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Desenho e produção de proteínas quiméricas potencialmente aplicáveis no desenvolvimento de testes diagnóstico e/ou vacinas para a febre DengueBatista, Izabella Cristina Andrade January 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A dengue é uma doença viral transmitida de mosquitos para humanos sendo a arbovirose mais prevalente em países tropicais e subtropicais, atingindo milhões de pessoas em diferentes regiões do mundo. A dengue é
causada pelo Dengue vírus (DENV), membro da família Flaviviridae, que possuem 4 sorotipos geneticamente distintos conhecidos como DENV 1-4.
Uma vacina eficiente necessita de gerar resposta imune tetravalente balanceada. Para alcançarmos essa imunidade tetravalente balanceada,trabalhamos com a hipótese de que proteínas quimérica s expressando
epítopos imunogênicos dos quatro sorotipos do DENV possam ser utilizadas no desenvolvimento de uma vacina segura e/ou um sistema de diagnóstico eficiente. Para este estudo onze proteínas quiméricas foram desenhadas
contendo regiões de proteínas com potencial imunogênico derivado do envelope, capsídeo, membrana e/ou da proteína não estrutural NS1, dos quatro sorotipos do DENV. Tais regiões foram selecionadas in silico utilizando-
se o algoritmo BepiPred. Regiões com alta homologia entre os quatro sorotipos do DENV foram preferencialmente incluídas, mas regiões antigênicas de um ou mais sorotipos do DENV também foram utilizados. As proteínas quiméricas foram construídas pela adição de resíduos de aminoácidos entre as sequências selecionadas, chamados de espaçadores, para que a estrutura dos epítopos expressos fosse mantida. A sequência final de aminoácidos foi traduzida e a sequência de nucleotídeos foi otimizada utilizando o algoritmo LETO 1.0
(Entelechon). Todas as onze proteínas quiméricas foram produzidas utilizando os vetores de expressão pET 28 TEV, pQE-9 ou pET-21ª, transformados em E. coli BL21 ou M15 e foram purificadas por cromatografia de
afinidade utilizando resina de níquel para realização de ensaios de Western blot e ELISA para testar a reatividade das proteínas com soros de indivíduos já infectados pelo DENV e indivíduos nunca infectados e testes de imunogenicidade através da imunização de camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6.
Nossos resultados mostraram um reconhecimento específico de cinco proteínas quiméricas com soros de pacientes sabidamente infectados pelo DENV-1, DENV-2 ou DENV-3. Além disso, a imunização de camundongos com a proteína quimérica EnvEpII, mostrou que esta proteína foi capaz de estimular uma produção robusta de anticorpos IgG1, IgG2a e IgG2c nas duas linhagens de camundongos testadas e de anticorpos neutralizantes
em C57BL/6. Além disso, foi observada a ativação de células T CD4+ e CD8+ em BALB/c e o aumento dos níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-17 e IFNγ, quando camundongos foram imunizados com a proteína EnvEpII.
Nossos resultados demonstram que desenhar, sintetizar, expressar e purificar proteínas quiméricas em sistemas bacterianos é viável e, dessa forma, proteínas artificiais podem ser estudadas como candidatas para o desenvolvimento de vacinas e/ou sistemas de diagnóstico contra doenças infecciosas / Dengue is the most common mosquito-borne viral disease of humans and the most prevalent arbovirus in tropical and subtropical countries, infecting thousands individuals annually in different regions of the world. Dengue is caused by Dengue virus (DENV), members of the Flaviviridae familyand is composed by 4 genetically distinct serotypes referred to as DENV 1–4. A safe vaccine demands a balanced tetravalent immune response. To address the balanced immune response, we hypothesized that chimeric proteins with potential immunogenic epitopes from the four DENV serotypes can be used to develop a safe dengue vaccine and/or an efficient diagnostic system. We designed eleven chimeras, for this the most potentially immunogenic regions of proteins derived from envelope, capsid, membrane and/or non-structural protein 1, NS1, from all DENV serotypes were in silico selected using the BepiPred algorithm. High homology regions among the four DENV serotypes were preferentially included, but antigenic regions from single or pairs of DENV serotypes were also used. The chimeras were constructed by adding non immunogenic amino acid residues between the selected sequences, named spacers residues, thus the expressed epitopes structure was maintained. The final chimeric amino acid sequence was back translated and the nucleotide sequence was optimized using the LETO 1.0 algorithm (Entelechon). All the eleven chimeric proteins were produced using the expression vectors pET 28 TEV, pQE-9 and pET-21a, transformed in E. coli BL21 or M15, and purified by Nickel-affinity chromatography to perform the Western blot and ELISA assays to test their reactivity with sera of DENV-infected patients and DENV-negative sera and to test their immunogenicity through the immunization of mice strains BALB/c and C57BL/6. Our results showed a specific recognition of five proteins by sera DENV-1, DENV-2 or DENV-3 infected patients. Moreover, the immunization using the chimera EnvEpII, shows that this protein are able to stimulate a robust production of antibodies IgG1, IgG2a and IgG2c in both mice strains tested and neutralizing antibodies were produced in C57BL/6. We also noted the activation of T cells CD4+ and CD8 + in BALB/c and the production of IL-2, IL-4, IL-17 and IFNγ when we immunized the mice with EnvEpII. Our results indicating that design, synthesize, express and purify artificial proteins in bacterial systems is viable and, thus, these proteins can be studied as candidates for the development of vaccines and/or diagnostic systems against infectious diseases.
