Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2001.

Mainz, Univ., Diss., 2001.

Universiẗat, Diss., 2003--Frankfurt (Main).

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Background: The response of advanced adrenocortical carcinoma (ACC) to current chemotherapies is unsatisfactory and a limited rate of response to immunotherapy was observed in clinical trials. High tumour mutational burden (TMB) and the presence of a specific DNA signature are characteristic features of tumours with mutations in the gene MUTYH encoding the mutY DNA glycosylase. Both have been shown to potentially predict the response to immunotherapy. High TMB in an ACC cell line model has not been reported yet. Design and methods: The JIL-2266 cell line was established from a primary ACC tumour, comprehensively characterised and oxidative damage, caused by a dysfunctional mutY DNA glycosylase, confirmed. Results: Here, we characterise the novel patient-derived ACC cell line JIL-2266, which is deficient in mutY-dependent DNA repair. JIL-2266 cells have a consistent STR marker profile that confirmed congruousness with primary ACC tumour. Cells proliferate with a doubling time of 41 ± 13 h. Immunohistochemistry revealed positivity for steroidogenic factor-1. Mass spectrometry did not demonstrate significant steroid hormone synthesis. JIL-2266 have hemizygous mutations in the tumour suppressor gene TP53 (c.859G>T:p.E287X) and MUTYH (c.316C>T:p.R106W). Exome sequencing showed 683 single nucleotide variants and 4 insertions/deletions. We found increased oxidative DNA damage in the cell line and the corresponding primary tumour caused by impaired mutY DNA glycosylase function and accumulation of 8-oxoguanine. Conclusion: This model will be valuable as a pre-clinical ACC cell model with high TMB and a tool to study oxidative DNA damage in the adrenal gland. / Hintergrund: Das Therapieansprechen von fortgeschrittenen Nebennierenrindenkarzinomen (ACC) unter den aktuellen Chemotherapieregimen ist nicht zufriedenstellend.Ebenfalls zeigte sich in klinischen Studien nur ein limitiertes Ansprechen auf Immuntherapien. Eine hohe Mutationslast (TMB) und das Vorhandensein einer spezifischen DNA Signatur sind charakteristisch für Tumore mit Mutationen in dem Gen MUTYH, welches die mutY-DNA-Glykosilase kodiert. Es wurde gezeigt, dass dies potentiell ein Ansprechen auf eine Immontherapie vorhersagen kann. Eine hohe Mutationslast in ein ACC Zellline konnte bis jetzt noch nicht gezeigt werden. Methoden: Die JIL--2266 Zelllinie wurde etabliert aus einem primären ACC-Tumor. Diese wurde umfänglich charakterisiert und oxidativer Schaden, welcher durch eine dysfunktionelle mutY DNA Glykosilase verursacht wird, konnte gezeigt werden. Ergebnis: Wir charakterisierten eine neue ACC Zelllinie JIL-2266, welche eine Defizienz in dem mutY DNA-Reperaturmechanismus aufweist. Die JIL-2266 Zellen weisen ein mit dem Primärtumor kongruentes STR-Profil auf. Die Zellen proliferieren mit einer Verdopplungszeit von 41 bis 13h. Die immunhisochemische Färbung zeigte eine Positivität für SF-1. In der Massenspektrometrie fand sich keine signifikante Steroidproduktion. Die JIL-2266 haben eine hemizygote Mutation in dem Tumorsuppressorgen TP53 und MUTYH. Exomsequenzierung zeigte 683 SNVs. Wir fanden erhöhten oxidativen DNA Schaden in der Zelllinie und im Primärtumor, verursacht durch eine gestörte mutY Glykosilase Funktion und eine Anhäufung von 8-Oxoguanin. Zusammenfassung: Dieses Zellinie ist ein wertvolles ACC Modell mit einer hohen Mutationslast und ein Werkzeug um oxidativen DNA Schaden in der Nebenniere zu untersuchen.

