Orientador: Francisco Maugeri Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T13:20:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goldbeck_Rosana_M.pdf: 985115 bytes, checksum: 293c51120ad7c4857c9bff41ab4e2724 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Lipases (E.C.3.1.1.3) constituem um importante grupo de enzimas definidas como carboximetilesterases que catalisam a hidrólise de cadeias longas de acilgliceróis na interface água-óleo. Estão amplamente distribuídas na natureza estando presentes em animais e vegetais, podendo ser produzidas por microrganismos como fungos e bactérias. As lipases apresentam promissoras aplicações comerciais devido a sua estabilidade, seletividade, larga especificidade por substratos e capacidade de síntese orgânica. Embora os estudos científicos tenham se concentrado mais na aplicação das lipases, alguns grupos de pesquisa se dedicam também ao isolamento de microrganismos produtores de lipase, em busca de novas enzimas com diferentes propriedades e especificidades. Este trabalho teve como objetivo explorar uma classe de microrganismos pouco utilizada para a produção de lipases, que são as leveduras. Assim, a partir de leveduras silvestres isoladas de diversas regiões do país, selecionaram-se cepas produtoras de lipase, que foram em seguida estudas e caracterizadas. Primeiramente, realizou-se uma triagem inicial a partir de 372 leveduras isoladas e selecionaram-se aquelas que apresentam capacidade de produção de lipase. Esta seleção foi feita através da formação de um halo transparente ao redor das colônias quando cultivadas em placas contendo 0,5% de peptona, 0,3% de extrato de levedura, 2% de agar e 0,1% de tributirina, pH 6,0 a 30ºC por 48 horas. Após pré-selecionadas, as leveduras foram cultivadas em meio líquido contendo: 0,5% de peptona, 0,3% de extrato de levedura e 1% de óleo de oliva, pH 6,0, temperatura de 30ºC durante 48 horas sob agitação de 150 rpm para posterior determinação da atividade lipolítica. Em uma segunda etapa, após a seleção dessas leveduras, a lipase foi caracterizada quanto à especificidade de substrato, perfil de pH e temperatura, estabilidade térmica e de pH e capacidade biocatalítica de síntese orgânica. A especificidade de substrato da enzima foi realizada através da determinação da atividade lipolítica utilizando diferentes triglicerídeos (C4, C8, C10, C14, C18:1) como substratos. Para verificar a atividade catalítica, foi realizada síntese de ésteres em meio orgânico. Os ésteres formados durante a reação foram quantificados por cromatografia gasosa. Na etapa de seleção, das 372 leveduras silvestres estudadas, 3 cepas foram selecionadas com potencial para produção de lipase. Estas foram caracterizadas e apresentaram comportamentos distintos. Para a cepa AC02, temos como condições ótimas para a reação enzimática pH 7,0 e temperatura 44ºC, para o microrganismo AAV1, também temos como ótimo o pH 7,0, porém, uma temperatura um pouco mais elevada, 47ºC, já para a levedura AY3, as condições ótimas de temperatura e pH foram 37ºC e 6,6 respectivamente. Quanto à especificidade de substrato, a enzima proveniente do microrganismo AY3 apresentou atividade lipolítica superior em tributirina (C4) e tricaprilina (C8) quando comparada com óleo de oliva, demonstrando maior especificidade por triglicerídeos de cadeia curta e média. As três cepas estudadas apresentaram capacidade biocatalítica, no entanto foram registradas maiores porcentagens de esterificação quando utilizado etanol ao invés de heptanol como componente reacional. Portanto, a procura denovas lipases através de programas de seleção de microrganismos produtores é de fundamental importância para ampliar ainda mais o campo de aplicação dessas enzimas / Abstract: Lipases (E.C.3.1.1.3) consists of an important group of enzymes defined as carboxymethylesterases that catalyze the hydrolysis of long chains of acylglycerols in the water-oil interface. They are thoroughly distributed in the nature being present in animals and vegetables and can be produced by microorganisms such as fungal and bacteria. Lipase presents a promising commercial application because of their stability, selectivity, large specificity for substrates and capacity of organic synthesis. Although the scientific studies have been more concentrated in the application of lipases, some research groups are dedicated to the isolation of lipase producer microorganisms, with the goal of finding new enzymes with different substrate specificities. In face of that, this work had as main objective to select wild lipase producer yeasts isolated from different areas of the country, as well as study the specificity of the enzyme. At first, a selection of wild yeasts that presented lipase production capacity was accomplished. The strains that produce lipase were selected considering the formation of a transparent halo around of the colonies when cultivated in plates containing 0.5% of peptone, 0.3% of yeast extract, 2% of agar and 0.1% of tributyrin, at pH 6.0 and 30ºC for 48 hours. After being previously selected, the yeasts were then cultivated in shacked flasks in medium containing 0.5% of peptone, 0.3% of yeast extract and 1% of olive oil also at pH 6.0 and 30ºC for 48 hours, under agitation of 150 rpm for subsequent determination of the lipolytic activity. At a second stage, after the selection of the yeasts, the lipases were characterized concerning substrate specificity, pH and temperature profile, thermal and pH stability and the biocatalyst capacity for synthesis in organic media. The enzyme specificities for substrates were accomplished throughout the determination of the activity using different triglycerides (C4, C8, C10, C14, C18:1) as substrate. To verify the catalytic lipolytic