Afin de survivre dans un environnement fluctuant, les plantes ont développé la capacité de percevoir et de répondre à des stimuli externes divers et parfois extrêmes. Les sollicitations mécaniques jouent un rôle important au cours du développement des plantes et un nombre croissant d’études s’intéresse à la mécanoperception. Le dessin de la voie de signalisation entre la perception du signal et la régulation des gènes précoces reste incertain. Un modèle de la mécanoperception, proposant que la variable mécanoperçue soit la déformation de la membrane, a été vérifié à l’échelle de la plante entière mais doit être validé au niveau cellulaire. Pour cela, et afin d’identifier les acteurs moléculaires précoces de la réponse à la sollicitation mécanique, nous avons analysé la régulation du gène mécanosensible PtaZFP2 sur cultures cellulaires de peuplier. Le gène PtaZFP2 appartient à la famille multigénique des Q-type C2H2-ZFPs codant des facteurs de transcription putatifs et comprenant 16 membres chez le peuplier. Une analyse phylogénétique et l’analyse de l’expression de ces gènes en réponse à différents stress abiotiques ont montré l’existence de deux groupes phylogénétiques. Ils se différencient par des doigts de zinc caractéristiques et deux nouveaux motifs protéiques (MALEAL et LVDCHY) spécifiques à chacun des groupes. Cette étude nous a également permis d’identifier un autre gène, PtaZFP1, proche phylogénétiquement de PtaZFP2 et fortement induit par une flexion. Après avoir mis au point un système de sollicitation mécanique sur cultures cellulaires, nous avons démontré l’implication du calcium, des calmodulines, des jasmonates et du H2O2 dans l’induction précoce du gène PtaZFP2 par un signal mécanique. Nos travaux suggèrent également l’existence d’une interaction entre la NADPH oxydase (enzyme impliquée dans la production d’EAO) et les calmodulines en amont de PtaZFP2. Finalement, des résultats préliminaires suggèrent une localisation nucléaire de cette protéine et une accumulation transitoire au sein des tiges 2h après une flexion. Les outils moléculaires produits au cours de ce travail (anticorps, protéines recombinantes) permettront de comprendre le rôle de PtaZFP2 dans cette voie de signalisation. / The ability of plants to perceive and respond to various and even extreme environmental stimuli is crucial for their survival in a fluctuant environment. Mechanical solicitations play a key role during plant development and an increasing number of studies are dedicated to mechanosensing. The way how plants sense mechanical signals and bring about the changes in gene expression is still unknown. Recently, a model of mechanosensing, suggesting that the physical variable perceived by cells is the plasma membrane strain, has been confirmed at the whole plant scale but remains to be validated at the cellular level. In this aim and to identify the molecular components involved in the early steps of the mechanical signaling pathway, the regulation of the mechanosensitive gene PtaZFP2 was analyzed in poplar cells cultures. The mechanosensitive PtaZFP2 gene belongs to the multigenic Q -type C2H2 -ZFPs family encoding putative transcription factors, consisting of 16 members in poplar. A phylogenetic study and the expression analysis of several of these genes in response to abiotic stresses, allowed us to detect two phylogenetic groups. These two groups are distinguished essentially on their different signatures of their two zinc finger domains and on the two additional conserved motifs MALEAL and LVDCHY, specific to each phylogenetic group. Another gene of the Q -type C2H2 -ZFP family, PtaZFP1, related to PtaZFP2, was shown to be regulated by bending. After several adjustments to apply a mechanical solicitation to cells cultures, such treatments revealed the involvement of calcium, calmodulins, jasmonic acid and H2O2 in the rapid induction of PtaZFP2 gene expression in response to mechanical stress. Furthermore, our data showed an interaction between an NADPH oxidase enzyme (involved in ROS production) and calmodulins upstream of PtaZFP2. Finally, preliminary results suggested a nuclear localization of PtaZFP2 and a transient accumulation of this protein in the stem 2 hours after bending. The molecular tools that have been produced during this work (antibody, recombinant protein) will be used to study the role of PtaZFP2 in the mechanical signaling pathway.

<p>Genomic imprinting marks a subset of autosomal loci expressed in parent of origin-dependent monoallelic expression in a non-Mendelian fashion. To restore totipotency and to reset the imprint according to the sex of the individual, the mark must be erased during germline development. The imprinted <i>Igf2-H19</i> loci located distally on chromosome 7 in mouse and 11p15.5 in human, share common regulatory elements that regulate differential expression. Where the <i>H19 </i>is silenced when paternally inherited, the <i>Igf2</i> is silenced when maternally inherited. </p><p>The differentially methylated 5'-flank of <i>H19</i> gene, termed imprinting control region (ICR), shown to display a unique chromatin organisation harbours hypersensitive sites in linker regions flanked by positioned nucleosomes on the maternal allele. This unique chromatin conformation functions as a methylation-sensitive and unidirectional chromatin insulator, which later was found to depend on the chromatin insulator protein CTCF. </p><p>The <i>H19</i> ICR exhibits default-silencing functions in promoter-proximal positions. The maximal distance between the <i>H19</i> ICR and the promoter of the reporter gene required for this effect was 1.2 ± 0.3kb which can be compared to the 1.9 kb distance between the endogenous <i>H19 </i>ICR and <i>H19</i> promoter. Results suggest that the <i>H19</i> ICR adopts a chromatin conformation that must be separated by a minimal distance from pivotal <i>cis</i>-regulatory elements to avoid adverse effects on neighbouring promoters. </p><p>Poly(ADP-ribosy)lation represents a novel post-translational epigenetic mark that segregates with exclusively the maternal derived <i>H19</i> ICR and associated with factors that interact with the CTCF target sites. CTCF is itself poly(ADP-ribosy)lated and the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor 3-aminobenzamide relieves the insulator function of the <i>H19</i> ICR. </p><p>Designed zinc finger proteins were applied to examine if epigenetic marks provided an obstacle for targeted activation and silencing. The zinc finger protein ZFP809 with activator/repressor domain able to efficiently activate/silence the <i>IGF2</i> target. Murine hybrid cell lines of human chromosome 11, demonstrated that the ZFP809 overcame the epigenetic marks that repressed maternal <i>IGF2</i> and paternal <i>H19</i> allele, respectively. Results suggested that imprinted genes are not normally exposed to strong <i>cis</i>-regulatory elements and that the designed ZFPs can be exploited to develop a therapeutic method for rectifying epigenetic lesions.</p>

Genomic imprinting marks a subset of autosomal loci expressed in parent of origin-dependent monoallelic expression in a non-Mendelian fashion. To restore totipotency and to reset the imprint according to the sex of the individual, the mark must be erased during germline development. The imprinted Igf2-H19 loci located distally on chromosome 7 in mouse and 11p15.5 in human, share common regulatory elements that regulate differential expression. Where the H19 is silenced when paternally inherited, the Igf2 is silenced when maternally inherited. The differentially methylated 5'-flank of H19 gene, termed imprinting control region (ICR), shown to display a unique chromatin organisation harbours hypersensitive sites in linker regions flanked by positioned nucleosomes on the maternal allele. This unique chromatin conformation functions as a methylation-sensitive and unidirectional chromatin insulator, which later was found to depend on the chromatin insulator protein CTCF. The H19 ICR exhibits default-silencing functions in promoter-proximal positions. The maximal distance between the H19 ICR and the promoter of the reporter gene required for this effect was 1.2 ± 0.3kb which can be compared to the 1.9 kb distance between the endogenous H19 ICR and H19 promoter. Results suggest that the H19 ICR adopts a chromatin conformation that must be separated by a minimal distance from pivotal cis-regulatory elements to avoid adverse effects on neighbouring promoters. Poly(ADP-ribosy)lation represents a novel post-translational epigenetic mark that segregates with exclusively the maternal derived H19 ICR and associated with factors that interact with the CTCF target sites. CTCF is itself poly(ADP-ribosy)lated and the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor 3-aminobenzamide relieves the insulator function of the H19 ICR. Designed zinc finger proteins were applied to examine if epigenetic marks provided an obstacle for targeted activation and silencing. The zinc finger protein ZFP809 with activator/repressor domain able to efficiently activate/silence the IGF2 target. Murine hybrid cell lines of human chromosome 11, demonstrated that the ZFP809 overcame the epigenetic marks that repressed maternal IGF2 and paternal H19 allele, respectively. Results suggested that imprinted genes are not normally exposed to strong cis-regulatory elements and that the designed ZFPs can be exploited to develop a therapeutic method for rectifying epigenetic lesions.

Afin de survivre dans un environnement fluctuant, les plantes ont développé la capacité de percevoir et de répondre à des stimuli externes divers et parfois extrêmes. Les sollicitations mécaniques jouent un rôle important au cours du développement des plantes et un nombre croissant d'études s'intéresse à la mécanoperception. Le dessin de la voie de signalisation entre la perception du signal et la régulation des gènes précoces reste incertain. Un modèle de la mécanoperception, proposant que la variable mécanoperçue soit la déformation de la membrane, a été vérifié à l'échelle de la plante entière mais doit être validé au niveau cellulaire. Pour cela, et afin d'identifier les acteurs moléculaires précoces de la réponse à la sollicitation mécanique, nous avons analysé la régulation du gène mécanosensible PtaZFP2 sur cultures cellulaires de peuplier. Le gène PtaZFP2 appartient à la famille multigénique des Q-type C2H2-ZFPs codant des facteurs de transcription putatifs et comprenant 16 membres chez le peuplier. Une analyse phylogénétique et l'analyse de l'expression de ces gènes en réponse à différents stress abiotiques ont montré l'existence de deux groupes phylogénétiques. Ils se différencient par des doigts de zinc caractéristiques et deux nouveaux motifs protéiques (MALEAL et LVDCHY) spécifiques à chacun des groupes. Cette étude nous a également permis d'identifier un autre gène, PtaZFP1, proche phylogénétiquement de PtaZFP2 et fortement induit par une flexion. Après avoir mis au point un système de sollicitation mécanique sur cultures cellulaires, nous avons démontré l'implication du calcium, des calmodulines, des jasmonates et du H2O2 dans l'induction précoce du gène PtaZFP2 par un signal mécanique. Nos travaux suggèrent également l'existence d'une interaction entre la NADPH oxydase (enzyme impliquée dans la production d'EAO) et les calmodulines en amont de PtaZFP2. Finalement, des résultats préliminaires suggèrent une localisation nucléaire de cette protéine et une accumulation transitoire au sein des tiges 2h après une flexion. Les outils moléculaires produits au cours de ce travail (anticorps, protéines recombinantes) permettront de comprendre le rôle de PtaZFP2 dans cette voie de signalisation.