L’acide docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3) est le principal acide gras oméga-3 des tissus cérébraux et est essentiel au développement et aux fonctions du cerveau. Une diminution de la concentration cérébrale du DHA est observée chez les patients souffrant de maladies neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson. Un apport ciblé du DHA au cerveau pourrait compenser ces carences. Le DHA sanguin est transporté à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) plus efficacement lorsqu’il est estérifié en position sn-2 de la lysophosphatidylcholine (lysoPC). Nous produisons au laboratoire une phosphatidylcholine structurée pour mimer la 2-docosahexaénoyl-lysoPC (lysoPC-DHA), nommée AceDoPC (1-acétyl,2-docosahexaénoyl-glycérophosphocholine), qui peut être considérée comme une forme stabilisée de la lysoPC-DHA physiologique et qui est neuroprotectrice dans l’accident ischémique cérébral. Le premier objectif de ce travail a été de comparer le passage du DHA marqué non estérifié ou estérifié dans l’AceDoPC ou dans une phosphatidylcholine (PC-DHA), lié au plasma, à travers un modèle in vitro de la BHE. Nous montrons un passage préférentiel à travers la monocouche endothéliale et une captation préférentielle par les cellules gliales de l’AceDoPC comparativement au DHA non estérifié et à la PC-DHA. Le deuxième objectif de ce travail a été de confirmer si cette préférence pour la forme AceDoPC était également observée in vivo. Nous avons donc étudié, chez des rats âgés de 20 jours, la captation cérébrale des différentes formes d’apport du DHA précédemment utilisées (DHA, AceDoPC, PC-DHA). Nous démontrons que l’AceDoPC apporte le DHA au cerveau plus efficacement que les autres formes d’apport de DHA et que cette préférence pour l’AceDoPC est spécifique au cerveau puisqu’elle n’est pas observée pour les autres organes étudiés. L’AceDoPC est trouvée, en partie, sous forme intacte dans le cerveau. L’autoradiographie ex vivo du cerveau de rat révèle que le DHA provenant de l’AceDoPC est localisé dans des régions cérébrales spécifiques jouant un rôle important dans la mémoire et les fonctions cognitives. Enfin, en utilisant des approches de modélisation moléculaire, nous démontrons que les potentiels électrostatiques et hydrophobes sont distribués de manière très similaire au niveau des surfaces de l’AceDoPC et de la lysoPC-DHA. En conclusion, nos études montrent que l’AceDoPC est un transporteur privilégié et spécifique du DHA au cerveau. En considérant les rôles essentiels du DHA pour le cerveau, cette nouvelle approche de ciblage cérébral du DHA offre des perspectives prometteuses dans le développement de stratégies préventives et thérapeutiques pour les maladies neurologiques. / Docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) is the main essential omega-3 fatty acid in brain tissues required for normal brain development and function. A decrease in the cerebral concentration of DHA is observed in patients suffering from neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s and Parkinson’s. Targeted intake of DHA to the brain could compensate for these deficiencies. Blood DHA is transported across the blood-brain barrier (BBB) more efficiently when esterified at the sn-2 position of lysophosphatidylcholine (lysoPC). We produce in the laboratory a structured phosphatidylcholine to mimic 2-docosahexaenoyl-lysoPC (lysoPC-DHA), named AceDoPC (1-acetyl,2-docosahexaenoyl-glycerophosphocholine), that may be considered as a stabilized form of the physiological lysoPC-DHA and that is neuroprotective in experimental ischemic stroke. The first objective of this work was to compare the passage of either labeled unesterified DHA or DHA esterified in AceDoPC or in phosphatidylcholine (PC-DHA), bound to plasma, through an in vitro model of the BBB. This model is constituted of a co-culture of bovine brain capillary endothelial cells and glial cells from newborn rats. We show a preferential passage through the endothelial monolayer and a preferential uptake by glial cells of AceDoPC compared to unesterified DHA and PC-DHA. We also show that AceDoPC is hydrolyzed, partly, into lysoPC-DHA and that phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) are the most labeled lipid classes in endothelial cells and glial cells. AceDoPC is found, partly, as a whole molecule in the cells. The second objective of this work was to confirm whether this preference for AceDoPC was also observed in vivo. We studied, in 20 days old rats, the brain uptake of different forms of DHA previously used (DHA, AceDoPC, PC-DHA). We demonstrate that AceDoPC provided the brain with DHA more efficiently than the other forms of DHA and that this preference for AceDoPC is specific for the brain because it is not observed for other studied organs. AceDoPC is found, partly, intact in the brain. Ex vivo autoradiography of rat brain reveals that DHA provided from AceDoPC is localized in specific brain regions playing key roles in memory and cognitive functions. Finally, by using molecular modelling approaches, we demonstrate that electrostatic and hydrophobic potentials are distributed very similarly at the surfaces of AceDoPC and lysoPC-DHA. In conclusion, our studies demonstrate that AceDoPC is a privileged and specific carrier of DHA to the brain. Considering the essential roles of DHA for the brain, this new approach to target the brain with DHA offers promising perspectives in the development of preventive and therapeutic strategies for neurological diseases.