Die Implantation eines Medizinprodukts in den menschlichen Körper ruft eine Immunreaktion hervor, die zur fibrösen Einkapselung führen kann. Makrophagen in direktem Kontakt mit der Oberfläche des Implantats erfassen sensorisch den Fremdkörper und übersetzten das Signal in die Freisetzung zahlreicher löslicher Mediatoren. Das generierte Entzündungsmilieu moduliert die Heilungsreaktion und kann zur Anreicherung von Fibroblasten sowie zur Erhöhung der Matrixsyntheserate in der Wundumgebung führen. Eine dichte fibröse Kapsel um ein Medizinprodukt beeinträchtigt den Ersatz von Körperstrukturen, das Unterstützen physiologischer Körperfunktionen sowie die Effizienz einer medizinischen Therapie. Zur Identifizierung potenzieller Biomaterialkandidaten mit optimalen Eigenschaften ist jedoch eine evidenzbasierte Entscheidungsfindung notwendig und diese wiederum muss durch geeignete Testmethoden unterstützt werden. Zur Erfassung lokaler Effekte nach Implantation eines Biomaterials begründet die Komplexi-tät der ablaufenden Fremdkörperreaktion die Anwendung von Tiermodellen als Goldstandard. Die Eingliederung von in vitro Modellsystemen in standardisierte Testverfahren scheitert oft an der Verfügbarkeit validierter, verlässlicher und reproduzierbarer Methoden. Demnach ist kein standardisiertes in vitro Testverfahren beschrieben, das die komplexen dreidimensionalen Gewebsstrukturen während einer Fremdkörperreaktion abbildet und sich zur Testung über längere Kontaktphasen zwischen Blutkomponenten und Biomaterialien eignet. Jedoch können in vitro Testungen kosten- und zeiteffizienter sein und durch die Anwendung humaner Zellen eine höhere Übertragbarkeit auf den Menschen aufweisen. Zusätzlich adressiert die Präferenz zu in vitro Testmethoden den Aspekt „Reduzierung“ der 3R-Prinzipien „Replacement, Reduction, Refinement“ (Ersatz, Reduzierung, Verbesserung) von Russel und Burch (1959) zu einer bewussten und begründeten Anwendung von Tiermodellen in der Wissenschaft. Ziel von diesem Forschungsvorhaben war die Entwicklung von humanen in vitro Modellsystemen, die den Kontakt zu Blutkomponenten sowie die Reaktion des umliegenden Bindegewebes bei lokaler Implantation eines Biomaterials abbilden. Referenzmaterialien, deren Gewebsantwort nach Implantation in Tiere oder den Menschen bekannt ist, dienten als Validierungskriterium für die entwickelten Modellsysteme. Die Anreicherung von Zellen sowie die Bildung extrazellulärer Matrix in der Wundumgebung stellen wichtige Teilprozesse während einer Fremdkörperreaktion dar. Für beide Teilprozesse konnte in einem indirekten zellbasierten Modellsystem der Einfluss einer zellvermittelten Konditionierung wie die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch materialadhärente Makrophagen auf die gerichtete Wanderung von Fibroblasten sowie den Umbau eines dreidimensionalen Bindegewebsmodells aufgezeigt werden. Des Weiteren ließ sich das Freisetzungsprofil von Zytokinen durch materialständige Makrophagen unter verschiedenen Testbedingungen wie der Kontamination mit LPS, der Oberflächenbehandlung mit humanem Blutplasma und der Gegenwart von IL-4 bestimmen. Die anschließende vergleichende statistische Modellierung der generierten komplexen multifaktoriellen Datenmatrix ermöglichte die Übersetzung in eine Biomaterialbewertung. Dieses entwickelte Testverfahren eignete sich einerseits zur Validierung von in vitro Testbedingungen sowie andererseits zur Bewertung von Biomaterialien. Darüber hinaus konnte in einem dreidimensionalen Fremdkörpermodell die komplexe dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix in einer Wunde durch die Kombination unterschiedlicher Zell- und Matrixkomponenten biomimetisch nachgebaut werden. Diese neuartigen dreidimensionalen Fremdkörpermodelle ermöglichten die Testung von Biomaterialien über längere Testphasen und können in anschließenden Studien angewandt werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei unterschiedliche Teststrategien entwickelt werden, die (I) die Bewertung von Teilprozessen ermöglichen, (II) die Identifizierung verlässlicher Testbedingungen unterstützen und (III) biomimetisch ein