activity, the synthesis of esters were accomplished in organic medium. The esters formed during the reaction were quantified by gas chromatography. In the selection stage, of the 372 studied wild yeasts, 3 strains were selected with potential for lipase production. These enzymes were characterized and they presented different behavior. For the strain AC02, the optimum conditions for the enzymatic reaction were pH 7.0 and 44ºC, for the microorganism AAV1, the pH 7.0 was also better however the optimum temperature was a little higher, 47ºC, and for the yeast AY3, the optimum conditions for temperature and pH were 37ºC and 6.6 respectively. For substrate specificity, the enzyme originated from the microorganism AY3 presented superior lipolytic activity in tributyrin (C4) and tricaprylin (C8) when compared with olive oil, demonstrating larger specificity for triglycerides of short and medium chain. The three strains studied presented biocatalyst capacity, however larger esterification percentages were registered when ethanol was used as component of the reaction instead of heptanol. Hence, the search of new lipases through programs of selection of microorganisms is of fundamental importance to enlarge the field of application of those enzymes / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T15:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Motta_FelipeBastos_M.pdf: 972824 bytes, checksum: a462e688ab46d2def7974c05146d274b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A endo-1,4-ß-xilanase (E.C. 3.2.1.8), comumente chamada de xilanase, possui grande aplicação em diferentes tipos de indústrias tais como a de ração animal, alimentos, têxteis, de papel, de produção de etanol a partir de biomassa, entre outras. Isso se deve ao fato de que esta enzima atua na hidrólise da xilana, o segundo mais abundante polissacarídeo encontrado na natureza, que está presente ligado a hemicelulose da parece celular de plantas. O objetivo deste trabalho foi selecionar, através do método de screening em placas de Petri, e avaliar a atividade enzimática de leveduras silvestres isoladas de diversas regiões do Brasil (Mata Atlântica, Floresta Amazônica, Cerrado e Pantanal) quanto à produção de xilanase. Para o screening em placas, utilizou-se um meio de cultura no qual a única fonte de carbono era a xilana para induzir a produção da enzima. De um total de 349 microrganismos analisados, foram obtidas 84 cepas produtoras, porém somente 37 possuíam um índice de relação enzimática (diâmetro do halo descolorido / diâmetro da colônia) maior que 2,5. Em função deste resultado prosseguiu-se com a seleção dos melhores microrganismos para a produção da enzima em meio líquido. Após observações preliminares apenas 9 cepas obtiveram um crescimento satisfatório em meio líquido a 30ºC e 150 rpm. Estes foram avaliados em dois meios de culturas diferentes em relação à atividade enzimática do caldo enzimático à 50ºC por 5 min em shaker. Dentre estes, os microrganismos AAD5 e AY10 se destacaram por apresentarem a atividade enzimática em torno de 2 µmol/mL.min . Posteriormente, foi realizada a caracterização das enzimas produzidas, sendo que a proveniente do microrganismo AAD5 possui condições ótimas na faixa de 57,5 ¿ 67,5 ºC e pH entre 4,7 ¿ 5,5, além de meia vida de 21,33 horas a 52ºC e pH 5,3, com vmax de 1,77 µmol/mL.min e Km de 0,44 g/L. Já a enzima produzida pela cepa AY10 possui condições ótimas na faixa de pH entre 4,8 ¿ 4,1 à temperatura de 80°C, além de meia vida de 11,21 horas a 72ºC e pH 5,3, com vmax de 5,47 µmol/mL.min e Km de 1,37 g/L. Estes resultados demonstram o potencial de aplicação de leveduras na produção de xilanase, porém, para as cepas estudadas, há a necessidade de purificação das enzimas produzidas para que estas sejam aplicadas industrialmente / Abstract: Endo-1,4-ß-xylanase (E.C. 3.2.1.8), commonly called xylanase, has great application in different types of industries such as feed, food, textiles, paper, ethanol from biomass, among others. These enzymes act in hydrolysis of the xylan, one of the most abundant polysaccharides found in the nature, present in cell plants linked to the hemicelullose. The main goal of this work was to select, through a screening method using Petri dishes, and to evaluate the enzymatic activity of isolated wild yeasts from several brazilian regions (Atlantic Forest, Amazonian Forest, Cerrado and Pantanal) about the production of xylanase. For the screening in Petri dishes, the culture medium used has xylan as the only carbon source to induce the production of the enzyme. From 349 evaluated microorganisms, 84 could produce xylanase, although only 37 showed an enzymatic ration (diameter of the undye halo/diameter of the colony) higher than 2.5. And, after initial assays in submerged method, 9 strains showed a satisfactory growth at 30ºC and 150 rpm. Among them, the microorganisms AAD5 and AY10 presented a higher potential, with the enzymatic activity above 2 µmol/mL.min. The characterization of the produced enzymes was carried out and the one produced by the strain AAD5 has, as optimal conditions, temperature between 57.5 ¿ 67.5 ºC and pH 4.7 ¿ 5.5. Also, it was shown 21.33 hours of half-life at 52ºC and pH 5.3, with vmax of 1.77 µmol/mL.min and Km of 0.44 g/L. The enzyme produced by the strain AY10 has, as optimal conditions, pH between 4.8 ¿ 4.1 and temperature around 80ºC. The half-life of the enzyme was 11.21 hours at 72ºC and pH 5.3, with vmax of 5.47 µmol/mL.min and Km of 1.37 g/L. These results demonstrate the potential application of the yeasts for xylanase production, although, for those enzymes, further works are necessary to establish the actual industrial and technical potentialities / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos