A malária continua sendo um dos maiores problemas de saúde pública no mundo e apesar dos muitos esforços no combate a doença, as estratégias disponíveis hoje ainda não foram capazes de controlar com eficiência sua disseminação global. Por isso o desenvolvimento de uma vacina é de extrema importância. Devido a complexidade do ciclo do parasita, consideramos que uma formulação vacinal eficaz para a indução de resposta imune protetora contra o P. vivax deverá conter regiões de antígenos de vários estágios do parasita. Dentre os vários antígenos da fase sanguínea do plasmódio identificados, o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA1), a porção C-terminal da Proteína 1 de Superfície do Merozoíto (MSP119) e as proteínas da família MSP3 têm se mostrado promissores. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a resposta imune celular induzida em camundongos pela imunização experimental com antígenos de P. vivax candidatos a vacina, tendo como foco principal a combinação das proteínas AMA1, MSP119 e MSP3β. Inicialmente, as imunizações experimentais com a combinação dos 3 antígenos foram realizadas na presença de Adjuvante Incompleto de Freund (AIF) em camundongos C57BL/6. Os camundongos imunizados não apresentaram respostas significativas com proliferação e secreção de IFN-γ por linfócitos T CD4+ e CD8+ após estimulação in vitro com as proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos baseados na proteína AMA1. Por outro lado, o adjuvante Poly (I:C) mostrou-se mais eficiente na indução de resposta proliferativa por linfócitos T CD4+, quando testado com a proteína MSP119-PADRE. Assim, selecionamos este adjuvante para dar continuidade às imunizações experimentais com a combinação de antígenos. Por ELISPOT, foi possível demonstrar que a co-administração dos 3 antígenos foi capaz de estimular células produtoras de IFN-γ em resposta à todos os antígenos testados. Também foi nosso objetivo avaliar a produção de IFN-γ após imunização de linhagens distintas de camundongos com uma proteína quimérica recentemente produzida em nosso laboratório (AMA1-MSP119). Em C57BL/6, a produção de IFN-γ foi significativamente maior no grupo imunizado com a proteína de fusão, quando comparado com o grupo que recebeu a co-adminstração dos dois antígenos, mostrando que a utilização de proteínas fusionadas pode solucionar possíveis problemas de competição antigênica. Em conjunto, nossos dados demonstram que a utilização de múltiplos antígenos fusionados, ou co-administrados, pode ser uma estratégia promissora de vacinação contra a malária. / Malaria remains as a major public health problem worldwide. In spite of the efforts for prevention, the strategies available today have not succeeded to control its global distribution. Therefore, the development of a vaccine is extremely important. Due to the complexity of the parasite cycle, we consider that an effective vaccine formulation to induce protective immune response against P. vivax should contain regions of antigens from several stages of the parasite. Among the different blood stage antigens of Plasmodium identified, the Apical Membrane Antigen 1 (AMA1), the C-terminal portion of the Merozoite Surface Protein 1 (MSP119) and MSP3 family proteins have shown promising results. Therefore, the aim of this study was to characterize the cellular immune response induced in mice by experimental immunization with antigens from P. vivax vaccine candidates, focusing mainly on the combination of proteins AMA1, MSP119 and MSP3β. Initially, the experimental immunizations with the combination of the three antigens were performed in the presence of Incomplete Freund\'s Adjuvant (IFA) in C57BL/6 mice. Immunized mice displayed no significant proliferative responses and secretion of IFN-γ by CD4+ and CD8+ T lymphocytes after in vitro stimulation with recombinant proteins or synthetic peptides based on the AMA1 protein. In contrast, Poly (I:C) adjuvant was more efficient inducing CD4+ T lymphocytes proliferative response to the MSP119-PADRE protein. Thus, we selected this adjuvant to continue the experimental immunizations with the different antigen combinations. The ELISPOT results demonstrated that co-administration of the 3 antigens stimulated IFN-γ producing cells in response to all antigens tested. We also assessed the production of IFN-γ after immunization of distinct mouse strains with a chimeric protein produced recently in our laboratory (AMA1-MSP119). In C57BL/6, IFN-γ production was significantly higher when we used spleen cells from mice immunized with the fusion protein, when compared with cells from mice that received the co-administration of two antigens, showing that the use of fused proteins can solve possible antigenic competition problems. Together, our data demonstrate that the use of multiple fused or co-administered antigens may be a promising strategy for malaria vaccination.