Wundgewebe abbilden. Wesentlich ist, dass biomimetisch ein dreidimensionales Gewebemodell entwickelt werden konnte, das eine verlässliche Unterscheidungskapazität zwischen Biomaterialien aufweist. / The implantation of a medical product into the human body induces an immune reaction, which may lead to its fibrous encapsulation. Macrophages in direct contact to the surface sense the foreign body and translate the signal in the secretion of multiple soluble mediators. This generated inflammatory milieu modulates the healing reaction, may induce the accumulation of fibroblasts and lead in the wound microenvironment to an increased matrix synthesis rate. A dense fibrous capsule surrounding a medical product is able to impair the replacement of body structures, the support of physiological body functions as well as the efficiency of a medical therapy. To identify potential biomaterial candidates with optimal characteristics an evidence-based decision making process is necessary and furthermore affords the support by appropriate test procedures. To study local effects after implantation of biomaterials, the complexity of the foreign body reaction justifies the application of animal models as gold standard. The integration of in vitro test procedures into standardized test strategies often fails by the availability of validated, reliable and reproducible methods. According to that there is no standardized test procedure, which resembles the three-dimensional tissue structures during a foreign body reaction and is suited for longer contact phases in between blood components and biomaterials. In vitro tests are often more cost and time efficient and show as well by applying human cells a high transferability on human beings. Additionally the preference to in vitro test procedures addresses the “reduction” aspect of the Russel and Burch’s (1959) 3R-principles “replace-ment, reduction and refinement” to a conscious and reasoned use of animal models in science. Aim of this research project was the development of human in vitro model systems, which resemble the contact to blood components and the reaction of the surrounding soft tissue following implantation of a biomaterial. Reference materials, whose tissue integration after implantation in animals or humans is described, were applied for the developed model systems as validation criterion. The accumulation of cells and the synthesis of extracellular matrix in the surrounding wound are relevant sub processes during a foreign body reaction. In an indirect cell-based model system the influence of the cell-mediated conditioning initiated by the material-induced and macrophage-mediated liberation of soluble mediators was shown on both sub processes the aligned migration of fibroblasts as well as the remodeling of a three-dimensional tissue model. Additionally, the cytokine secretion profile by material-adherent macrophages was characterized under different test conditions such as the contamination with LPS, the surface treatment with human plasma and the presence of IL-4. The following comparative statistical modelling allowed a transformation of the generated complex multi-factorial data matrix to a biomaterial ranking. The here developed test procedure was suitable for the validation of in vitro test conditions as well as the evaluation of the reference biomaterials. Last, by the combination of different cells and matrix structures the complex three-dimensional structure of the extracellular matrix in a wound was biomimetically reconstructed. Those novel three-dimensional foreign body models enabled the testing of biomaterials over longer test phases and might be applied in following studies to investigate dynamic processes. Summarizing in this research project three different test strategies were developed, which (I) enable the evaluation of sub processes, (II) support the identification of reliable test conditions and (III) biomimetically reconstruct a wound tissue. Most important is, that a three-dimensional tissue model was biomimetically developed, which showed a reliable discriminatory capacity in between biomaterials.