L'acide docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3) est un acide gras polyinsaturé (AGPI) oméga-3. Il est particulièrement abondant dans le cerveau et la rétine et est nécessaire pour le bon développement et fonctionnement du cerveau. Tandis qu'une déficience en DHA a été montrée être liée à l'émergence de maladies cérébrales (i.e. maladie d'Alzheimer ou maladie de Parkinson), des études ont également montré qu'un apport alimentaire en AGPI oméga-3 pouvait empêcher ou atténuer les perturbations neurologiques liées au vieillissement ou aux maladies neurodégénératives. Il est alors primordial de transporter efficacement le DHA au cerveau. Le laboratoire français a synthétisé auparavant une forme stabilisée de la lysophosphatidylcholine-DHA, qui est le vecteur principal d'apport de DHA au cerveau, de structure 1-acétyl,2-docosahexaénoyl-glycérophosphocholine, brevetée et nommée AceDoPC®. L'injection d'AceDoPC ou de DHA après un accident vasculaire cérébral ischémique provoqué expérimentalement a montré que ces deux molécules étaient neuroprotectrices. Ces effets sont supposés être dus en partie à la conversion du DHA en métabolites oxygénés. Notre étude vise à examiner les effets du DHA et de ses métabolites dérivés, estérifiés ou non dans des phospholipides structurés sur un modèle de neurogenèse in vitro en conditions physiologiques ou pathologiques. Le premier objectif de ce travail a été de synthétiser le phospholipide structuré contenant du DHA, l’AceDoPC®, la protectine DX (métabolite oxygéné du DHA), et un nouveau phospholipide structuré contenant la protectine: 1-acétyl,2-protectine DX-glycérophosphocholine (AceDoxyPC). Le second objectif était d’étudier les effets du DHA, de l'AceDoPC et de la PDX sur la neurogenèse en utilisant un modèle in vitro de neurogenèse, constitué de cultures de cellules souches progénitrices neurales (NSPCs) dérivées de cerveaux de souris adultes, dans des conditions physiologiques ou pathologiques (ischémiques ici). Enfin, le troisième objectif de cette thèse a été d'identifier les mécanismes impliqués dans la réponse des cellules aux conditions ischémiques. La synthèse du phospholipide structuré AceDoxyPC a été réalisée avec succès par une double lipoxygénation enzymatique de l'AceDoPC, et l'identification du produit a été possible grâce à l'utilisation de techniques avancées de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC/ESI/MS). De futures études sur ce transporteur de molécule neuroprotectrice potentielle doivent être réalisées prochainement. Les cellules incubées en présence d’AceDoPC présentent une augmentation de neurogenèse comparativement à celles cultivées avec addition de DHA non estérifié ou du véhicule contrôle, notamment sous conditions pathologiques. Les études préliminaires des mécanismes potentiellement impliqués dans la neuroprotection indiquent que les effets neuroprotecteurs et régénératifs de l'AceDoPC pourraient être en partie dus à des effets anti-oxidants. / Docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) is an essential omega-3 polyunsaturated fatty acid (PUFA). It is specifically enriched in the brain and the retina and it is required for visual acuity, proper brain development and cerebral functions. While DHA deficiency in the brain was shown to be linked to the emergence of cerebral diseases (i.e. Alzheimer’s disease or Parkinson’s disease), studies showed that a dietary intake of omega-3 PUFA could prevent or attenuate neurologic disturbances linked with ageing or neurodegenerative diseases. In this context, it is primary to deliver DHA efficiently to the brain. Targeting the brain with DHA might offer great promise in developing new therapeutics for neurodegenerative diseases. The French host laboratory previously synthesized a stabilized form of lysophosphatidylcholine-DHA, which is main vector of DHA transportation to the brain, of structure 1-acetyl,2-docoshexaenoyl-glycerophosphocholine, patented and named AceDoPC®. Injection of AceDoPC or DHA after experimental ischemic stroke showed that both molecules also had neuroprotective effects. These potential neuroprotective effects are expected to be due, in part, to DHA conversion into oxygenated metabolites. This study aims to investigate the beneficial effects of DHA and its derived metabolites either unesterified or esterified within structured phospholipids on a model of neurogenesis in vitro under physiological or pathological conditions. The first objective of this work was then to synthesize the DHA-containing structured phospholipid AceDoPC®, DHA oxygenated derivative protectin DX (PDX) and a novel structured phospholipid of protectin: 1-acetyl,2-protectinDX-glycerophosphocholine (AceDoxyPC). The second objective was to investigate the effects of DHA, AceDoPC and PDX on neurogenesis using an in vitro model of neurogenesis, namely cultures of neural stem progenitor cells (NSPCs) derived from the adult mouse brain under physiological or pathological conditions (ischemic conditions). Following this, the third objective of this work was to identify the mechanisms involved in such response to stress induced under pathological conditions. Synthesis of the novel structured phospholipid AceDoxyPC was successfully performed by double enzymatic lipoxygenation of AceDoPC and identification of the product was possible using advanced techniques of liquid chromatography (LC)/electrospray ionization (/ESI)/mass spectrometry (/MS). Future studies on this potential neuroprotective molecule transporter are to be investigated in the near future. Neurogenesis study of cell cultures with AceDoPC showed enhanced neurogenesis compared to addition of unesterified DHA or vehicle control, especially under pathological conditions. Preliminary studies of the potential mechanisms involved in neuroprotection hinted that AceDoPC neuroprotective and regenerative effects might be due in part to its anti-oxidative effects.