A malária continua sendo um dos maiores problemas de saúde pública no mundo e apesar dos muitos esforços no combate a doença, as estratégias disponíveis hoje ainda não foram capazes de controlar com eficiência sua disseminação global. Por isso o desenvolvimento de uma vacina é de extrema importância. Devido a complexidade do ciclo do parasita, consideramos que uma formulação vacinal eficaz para a indução de resposta imune protetora contra o P. vivax deverá conter regiões de antígenos de vários estágios do parasita. Dentre os vários antígenos da fase sanguínea do plasmódio identificados, o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA1), a porção C-terminal da Proteína 1 de Superfície do Merozoíto (MSP119) e as proteínas da família MSP3 têm se mostrado promissores. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a resposta imune celular induzida em camundongos pela imunização experimental com antígenos de P. vivax candidatos a vacina, tendo como foco principal a combinação das proteínas AMA1, MSP119 e MSP3β. Inicialmente, as imunizações experimentais com a combinação dos 3 antígenos foram realizadas na presença de Adjuvante Incompleto de Freund (AIF) em camundongos C57BL/6. Os camundongos imunizados não apresentaram respostas significativas com proliferação e secreção de IFN-γ por linfócitos T CD4+ e CD8+ após estimulação in vitro com as proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos baseados na proteína AMA1. Por outro lado, o adjuvante Poly (I:C) mostrou-se mais eficiente na indução de resposta proliferativa por linfócitos T CD4+, quando testado com a proteína MSP119-PADRE. Assim, selecionamos este adjuvante para dar continuidade às imunizações experimentais com a combinação de antígenos. Por ELISPOT, foi possível demonstrar que a co-administração dos 3 antígenos foi capaz de estimular células produtoras de IFN-γ em resposta à todos os antígenos testados. Também foi nosso objetivo avaliar a produção de IFN-γ após imunização de linhagens distintas de camundongos com uma proteína quimérica recentemente produzida em nosso laboratório (AMA1-MSP119). Em C57BL/6, a produção de IFN-γ foi significativamente maior no grupo imunizado com a proteína de fusão, quando comparado com o grupo que recebeu a co-adminstração dos dois antígenos, mostrando que a utilização de proteínas fusionadas pode solucionar possíveis problemas de competição antigênica. Em conjunto, nossos dados demonstram que a utilização de múltiplos antígenos fusionados, ou co-administrados, pode ser uma estratégia promissora de vacinação contra a malária. / Malaria remains as a major public health problem worldwide. In spite of the efforts for prevention, the strategies available today have not succeeded to control its global distribution. Therefore, the development of a vaccine is extremely important. Due to the complexity of the parasite cycle, we consider that an effective vaccine formulation to induce protective immune response against P. vivax should contain regions of antigens from several stages of the parasite. Among the different blood stage antigens of Plasmodium identified, the Apical Membrane Antigen 1 (AMA1), the C-terminal portion of the Merozoite Surface Protein 1 (MSP119) and MSP3 family proteins have shown promising results. Therefore, the aim of this study was to characterize the cellular immune response induced in mice by experimental immunization with antigens from P. vivax vaccine candidates, focusing mainly on the combination of proteins AMA1, MSP119 and MSP3β. Initially, the experimental immunizations with the combination of the three antigens were performed in the presence of Incomplete Freund\'s Adjuvant (IFA) in C57BL/6 mice. Immunized mice displayed no significant proliferative responses and secretion of IFN-γ by CD4+ and CD8+ T lymphocytes after in vitro stimulation with recombinant