Aus vorherigen Veröffentlichungen der Arbeitsgruppe war bekannt, dass der TRPV1 Hitzerezeptor im Vogel sich vom TRPV1 der Säugetiere hinsichtlich der Capsaicinsensitivität und der Regulation der Expression durch NGF unterscheidet. Unterschiede in den Eigenschaften zwischen beiden Hitzerezeptorsubtypen könnten Rückschlüsse auf funktionelle Strukturen des Säugetier TRPV1 erlauben. In der vorliegenden Arbeit war die übergreifende Fragestellung, ob sich beide Hitzerezeptorsubtypen auch hinsichtlich ihrer Protonensensitivität unterscheiden. Für die Untersuchungen wurden Spinalganglienneurone von Küken isoliert und kultiviert. Mit Hilfe der Cobalt-uptake Methode wurde der Anteil der Neurone bestimmt, die funktionell den Hitzerezeptor TRPV1 exprimieren. Diese Experimente wurden nach 1, 2 und 3 Tagen unter Kulturbedingungen durchgeführt, um eine mögliche Veränderung mit der Zeit zu erfassen. Weiterhin wurde untersucht, ob durch Protonen der Anteil hitzesensitiver Neurone beeinflusst wird. Hierfür wurden die Somata nach einem Tag unter Kulturbedingungen in Kombination von Hitze und Protonen stimuliert. Um eine Sensibilisierung der Hitzeantwort durch Protonen in einzelnen Neuronen zu untersuchen, wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik in der whole-cell Konfiguration die Amplitude von Hitze-und protoneninduzierten Gesamteinwärtsströmen untersucht. Zunächst wurde mit der Cobalt-uptake Methode untersucht, ob der Anteil hitzesensitiver Neurone durch Protonen von der Zeit unter Kulturbedingungen beeinflusst wird. Bei einer Temperatur von 44°C stieg der Prozentsatz hitzesensitiver Neurone innerhalb der ersten 3 Tage unter Kulturbedingungen an, unabhängig von der Protonenkonzentration (pH 7,4, pH 6,6 und pH 5,8). Die nächste Frage war, wie hoch der Anteil protonensensitiver Neurone bei Raumtemperatur ist. Hierfür wurden die Zellen nach einem Tag in Zellkultur mit einem Medium von pH 7,4, pH 6,6, pH 6,2 oder pH 5,8 stimuliert. Es zeigte sich ein Anstieg von 3,3% ± 0,5% bei pH 7,4 auf 35,0% ± 4,0% bei pH 5,8. Im Folgenden wurde der Frage nachgegangen, ob dieser Anstieg temperaturabhängig ist. Hierfür wurden entsprechende Experimente bei 37°C, 40°C und 44°C nach einem Tag unter Kulturbedingeungen durchgeführt. Im Vergleich war bei 37°C der Anteil positiver Neurone bereits bei 6,2 so hoch wie bei Raumtemperatur bei pH 5,8. Mit weiter zunehmender Temperatur verringerte sich jedoch der Anteil positiver Neurone mit steigendem pH. So war bei 44°C und pH 5,8 nur noch ein geringer Anstieg zu verzeichnen. Im letzten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik hitze- und protoneninduzierte Einwärtsströme gemessen. Es konnte exemplarisch gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduziereten Einwärtsstroms temperaturabhängig ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduzierten Einwärtsstroms bei einem Medium von pH 6,6 im Vergleich zu pH 7,4 deutlich ansteigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der Küken TRPV1 ähnlich wie der der Säugetiere durch Protonen in Konzentrationen, die im entzündlichen Gewebe vorkommen, sensibilisiert werden kann. Es kommt sowohl zu einer Rekrutierung von weiteren hitzesensitiven Neuronen also auch zu einer verstärkten Antwort bereits hitzesensitiver Neurone. / From previous publications of the work group it was already known that the TRPV1 heat receptor of birds differs from the TRPV1 of mammals in regards to the capsaicin sensitivity and the regulation of the expression by NGF. Differences in properties between the two heat receptor subtypes might allow conclusions on functional structures of the mammal TRPV1. In the study it was examined whether both subtypes of heat receptors also differ concerning their sensitivity of proton. For this analyzes, spinal ganglion neurons of chicks were isolated and cultivated. By means of the cobalt-uptake method the percentage of neurons was identified which functionally expresses the heat receptor TRPV1. These