pH menor que 2,0. / Yarrowia lipolytica is a dimorphic, strictly aerobic and oleaginous yeast belonging to the phylum Ascomycota. It is currently one of the non-conventional yeast species most studied for biotechnological applications. If compared to other yeasts, such as S. cerevisiae, notable distinctions are observable related to its physiology, genetics and phylogeny. It is well known for its ability to secrete high quantities of organic acids (citric acid, isocitric acid, ketoglutaric acid and pyruvic acid) and innate ability to secrete various enzymes (lipases, proteases etc.), which allows the species to degrade different substrates, including hydrophobic ones. The present work aimed at the implementation of cultivation techniques in solid or liquid media for the yeast Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682, enabling to assess its ability to assimilate different carbon sources, and to calculates the main parameters of cellular physiology, such as specific growth rate and specific yields. In solid media assays, it was found that Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 presents a weak to almost null growth when sucrose, xylose, citrate and acetate are used as sole carbon sources. Furthermore, it was observed that thiamine is an essential growth factor for the proper assimilation of the carbon sources glucose and glycerol. Response towards osmotic stress was assessed in complex solid media, in which the strain Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 exhibited higher halotolerance, up to 1,0 M NaCl, if compared to the other strain Yarrowia lipolytica W29 (traditionally employed in academic studies). A defined liquid medium composition was adapted, enabling the assessment of the specific growth rates for both strains, of which Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 exhibited specific growth rates of 0.35 h-1 on glucose and 0.46 h-1 on glycerol, when used individually as sole carbon sources. On those assays, the substrate to biomass yields, during the exponential growth phase, was 0.32 g cell dry weight/g glucose and 0.48 g cell dry weight/g glycerol. During the cultivations in liquid medium, which were carried out in thermostatted orbital shaker incubator at 200 rpm and 28 oC, employing baffled cotton capped erlenmeyer flasks with a fifth of its volume occupied with the growth medium and 2.5 g.l-1 of the carbon source of choice, it was not observed any extracellular metabolic formation, indicating a pure respiratory metabolism. The addition of urea as nitrogen source was crucial at maintaining a stable pH during the whole cultivations. It was also observed that the studied yeast strains are not capable of growing at a pH lower than 2.0.