proteins or synthetic peptides based on the AMA1 protein. In contrast, Poly (I:C) adjuvant was more efficient inducing CD4+ T lymphocytes proliferative response to the MSP119-PADRE protein. Thus, we selected this adjuvant to continue the experimental immunizations with the different antigen combinations. The ELISPOT results demonstrated that co-administration of the 3 antigens stimulated IFN-γ producing cells in response to all antigens tested. We also assessed the production of IFN-γ after immunization of distinct mouse strains with a chimeric protein produced recently in our laboratory (AMA1-MSP119). In C57BL/6, IFN-γ production was significantly higher when we used spleen cells from mice immunized with the fusion protein, when compared with cells from mice that received the co-administration of two antigens, showing that the use of fused proteins can solve possible antigenic competition problems. Together, our data demonstrate that the use of multiple fused or co-administered antigens may be a promising strategy for malaria vaccination.

Consistent efficacy in human clinical trials has been achieved by two leading malaria vaccine candidates encoding either the P. falciparum circumsporozoite (CSP) or thrombospondin-related adhesion (TRAP) proteins. However, protection in humans relies on high antibody (Ab) titers or potent T cells, respectively, when these antigens are used individually. Therefore, a concurrent induction of both anti-CSP antibodies and TRAP-specific T cells may further improve the protective efficacy associated with these immunogens. This thesis investigates the protective potential associated with CSP and TRAP combination vaccines by employing a pre-clinical Plasmodium berghei (P. berghei) mouse malaria challenge model. Depletion of CD4⁺ and CD8⁺ T cells indicated that protection by the CSP antigen relied solely on antibodies while TRAP protected through CD8⁺ T cell responses. Moreover, the administration of relatively small amount of anti-CSP monoclonal antibodies (mAb) substantially enhanced the sub-optimal protection elicited by TRAP. A way to maximize both, anti-CSP antibodies by adenovirus/protein (Ad-P) prime-boost vaccinations and anti-TRAP T cell responses using adenovirus/modified vaccinia strain Ankara (Ad-M), was explored. Combination of the two approaches stimulated optimal humoral and cellular responses that afforded sterile protection in the C57BL/6 animal model. Additional analyses of the effector functions of Abs indicated that the efficacy of this vaccine relied on a two-stage attack against the parasite: anti-CS antibodies reduced the number of sporozoites reaching the liver, thus decreasing the number of infected hepatocytes required to be eliminated by the dual action of natural killer (NK) cells and CD8⁺ T cells. These proof-of-concept studies using a wild-type (wt) P. berghei challenge model allowed progression towards the development of human malaria Plasmodium vivax (P. vivax) vaccines using PvCSP and PvTRAP antigens. The immunogenicity of PvCSP and PvTRAP-based vaccine candidates was assessed in multiple mouse strains. Additionally, transgenic (tg) P. berghei parasites expressing P. vivax genes were generated and used to demonstrate the protective efficacy of Ad-P PvCSP and Ad-M PvTRAP vaccines.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-09-09T16:09:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_AnaLuizadeOliveiraMelo.pdf: 1146825 bytes, checksum: f9548418adf5b24a482d3266c5926802 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-09-09T17:55:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_AnaLuizadeOliveiraMelo.pdf: 1146825 bytes, checksum: f9548418adf5b24a482d3266c5926802 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-09T17:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_AnaLuizadeOliveiraMelo.pdf: 1146825 bytes, checksum: f9548418adf5b24a482d3266c5926802 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A invasão dos eritrócitos pelos parasitos da malária garante o sucesso da infecção humana e, consequentemente, o desenvolvimento da doe nça clínica. Desse modo, existe grande interesse no desenvolvimento de vacina s que possam induzir anticorpos que bloqueiem o ciclo sanguíneo do parasito . No caso de Plasmodium vivax , o principal antígeno candidato à vacina é a Duffy binding protein II (DBPII), único ligante conhecido para