experiments were conducted after 1,2 and 3 days in culture conditions to be able to evaluate a possible change over time. Further on it was examined whether the percentage of heat sensitive neurons is influenced by proton. For this, the neurons were stimulated after one day in culture conditions in combination of heat and proton. To study the sensitisation of the heat response through proton within single neurons, the amplitude of heat and proton induced total ionic currents was examined by using the patch-clamp method in the whole-cell configuration. As a start, it was examined by means of the cobalt-uptake method whether the percentage of heat sensitive neurons is influenced by proton over time in culture conditions. At a temperature of 44°C the percentage of heat sensitive neurons increased within the first 3 days in culture conditions independently on the concentration of proton (pH 7,4, pH 6,6 and pH 5,8). The next question was the percentage of proton sensitive neuron at room temperature. For this, the cells were stimulated after one day in cell culture with a medium of pH 7,4, pH 6,6, pH 6,2 or pH 5,8. An increase of 3,3% ± 0,5% at pH 7,4 up to 35,0% ± 4,0% at pH 5,8 could be identified. In the following it was evaluated whether this increase is dependent on temperature. Therefore, experiments at 37°C, 40°C and 44°C after one day in culture conditions were conducted. In comparison at 37°C the percentage of positive neurons was already at 6,2 as high as at room temperature at pH 5,8. With a further increasing temperature, the percentage of positive neurons decreased with increasing pH values. Thus, at 44°C and pH 5,8 only a little further increase could be identified. In the last part of the study, heat and proton induced ionic currents were measured by using the patch-clamp method. Exemplarily it could be demonstrated that the amplitude of heat induced ionic currents is dependent on temperature. Further on it could be demonstrated that the amplitude of the heat induced ionic current significantly increases at a medium of pH 6,6 compared to a pH of 7,4. The results of this study show that the TRPV1 of chicks similarly to the one of mammals can be sensitized by proton in concentrations as they exist in inflamed tissue. This results in a recruiting of additional heat sensitive neurons as well as an intensified response of already heat sensitive neurons.

This thesis is divided into three parts with the main goal allocating novel antimicrobial compounds that could be used as future antibiotics. The first part aimed to evaluate the potential of plant suspension cultures for the production of antimicrobial proteins. The extracellular, intracellular and cell wall bound fractions of seven heterotrophic and photomixotrophic plant cell suspension cultures treated with nine different elicitors were tested for the elicitor dependent production of antimicrobial proteins. Bioactivities were tested against a selected panel of human isolates including Gram-positive and Gram-negative bacteria as well as fungi using the disc diffusion assay. The intracellular fractions of elicited cell cultures were more active than extracellular fractions while the cell wall bound fractions showed lowest activities. Among the 21 fractions tested, the intracellular fraction of Lavendula angustifolia elicited with DC3000 was most active against Candida maltosa. The second most active fraction was the intracellular fraction of Arabidopsis thaliana elicited with salicylic acid which was moreover active against all test strains. The antimicrobial activity of elicited Arabidopsis thaliana cell cultures was tested by bioautography to locate the antimicrobial proteins in the crude extract. The intracellular fraction of photomixotrophic Arabidopsis thaliana cells elicited with salicylic acid was selected for further gel filtration chromatography on S-200 column leading to the purification of one 19 kDa antimicrobially active protein, designated, AtAMP. Our