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Antígenos candidatos à vacina contra as formassanguíneas de Plasmodium vivax: avaliação da memória imunológica de longa duraçãoMelo, Ana Luiza de Oliveira January 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A invasão dos eritrócitos pelos parasitos da malária
garante o sucesso da infecção
humana e, consequentemente, o desenvolvimento da doe
nça clínica. Desse modo,
existe grande interesse no desenvolvimento de vacina
s que possam induzir
anticorpos que bloqueiem o ciclo sanguíneo do parasito
. No caso de
Plasmodium
vivax
, o principal antígeno candidato à vacina é a
Duffy binding protein II
(DBPII),
único ligante conhecido para a invasão dos eritrócit
os humanos. Embora anticorpos
naturalmente adquiridos contra a DBPII induzam proteçã
o, faz-se necessário avaliar
se esta resposta gera memória imunológica de longa dur
ação. O trabalho aqui
desenvolvido teve como objetivo principal avaliar s
e a DBPII e outros antígenos
candidatos à vacina contra
P. vivax
induzem resposta imune humoral (anticorpos e
células B de memória, MBCs) de longa-duração. A popul
ação de estudo foi
constituída de indivíduos com história de exposição
única a
P. vivax
, ocorrida em
2003, durante um surto de transmissão autóctone na
região metropolitana de Belo
Horizonte, Minas Gerais. Para tal, foram selecionado
s indivíduos que se infectaram
(casos, n=13) ou não (não-casos, n=12) durante o pe
ríodo de transmissão. Como
controle negativo, foram incluídos indivíduos nunca
expostos à malária (BH, n=9). A
resposta de anticorpos foi avaliada pela sorologia c
onvencional (ELISA) utilizando
como antígenos diferentes variantes da DBPII (Acre1 e Sa
l1) bem como outros
antígenos candidatos à vacina (MSP1
19
e EBP2). A resposta de células B de
memória para os mesmos antígenos foi avaliada pelo e
nsaio imunoenzimático que
detecta MBCs diferenciadas em células secretoras de
anticorpos IgG (ELISpot).
Após padronizar o ensaio de ELISpot com sucesso, os n
ossos resultados
demonstram que: (1) MBCs antígeno-específicas de vida-
longa (12 anos após
exposição) foram detectadas em todos os indivíduos
do grupo caso e em parte dos
indivíduos não-casos (58%), o que sugere que infecções
assintomáticas podem ter
ocorrido na época do surto; (2) a resposta celular
de DBPII foi variante-específica,
sendo a variante Acre1 (frequente na Amazônia brasile
ira) a mais imunogênica.
Neste contexto, a cepa de referência Sal1 ou um antí
geno sintético desta cepa
(DEKnull) apresentaram pouca ou nenhuma imunogenicidad
e; (3) a MSP1
19
,
presente na superfície do parasito, foi o antígeno m
ais imunogênico, seguido da
EBP2, proteína recém-descrita em
P. vivax
; (4) em relação a sorologia convencional,
anticorpos IgG para os diferente antígenos testados n
ão perduraram após 12 anos
de exposição única a
P. vivax
.
Em conjunto, os resultados aqui apresentados
permitiram concluir que uma única e breve exposição
a
P. vivax
é capaz de induzir
MBCs antígeno-específicas de vida longa, reforçando a
importância de se estudar
estas células na avaliação da memória imunológica da
malária, particularmente,
aquela induzida por antígenos candidatos à vacina. / Erythrocyte invasion by malaria parasites is a key e
vent in ensuring human infeccion
and clinical development of the disease. Therefore,
there is great interest in
generating blocking antibodies through a blood-stage vac
cine, preventing erythocyte
invasion.
Plasmodium vivax
Duffy binding protein region II (DBPII) is the only kn
own
ligand for human reticulocyte invasion, hence being a
n attractive vaccine candidate
against asexual blood-stage
P. vivax
. Although there is evidence that naturally
acquired anti-DBPII antibodies induce protection, it i
s necessary to access if this
response produces sustained long-lasting immunologica
l memory. Thereafter, the
present work aimed to evaluate whether DBPII and other
P. vivax
vaccine candidates
induce long-lasting humoral immune response (antibod
ies and memory B cells,
MBCs). For this purpose, we studied a population with a
single
P. vivax
exposure in
2003, during an autochthonous outbreak in Minas Gera
is state, a non-endemic area
of Brazil. We selected 25 individuals exposed to the
outbreak being 13 with
confirmed
P. vivax
infection (cases) and 12 who had not being diagnosed
with
malaria (non-cases). As negative control, were includ
ed 9 individuals never exposed
to malaria (residents in Belo Horizonte). Antibody re
sponses to
P. vivax
blood
antigens were evaluated by conventional serology (ELISA),
focusing on two DBPII
variants (Acre1 e Sal1) and other vaccine candidates
(MSP1
19
e EBP2). B cell
memory responses to the same antigens were evaluated
through Enzyme-Linked
ImmunoSpot (ELISpot) targeting IgG secreting cells. After
stablishment of the
ELISpot assay, our results showed that: (1) long-last
ing antigen-specific MBCs were
detected 12 years after exposure in all of the case
s and in part of the non-cases
(58%), wich suggests the occurrence of asymptomatic i
nfections during the outbreak;
(2) cellular response to DBPII was variant-specific, wi
th greater immunogenicity of
variant Acre1 (most frequent in the Amazon region). Re
garding cellular response, the
reference strain Sal1 and the synthetic construct (
DEKnull) showed low or absence
of immunogenicity; (3) MSP1
19
, presente in the parasite’s surfasse, was highly
immunogenic, followed by EBP2,
P. vivax
’s new predicted protein; (4) regarding
conventional serology, IgG antibody responses to the
different antigens here tested
did not last after 12 years of exposure to
P. vivax
. Altogether our results showed that
a single brief exposure to
P. vivax
is able to induce antigen-specific long-lasting
MBCs, reinforcing the importance of this cells in acc
essing immunological memory in
malaria, particularly, that induced by vaccine cand
idates.
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