a invasão dos eritrócit os humanos. Embora anticorpos naturalmente adquiridos contra a DBPII induzam proteçã o, faz-se necessário avaliar se esta resposta gera memória imunológica de longa dur ação. O trabalho aqui desenvolvido teve como objetivo principal avaliar s e a DBPII e outros antígenos candidatos à vacina contra P. vivax induzem resposta imune humoral (anticorpos e células B de memória, MBCs) de longa-duração. A popul ação de estudo foi constituída de indivíduos com história de exposição única a P. vivax , ocorrida em 2003, durante um surto de transmissão autóctone na região metropolitana de Belo Horizonte, Minas Gerais. Para tal, foram selecionado s indivíduos que se infectaram (casos, n=13) ou não (não-casos, n=12) durante o pe ríodo de transmissão. Como controle negativo, foram incluídos indivíduos nunca expostos à malária (BH, n=9). A resposta de anticorpos foi avaliada pela sorologia c onvencional (ELISA) utilizando como antígenos diferentes variantes da DBPII (Acre1 e Sa l1) bem como outros antígenos candidatos à vacina (MSP1 19 e EBP2). A resposta de células B de memória para os mesmos antígenos foi avaliada pelo e nsaio imunoenzimático que detecta MBCs diferenciadas em células secretoras de anticorpos IgG (ELISpot). Após padronizar o ensaio de ELISpot com sucesso, os n ossos resultados demonstram que: (1) MBCs antígeno-específicas de vida- longa (12 anos após exposição) foram detectadas em todos os indivíduos do grupo caso e em parte dos indivíduos não-casos (58%), o que sugere que infecções assintomáticas podem ter ocorrido na época do surto; (2) a resposta celular de DBPII foi variante-específica, sendo a variante Acre1 (frequente na Amazônia brasile ira) a mais imunogênica. Neste contexto, a cepa de referência Sal1 ou um antí geno sintético desta cepa (DEKnull) apresentaram pouca ou nenhuma imunogenicidad e; (3) a MSP1 19 , presente na superfície do parasito, foi o antígeno m ais imunogênico, seguido da EBP2, proteína recém-descrita em P. vivax ; (4) em relação a sorologia convencional, anticorpos IgG para os diferente antígenos testados n ão perduraram após 12 anos de exposição única a P. vivax . Em conjunto, os resultados aqui apresentados permitiram concluir que uma única e breve exposição a P. vivax é capaz de induzir MBCs antígeno-específicas de vida longa, reforçando a importância de se estudar estas células na avaliação da memória imunológica da malária, particularmente, aquela induzida por antígenos candidatos à vacina. / Erythrocyte invasion by malaria parasites is a key e vent in ensuring human infeccion and clinical development of the disease. Therefore, there is great interest in generating blocking antibodies through a blood-stage vac cine, preventing erythocyte invasion. Plasmodium vivax Duffy binding protein region II (DBPII) is the only kn own ligand for human reticulocyte invasion, hence being a n attractive vaccine candidate against asexual blood-stage P. vivax . Although there is evidence that naturally acquired anti-DBPII antibodies induce protection, it i s necessary to access if this response produces sustained long-lasting immunologica l memory. Thereafter, the present work aimed to evaluate whether DBPII and other P. vivax vaccine candidates induce long-lasting humoral immune response (antibod ies and memory B cells, MBCs). For this purpose, we studied a population with a single P. vivax exposure in 2003, during an autochthonous outbreak in Minas Gera is state, a non-endemic area of Brazil. We selected 25 individuals exposed to the outbreak being 13 with confirmed P. vivax infection (cases) and 12 who had not being diagnosed with malaria (non-cases). As negative control, were includ ed 9 individuals never exposed to malaria (residents in Belo Horizonte). Antibody re sponses to P. vivax blood antigens were evaluated by conventional serology (ELISA), focusing on two DBPII variants (Acre1 e Sal1) and other vaccine candidates (MSP1 19 e EBP2). B cell memory responses to the same antigens were evaluated through Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISpot) targeting IgG secreting cells. After stablishment of the ELISpot assay, our results showed that: (1) long-last ing antigen-specific MBCs were detected 12 years after exposure in all of the case s and in part of the non-cases (58%), wich suggests the occurrence of asymptomatic i nfections during the outbreak; (2) cellular response to DBPII was variant-specific, wi th greater immunogenicity of variant Acre1 (most frequent in the Amazon region). Re garding cellular response, the reference strain Sal1 and the synthetic construct ( DEKnull) showed low or absence of immunogenicity; (3) MSP1 19 , presente in the parasite’s surfasse, was highly immunogenic, followed by EBP2, P. vivax ’s new predicted protein; (4) regarding conventional serology, IgG antibody responses to the different antigens here tested did not last after 12 years of exposure to P. vivax . Altogether our results showed that a single brief exposure to P. vivax is able to induce antigen-specific long-lasting MBCs, reinforcing the importance of this cells in acc essing immunological memory in malaria, particularly, that induced by vaccine cand idates.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-21T12:12:27Z No. of bitstreams: 1 robertareissoares.pdf: 5933538 bytes, checksum: b54bb391cf221f53ba8ab332d78dcb44 (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: on 2017-08-24T11:30:02Z (GMT) / Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-24T15:19:55Z No. of bitstreams: 0 / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: IsaBELA acho q células b o B deveria ser maiúsculo. Verifique, por favor. on 2017-08-30T14:33:13Z (GMT) / Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-31T10:42:30Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-31T12:25:29Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-08-31T12:25:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2017-03-31 / A malária constitui um dos maiores problemas de saúde pública mundial, sendo responsável por aproximadamente meio milhão de mortes anuais. Por isso, e devido à crescente resistência dos parasitos aos antimaláricos usuais e aumento do número de casos graves, sobretudo os ocasionados por P. vivax, grandes esforços têm sido dispensados no desenvolvimento de vacinas. Até o momento, a única vacina licenciada mostrou-se capaz de conferir algum grau de imunidade contra P. falciparum, porém a inabilidade de manutenção de resposta protetora ao longo do tempo tem sido um grande desafio a ser superado. Indivíduos naturalmente expostos à doença desenvolvem graus variados de proteção, que parece ser perdida na ausência de reestímulos. Essas observações apontam para falhas na memória imunológica mediada por células B. No Brasil, onde cerca de 85% dos episódios de malária são atribuídos a P. vivax, estudos acerca do desenvolvimento e manutenção de memória imunológica são escassos. O entendimento de fatores que possam modular as respostas imunes durante e após a malária são importantes no desenvolvimento de vacinas. Esse estudo teve como objetivo avaliar aspectos clínicos e hematológicos, verificar a geração e persistência de anticorpos e células B de memória (MBCs) direcionadas aos peptídeos sintéticos (PvAMA-1(S290-K307) e PvMSP-9(E795-A808)), bem como à proteína recombinante PvAMA-1DII e averiguar a ocorrência de flutuações no compartimento de células B em indivíduos durante a malária aguda e em 30, 60 e 180 dias decorridos do diagnóstico (convalescença) por P. vivax. Os resultados obtidos mostraram que alterações hematológicas ocorerram predominantemente na fase aguda, destacando-se plaquetopenia, linfopenia e leucopenia. Na fase aguda da infecção, indivíduos exibiram MBCs e anticorpos específicos para PvAMA-1(S290-K307) e PvMSP-9(E795-A808), bem como para a PvAMA-1DII, os quais persistiram, de maneira geral, por > 180 dias na ausência de reinfecções/recaídas. Não foram observadas associações positivas entre respostas de anticorpos e MBCs ao longo do tempo para todos os antígenos avaliados. Além disso, este estudo corroborou a relação entre exposição/infecção malárica e ocorrência de flutuações no perfil fenotípico de subpopulações de células B no sangue periférico, com destaque para a expansão de imaturas e plasmáticas durante a fase aguda da doença. No tocante às MBCs atípicas, independentemente do grupo avaliado (controles expostos, fase aguda ou convalescença) estas células se encontraram expandidas em relação ao observado em indivíduos não expostos à malária. Os dados desse estudo ainda sugerem que a expansão de células B atípicas observada em indivíduos provenientes de área endêmica é influenciada pela ocorrência de episódios pregressos da doença. Estudos