findings suggest that elicited plant cell cultures may present a new promising alternative source of antimicrobial proteins. The second part comprises the isolation of actinomycetes associated with marine sponges and testing the bioactivities of new species for further investigations. Actinobacterial communities of eleven taxonomically different sponges that had been collected from offshore Ras Mohamed (Egypt) and from Rovinj (Croatia) were investigated by a culture-based approach using different standard media for isolation of actinomycetes and media enriched with aqueous sponge extract to target rare and new actinomycete species. Phylogenetic characterization of 52 representative isolates out of 90 based on almost complete sequences of genes encoding 16S rRNA supported their assignment to 18 different actinomycete genera. Altogether 14 putatively new species were identified based on sequence similarity values below 98.2% to other strains in the NCBI database. The use of M1 agar amended with aqueous sponge extract yielded a putative new genus related to Rubrobacter which highlighting the need for innovative cultivation protocols. Biological activity testing showed that five isolates were active against Gram-positives only, one isolate was active against Candida albicans only and one isolate showed activity against both groups of pathogens. Moreover, the antiparasistic activity was documented for four isolates. These results showed a high diversity of actinomycetes associated with marine sponges as well as highlighted their potential to produce anti-infective agents. The third part of the thesis focused on the isolation and structure elucidation of new bioactive compounds. Streptomyces strain RV15 recovered from sponge Dysidea tupha, was selected for further chemical analysis by virtue of the fact that it exhibited the greatest antimicrobial potential against Staphylococcus aureus as well as Candida albicans among the all tested strains. Moreover, members of the genus Streptomyces are well known as prolific producers of interesting pharmacologically active metabolites. Chemical analysis of the methanolic crude extract using different chromatographic tools yielded four new compounds. The structures of the new compounds were spectroscopically elucidated to be four new cyclic peptides, namely, cyclodysidins A-D. Their bioactivity was tested against different proteases, bacteria and Candida as well as tumor cell lines. The compounds did not show any significant activities at this point. / Die hier vorliegende Dissertation ist in drei Kapitel gegliedert und hatte die Bereitstellung neuer antimikrobieller Substanzen, die zukünftig als Antibiotika genutzt werden könnten, zum Hauptziel. Das erste Kapitel befasst sich mit dem Potenzial von Pflanzen zur Produktion von Proteinen mit antimikrobieller Wirkung. Pflanzenzellkulturen wurden mit neun verschiedenen Induktoren stimuliert und anschließend auf die Produktion von Proteinen mit antimikrobieller Wirkung hin untersucht. Dafür wurden die extra-, intrazellulären sowie die membrangebundenen Proteinfraktionen von sieben heterotrophen und photomixotrophen Pflanzenzellkulturen extrahiert. Mittels Diffusionstests wurden die Wirkung der Proteine gegen eine Sammlung menschlicher Pathogene inklusive Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien, sowie Pilze getestet. Die intrazellulären Fraktionen zeigten dabei höhere Aktivitäten als die extrazellulären, wohingegen die membrangebundenen Proteine die geringsten Aktivitäten aufwiesen. Von den insgesamt 21 getesteten Proteinfraktionen wies die mit DC3000 induzierte intrazelluläre Fraktion von Lavendula angustifolia die größte Wirkung gegen Candida maltosa auf. Die mit Salicylsäure induzierte intrazelluläre Proteinfraktion von Arabidopsis thaliana zeigte eine Hemmung aller getesteten pathogenen Stämme. Die antimikrobielle Aktivität der induzierten Arabidopsis thaliana-Zellkultur wurde mittels Bioautography weiter untersucht, um das wirksame Protein im Gesamt-(Roh-) extrakt einzugrenzen. Die intrazelluläre Fraktion der photomixotrophen Arabidopsis thaliana-Zellkultur wurde ausgewählt, um ein 19 kDa Protein mit antimikrobieller Wirkung, genannt AtAMP, mittels Gelfitrationschromatography über eine S-200 Säule aufzureinigen. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass induzierte Pflanzenzellkulturen zukünftig als aussichtsreiche alternative Quelle für antimikrobiell wirksame Proteine herangezogen werden können. Der zweite Teil dieser Dissertation beinhaltet die Isolation von mit marinen Schwämmen assoziierten Actinomyceten und deren Testung auf Bioaktivität. Aus 11 taxonomisch verschiedenen, an den Küsten von Ras Mohamed (Ägypten) und Rovinj (Kroatien) gesammelten Schwammspezies, wurden Actinobakterien auf verschiedenen Standardmedien kultiviert. Um seltene, neue Stämme zu isolieren, wurden diese Medien mit wässrigen Schwammextrakten angereichert. Die auf der 16S rRNA-Gensequenz basierenden phylogenetischen Charakterisierung von 52 der insgesamt 90 Isolate, zeigte die Zugehörigkeit zu 18 verschiedenen Actinomyceten-Gattungen. Die 16S rRNA-Gene von 14 Isolaten zeigten Homologien von weniger als 98,2% zu denen anderer in Datenbanken abgelegten Bakterien und stellen somit vermutlich neue Arten dar. Die Verwendung von mit Schwammextrakt angereichertem M1-Agar resultierte in der Kultivierung einer mutmaßlich neuen, mit Rubrobacter verwandten Gattung und bestätigt die Notwendigkeit der Entwicklung neuer innovativer Kultivierungsprotokolle. Aktivitätstests von fünf Isolaten zeigten deren hemmende Wirkung nur gegen Gram-positive Bakterien, ein Isolat zeigte Aktivität nur gegen Candida albicans und ein Isolat war wirksam gegen beide genannten Pathogengruppen. Desweiteren konnten antiparasitäre Wirkungen von vier Isolaten dokumentiert werden. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen die große Diversität von mit Schwämmen assoziierten Actinomyceten und deren Potential Antiinfektiva zu produzieren. Der dritte Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf die Isolation und Strukturaufklärung neuer bioaktiver Substanzen. Streptomyceten sind bekannt für die Produktion von interessanten, pharmakologisch aktiven Metaboliten. Der aus dem Schwamm Dysidea tupha isolierte Stamm Streptomyces RV 15 zeigte eine hohe Aktivität gegen Staphylococcus aureus und C. albicans und wurde deshalb für nähere Untersuchungen ausgewählt. Die chemische Analyse des Methanol-Rohextrakts unter der Verwendung verschiedener Chromatographie-Verfahren resultierte in der Isolation von vier Substanzen. Die spektroskopische Analyse zeigte, dass diese neuen Substanzen zyklische Peptidstrukturen aufweisen und wurden daraufhin als Cyclodysidin A-D benannt. Die Bioaktivitäten dieser Substanzen wurden gegen verschiedene Proteasen, Bakterien und Candida sowie gegen verschiedene Tumorzelllinien getestet. Bis zum jetzigen Zeitpunkt zeigte keine der getesteten Peptide eine aussagekräftige Wirkung.

Das triple-negative Mammakarzinom ist Hormonrezeptor- und HER2 negativ und mit einer ungünstigen Prognose verbunden. Triple-negative Patientinnen sind unempfindlich gegen die endokrine Therapie und den HER-2/neu Antikörper Trastuzumab und deshalb auf die zytostatische Chemotherapie angewiesen. Lobaplatin ist ein Platinderivat mit wenigen Nebenwirkungen und guter Antitumorwirkung in vitro und deshalb möglicherweise auch für die Behandlung triple-negativer Tumoren geeignet. Für die vorliegende Arbeit haben wir zwei triple-negative und eine klassische Brustkrebszelllinie verwendet. Die beiden triple-negativen Zelllinien wurden anhand einer vorbeschriebenen Mutation identifiziert, um eine Verwechslung auszuschließen. Die Aktivität des p53 Gens wurde in allen drei Zelllinien überprüft, ein aktives p53 Gen jedoch nur in der hormonrezeptor-positiven MCF7 Zelllinie nachgewiesen. Ein Zusammenhang zwischen p53 Status und Ansprechen der Zellen auf Lobaplatin oder