Les acides gras de la série n-3 et notamment l'acide docosahexaénoïque (DHA) jouent un rôle important dans la prévention des maladies cardiovasculaires. Un de ses métabolites, la protectine DX (PDX), qui est un isomère de la protectine D1 (PD1), inhibe l'agrégation des plaquettes sanguines. D'autres composés similaires appelés "poxytrins", qui possèdent aussi un triène conjugué avec une géométrie E,Z,E, ont également été synthétisés à partir d'autres acides gras polyinsaturés (AGPI) via la lipoxygénase de soja. Ces composés présentent des propriétés anti-agrégantes en inhibant la cyclo-oxygénase plaquettaire et le récepteur du thromboxane A2. Dans cette thèse, nous décrivons de nouveaux composés dihydroxylés synthétisés par la 15-lipoxygénase de soja à partir de l'acide alpha-linolénique (18:3n-3), un acide gras polyinsaturé indispensable consommé au niveau du gramme chez l'Homme adulte. Il est converti en acides gras monohydroxylés et dihydroxylés. Ces composés ont été séparés par HPLC en phase inverse et caractérisés par GC-MS après dérivation adéquate. Un acide gras monohydroxylé, majoritaire, l'acide 13(S)-octadécatriénoïque et quatre acides gras dihydroxylés ont été détectés. Ces derniers présentent tous un spectre UV caractéristique avec une absorption maximale à 270 nm et deux épaulements à 260 et 280 nm. Les spectres UV de deux d'entre eux sont superposables à celui de la PDX, ce qui suggère une géométrie E,Z,E des doubles liaisons de leur triène. La caractérisation complète de ces composés a été réalisée par RMN à haut champ et par GC-MS. Ce sont les acides 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque et 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque. Ils sont également synthétisés par la 15 lipoxygénase recombinante humaine de type 2. Ces composés dihydroxylés 9,16-diHOTEs ont été testés sur les plaquettes isolées à partir du sang humain. Nous avons observé que seules les molécules ayant la géométrie E,Z,E du triène conjugué inhibent l'agrégation plaquettaire induite par le collagène et inhibent la cyclooxygénase-1 (COX-1) de mouton. Les propriétés anti-inflammatoires de ces produits ont également été étudiés. Tous les isomères 9,16-diHOTEs, possédant un triène conjugué avec une géométrie E,Z,E, inhibent la COX-2 recombinante humaine et seul l'acide 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïques inhibe la 5-lipoxygénase des leucocytes, siège de la synthèse des leucotriènes issus de l'acide arachidonique. En conclusion, les composés dihydroxlés possédant un triène conjugué E,Z,E, issus du 18:3n-3, ainsi que la PDX, inhibent l'activité des COX-1 et 2, et seraient anti-agrégants et anti-inflammatoires. Ces résultats donnent des perspectives pharmacologiques aux recommandations nutritionnelles promouvant la consommation d'acide alpha linolénique.