posteriores são de fundamental importância para determinar o impacto de tais alterações em estratégias de imunizações voltadas ao combate da malária vivax em populações expostas em regiões de baixa transmissão de malária na Amazônia Brasileira. / Malaria is one of the greatest public health problems in the world, accounting for approximately half a million annual deaths. Therefore, due to the increasing resistance of the parasites to the usual antimalarials and an increase in the number of severe cases, especially those caused by P. vivax, great efforts have been dispensed with in the development of vaccines. To date, the only licensed vaccine has been shown to confer some degree of immunity against P. falciparum, but the inability to maintain a protective response over time has been a major challenge to be overcome. Individuals naturally exposed to the disease develop varying degrees of protection, which seems to be lost in the absence of re-stimulation. These observations point to failures in B cells-mediated immune memory. In Brazil, where about 85% of malaria episodes are attributed to P. vivax, studies on the development and maintenance of immune memory are scarce. Understanding of factors that can modulate immune responses during and after malaria are important in the development of vaccines. This study aimed to evaluate clinical and hematological aspects, to verify the generation and persistence of antibodies and memory B cells (MBCs) directed to synthetic peptides (PvAMA-1(S290-K307) and PvMSP-9(E795-A808)), as well as to the recombinant protein PvAMA-1DII and to investigate the occurrence of fluctuations in the B cell compartment in individuals during acute malaria and at 30, 60 and 180 days after the diagnosis (convalescence) of P. vivax. The results showed that hematological alterations occurred predominantly in the acute phase, especially thrombocytopenia, lymphopenia and leucopenia. In the acute phase of infection, individuals exhibited MBCs and antibodies specific for PvAMA-1(S290-K307) and PvMSP-9(E795-A808) as well as for PvAMA-1DII, which generally persisted > 180 days in the absence of reinfections/relapses. No positive associations between antibody responses and MBCs over time were observed for all antigens evaluated. In addition, this study corroborated the relationship between exposure/malarial infection and occurrence of fluctuations in the phenotypic profile of B-cell subpopulations in peripheral blood, with emphasis on immature and plasma expansion during the acute phase of the disease. Regarding atypical MBCs, regardless of the group evaluated (exposed controls, acute phase or convalescence), these cells were expanded in relation to that observed in individuals not exposed to malaria. The data from this study still suggest that the expansion of atypical B cells observed in individuals from the endemic area is influenced by the occurrence of previous episodes of the disease. Subsequent studies are of fundamental importance to determine the impact of such changes on immunization strategies aimed at combating vivax malaria in populations exposed in regions of low malaria transmission in the Brazilian Amazon.

Malaria is one of the oldest parasitic diseases known to man, and the disease has played a role in shaping civilizations and the success of human populations over many centuries. While the malaria is well studied, it still remains a worldwide killer--claiming about 600,000 lives annually with children under the age of five representing a disproportionate population of those lethally infected. Malaria is caused by the protozoan parasite Plasmodium, which is introduced to the human body through the bite of a female Anopheles mosquito. The most lethal form of the disease is carried by the parasite Plasmodium falciparum, while the most widespread form of malaria is caused by Plasmodium vivax, the latter of which has a specific mode of entry and life cycle that makes it difficult to eradicate. The entry of P. vivax into human reticulocytes is based on the presence of the Duffy antigen chemokine receptor (DARC), which is uniquely absent in two-thirds of the Black population and populations of immediate African descent making it rare in the African region while endemic in Western and Asian countries. Inability to culture the parasite P. vivax in vitro and exhaustible tissue samples makes