Cisplatin konnte nicht belegt werden. Wir haben die zytotoxische Wirkung von Lobaplatin und Cisplatin verglichen. Lobaplatin war in unseren Untersuchungen ähnlich wirksam wie Cisplatin und bei der Behandlung der MCF7 Zelllinie und einer Cisplatin-resistenten Ovarialkarzinomzelllinie sogar dem Cisplatin überlegen. Lobaplatin wies in diesen Zellen keine komplette Kreuzresistenz zu Cisplatin auf. In einem nächsten Schritt wurden unterschiedliche Zytostatika mit Lobaplatin kombiniert. Additive Synergien zwischen den einzelnen Substanzen konnten nicht bewiesen werden, jedoch war ein gutes Zusammenwirken von Lobaplatin und dem in der klinischen Erprobung befindlichen Todesliganden TRAIL zu erkennen. Mittels Nachweis von Spaltprodukten haben wir gezeigt, dass Lobaplatin und Cisplatin eine Aktivierung von Caspasen bewirken. Die aktivierte Caspase 3 konnte allerdings nicht dargestellt werden. Die Begriffe Apoptose und Nekroptose wurden diskutiert und eine Beteiligung beider Prozesse an der Wirkung von Lobaplatin und Cisplatin nachgewiesen. Veränderungen des Zellzyklus wurden untersucht. Die beiden Platinderivate führten zu einem Arrest in der G2-Phase und in höheren Konzentrationen teilweise zu einem G1-Arrest. Insgesamt sind an der zytotoxischen Wirkung von Lobaplatin und Cisplatin und der Entscheidung über Leben oder Tod viele wichtige Mechanismen in wechselnder Rangfolge beteiligt. In unseren Versuchen an zwei triple-negativen und einer klassischen Brustkrebszelllinie erweist sich Lobaplatin als ebenbürtiger Nachfahre des Cisplatin mit einer vergleichbaren Zytotoxizität, weniger schwerwiegenden Nebenwirkungen und der Fähigkeit, vorhandene Cisplatinresistenzen teilweise zu umgehen. Lobaplatin verspricht darüber hinaus in Kombination mit anderen Zytostatika interessante therapeutische Perspektiven, die bisher nur unzureichend erprobt sind. / In this work Lobaplatin was investigated both as a single agent and in combination with other cytostatic drugs in in-vitro models of two triple-negative breast cancer cell lines and one oestrogen receptor-positive breast cancer cell line.

Unter dem Einfluss von M-CSF und GM-CSF entwickeln sich CD14-positive periphere humane Blutmonozyten zu CD68-positiven M-CSF- bzw. GM-CSF-Makrophagen. M-CSF-Makrophagen lassen sich mit INFg und LPS zu klassisch aktivierten M1-Makrophagen, oder mit IL-4 und IL-10 zu alternativ aktivierten M2-Makrophagen differenzieren. Durch GM-CSF werden aus Monozyten GM-CSF-Makrophagen induziert. Im Gegensatz zu M1-Makrophagen sind GM1-Makrophagen bisher noch wenig untersucht. Mit INFg und LPS werden GM-CSF-Makrophagen zu GM1-Makrophagen aktivert. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, wie groß die Übereinstimmung zwischen M-CSF- und M2-Makrophagen sowie zwischen GM-CSF- und M1-Makrophagen / GM1-Makrophagen ist. Im Gegensatz zu M-CSF- und GM-CSF stellt Laktat aber keinen Differenzierungsfaktor für Monozyten dar. Jedoch beeinflusst Laktat den Phänotyp von M2-Makrophagen und hemmt die Ausschüttung von IL-12 und NO durch M1- und GM1-Makrophagen. / In the presence of M-CSF and GM-CSF CD14-positive human blood monocytes develop into CD68-pos M-CSF- or GM-CSF-macrophages. M-CSF-macrophages differentiate when incubated with INFg and LPS to classicly activated M1-marophages, when incubated with IL-4 and IL-10 zu alternativly activated M2-macrophages. Monocytes presented to GM-CSF eventually become GM-CSF-macrophages. There are only few examinations of GM-CSF-macrophages and classicly activated GM1-macrophages compared to M1-macrophages. In this study we focused on comparing the non-activated M-CSF-macrophages to alternativly activated M2-macrophages and non-activated GM-CSF-macrophages to classicly activated GM1-macrophages/M1-macrophages. Furthermore we point out that lactate is not a potential differentiation-signal für monocytes. But lactate does infact interfere with certain macrophage-phenotypes and the secretion of proinflammatory IL-12 and NO-molecules.