Les acides gras de la série n-3 et notamment l’acide docosahexaénoïque (DHA) jouent un rôle important dans la prévention des maladies cardiovasculaires. Un de ses métabolites, la protectine DX (PDX), qui est un isomère de la protectine D1 (PD1), inhibe l’agrégation des plaquettes sanguines. D’autres composés similaires appelés "poxytrins", qui possèdent aussi un triène conjugué avec une géométrie E,Z,E, ont également été synthétisés à partir d'autres acides gras polyinsaturés (AGPI) via la lipoxygénase de soja. Ces composés présentent des propriétés anti-agrégantes en inhibant la cyclo-oxygénase plaquettaire et le récepteur du thromboxane A2. Dans cette thèse, nous décrivons de nouveaux composés dihydroxylés synthétisés par la 15-lipoxygénase de soja à partir de l’acide alpha-linolénique (18:3n-3), un acide gras polyinsaturé indispensable consommé au niveau du gramme chez l’Homme adulte. Il est converti en acides gras monohydroxylés et dihydroxylés. Ces composés ont été séparés par HPLC en phase inverse et caractérisés par GC-MS après dérivation adéquate. Un acide gras monohydroxylé, majoritaire, l’acide 13(S)-octadécatriénoïque et quatre acides gras dihydroxylés ont été détectés. Ces derniers présentent tous un spectre UV caractéristique avec une absorption maximale à 270 nm et deux épaulements à 260 et 280 nm. Les spectres UV de deux d'entre eux sont superposables à celui de la PDX, ce qui suggère une géométrie E,Z,E des doubles liaisons de leur triène. La caractérisation complète de ces composés a été réalisée par RMN à haut champ et par GC-MS. Ce sont les acides 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque et 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque. Ils sont également synthétisés par la 15 lipoxygénase recombinante humaine de type 2. Ces composés dihydroxylés 9,16-diHOTEs ont été testés sur les plaquettes isolées à partir du sang humain. Nous avons observé que seules les molécules ayant la géométrie E,Z,E du triène conjugué inhibent l'agrégation plaquettaire induite par le collagène et inhibent la cyclooxygénase-1 (COX-1) de mouton. Les propriétés anti-inflammatoires de ces produits ont également été étudiés. Tous les isomères 9,16-diHOTEs, possédant un triène conjugué avec une géométrie E,Z,E, inhibent la COX-2 recombinante humaine et seul l’acide 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïques inhibe la 5-lipoxygénase des leucocytes, siège de la synthèse des leucotriènes issus de l’acide arachidonique. En conclusion, les composés dihydroxlés possédant un triène conjugué E,Z,E, issus du 18:3n-3, ainsi que la PDX, inhibent l’activité des COX-1 et 2, et seraient anti-agrégants et anti-inflammatoires. Ces résultats donnent des perspectives pharmacologiques aux recommandations nutritionnelles promouvant la consommation d’acide alpha linolénique. / N-3 fatty acids, especially docosahexaenoic acid (DHA), play an important role in the prevention of cardiovascular diseases. One metabolite of DHA, protectin DX (PDX), an isomer of protectin D1 (PD1) (Chen P et al., 2009),possesses inhibits blood platelet aggregation. Similar compounds called "poxytrins", which have a conjugated triene with a E,Z,E geometry have also been synthesized from other polyunsaturated fatty acids (PUFA) by soybean lipoxygenase. They have anti-aggregating properties by inhibiting platelet cyclooxygenase and thromboxane A2 receptor (Chen P et al., 2011). In this thesis, we describe new dihydroxy compounds synthesized by the soybean 15-lipoxygenase from alpha-linolenic acid (18:3n-3), an essential PUFA that is consumed in the gram range in human adults . It is converted into monohydroxylated and dihydroxylated derivatives. These compounds were separated by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) and characterized by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) after appropriate derivatization. A main monohydroxylated fatty acid, 13(S)-octadecatrienoic acid (13(S)-OH-18:3) and four dihydroxylated fatty acids were detected. The last ones have all a characteristic UV spectrum with a maximum absorbance at 270 nm with two shoulder peaks at 260 and 280 nm. The UV spectra from two of them are superimposable to that of PDX, suggesting a E,Z,E geometry for their conjugated triene. The complete characterization of these compounds was performed by high field nuclear magnetic resonance (NMR) and by GC-MS. These are the 9(R),16(S)-dihydroxy-octadeca-10E,12E,14E-trienoic, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadeca-10E,12E,14E-trienoic, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadeca-10E,12Z,14E-trienoic and 9(R),16(S)-dihydroxy-octadeca-10E,12Z,14E-trienoic acids. They can also be synthesized by the (type 2) 15 human recombinant lipoxygenase. These dihydroxylated compounds (9,16-diHOTEs)were tested on isolated human blood platelets. We observed that only molecules containing a conjugated triene with a E,Z,E geometry are able to inhibit platelet aggregation induced by collagen, and inhibit sheep cyclooxygenase-1 (COX-1). The anti-inflammatory properties of these products were also studied. All 9,16-diHOTEs isomers having a conjugated triene with a E,Z,E geometry, inhibit human recombinant cyclooxygenase-2 (COX-2) and only 9(R),16(S)-dihydroxy-octadeca-10E,12Z,14E-trienoic acid inhibits polymorphonuclear leukocytes (PMN) 5-lipoxygenase which is involved in the leukotriene synthesis from arachidonic acid. In conclusion, the E,Z,E dihydroxlated compounds from 18:3n-3, as well as PDX, inhibiting the COX-1 and 2 activities appear to be anti-aggregatory and anti-inflammatory agents. These results provide pharmacological perspectives to nutritional recommendations promoting the intake of alpha-linolenic acid.