an accurate model of P. vivax malaria difficult to maintain ex vivo. The current study focuses on overcoming those limitations by modeling the mode of entry of P. vivax into patient-specific, induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived erythrocyte-lineage cells by showing firstly that DARC is a measurable marker of susceptibility in vitro via FACS analysis, and that secondly, P. vivax cell culture limitations can be bypassed by creating a lentivirus designed to specifically infect DARC-expressing cells. To demonstrate the potency of this system, we show that a virus expressing the conserved region of the Duffy binding ligand, Duffy binding protein II (DBPII), can selectively infect peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) that express DARC. Moreover, our current study focuses on the development of an iPSC-based disease model using patient samples derived from DARC expressing patients (DARC+) and DARC negative Sickle Cell Disease (SCD) patients (DARC-). We show that DARC+ iPSC-derived erythroid lineage cells express a transient population of DARC-expressing cells via FACS analysis, and we explore different protocols to stabilize this unique population. We hypothesize that DARC is a stage-specific marker for erythrocyte maturation, and we believe that any subset of cells expressing DARC consists of more mature erythrocyte-lineage cells. This study then, provides a novel platform by which to study malaria infection in a patient-specific manner while bypassing the limitations of culturing P. vivax in an in vitro culture system, as well as introducing a new way to measure erythrocyte maturation. Successful establishment of such a disease model has great implications for in-depth drug screenings for novel therapeutics that target the blood stage of the parasitic disease that were previously difficult to validate due to the limitations of currently existing models.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:33:42Z : No. of bitstreams: 1 cassiano_gc_me_sjrp.pdf: 5020075 bytes, checksum: 3cff0abab9c0ce6b6d89b1c811d80e65 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Responsável por 300 a 500 milhões de novas infecções e 1,5 a 3 milhões de mortes por ano no mundo inteiro, a malária continua sendo a principal doença parasitária. Se importante é o combate contra os parasitos, importante também é o conhecimento dos aspectos de incidência, distribuição, especificidade de hospedeiros, além do conhecimento de fatores biológicos e moleculares que determinam a distribuição destes. Neste cenário, um dos principais parâmetros analisados para o controle e monitoramento da malária é a detecção de espécies de Plasmodium nos vetores capazes de infectarem humanos. Embora existam diversas metodologias com este fim, a maioria delas apresenta algumas limitações. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método que permita a identificação do P. falciparum, do P. malariae e das variantes do P. vivax no vetor. Uma PCR foi padronizada, utilizando iniciadores contra regiões específicas do gene CS. A PCR-RFLP foi utilizada para distinguir as variantes do P. vivax. A eficiência da metodologia desenvolvida foi comparada com uma nested-PCR, utilizando Anopheles infectados experimentalmente. Um total de 90 mosquitos foram infectados artificialmente com P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) e P.malariae (n = 30). Estes mosquitos infectados, juntamente com outros 30 não infectados foram avaliados em relação a identificação do Plasmodium por nested PCR e com o CS-PCR. A nested PCR para o P. vivax, P. falciparum e P. malariae identificou 19, 16 e 21 mosquitos positivos, respectivamente; enquanto o CS-PCR detectou em 17, 14 e 16 mosquitos, respectivamente. A comparação entre os dois métodos revelou uma boa concordância (κ = 0,723, 0,867 e 0,657, respectivamente, para P. vivax, P. falciparum... / Malaria remains the most serious vector-borne disease, affecting some 300-500 million people annually, causing 1.5-3 million deaths. Is important the fight against the parasites, but it is also important the knowledge of the incidence, host specificity, molecular and biological factors determining the distribution of these parasites. In this scenario, identification of the human-specific Plasmodium species in the mosquito host is an essential component for planning and monitoring of malaria control operations. However, most of the detection methods show some potential limitations. The objective of this study was development an effective assay for detecting Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae and Plasmodium vivax variants in Anopheles mosquitoes. A PCR was development targeting the CS gene. A PCR-RFLP was used to distinguish the P. vivax variants VK210, VK247 and P. vivax-like. The new PCR assay was compared against a nested PCR using artificially infected Anopheles mosquitoes. A total of 90 mosquitoes were artificially infected with P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) and P. malariae (n = 30). These infected mosquitoes along with another 30 unfed mosquitoes were checked for the identification of Plasmodium by nested PCR and with the CS-PCR. Nested PCR for P. vivax, P. falciparum and P. malariae detected positive infection in 19, 16 and 21 mosquitoes respectively; whereas CS-PCR detected in 17, 14 and 16 mosquitoes, respectively. The comparison revealed a close agreement between the two assays (κ = 0.723, 0.867 and 0.657, respectively for P. vivax, P. falciparum and P. malariae groups). Subsequently, PCR-RFLP efficiently discriminate P. vivax variants... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Ricardo Luiz Dantas Machado / Banca: Mauro Toledo Marrelli / Banca: Carlos Eugênio Cavasini / Resumo: Responsável por 300 a 500 milhões de novas infecções e 1,5 a 3 milhões de mortes por ano no mundo inteiro, a malária continua sendo a principal doença parasitária. Se importante é o combate contra os parasitos, importante também é o conhecimento dos aspectos de incidência, distribuição, especificidade de hospedeiros, além do conhecimento de fatores biológicos e moleculares que determinam a distribuição destes. Neste cenário, um dos principais parâmetros analisados para o controle e monitoramento da malária é a detecção de espécies de Plasmodium nos vetores capazes de infectarem humanos. Embora existam diversas metodologias com este fim, a maioria delas apresenta algumas limitações. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método que permita a identificação do P. falciparum, do P. malariae e das variantes do P. vivax no vetor. Uma PCR foi padronizada, utilizando iniciadores contra regiões específicas do gene CS. A PCR-RFLP foi utilizada para distinguir as variantes do P. vivax. A eficiência da metodologia desenvolvida foi comparada com uma nested-PCR, utilizando Anopheles infectados experimentalmente. Um total de 90 mosquitos foram infectados artificialmente com P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) e P.malariae (n = 30). Estes mosquitos infectados, juntamente com outros 30 não infectados foram avaliados em relação a identificação do Plasmodium por nested PCR e com o CS-PCR. A nested PCR para o P. vivax, P. falciparum e P. malariae identificou 19, 16 e 21 mosquitos positivos, respectivamente; enquanto o CS-PCR detectou em 17, 14 e 16 mosquitos, respectivamente. A comparação entre os dois métodos revelou uma boa concordância (κ = 0,723, 0,867 e 0,657, respectivamente, para P. vivax, P. falciparum... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Malaria remains the most serious vector-borne disease, affecting some 300-500 million people annually, causing 1.5-3 million deaths. Is important the fight against the parasites, but it is also important the knowledge of the incidence, host specificity, molecular and biological factors determining the distribution of these parasites. In this scenario, identification of the human-specific Plasmodium species in the mosquito host is an essential component for planning and monitoring of malaria control operations. However, most of the detection methods show some potential limitations. The objective of this study was development an effective assay for detecting Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae and Plasmodium vivax variants in Anopheles mosquitoes. A PCR was development targeting the CS gene. A PCR-RFLP was used to distinguish the P. vivax variants VK210, VK247 and P. vivax-like. The new PCR assay was compared against a nested PCR using artificially infected Anopheles mosquitoes. A total of 90 mosquitoes were artificially infected with P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) and P. malariae (n = 30). These infected mosquitoes along with another 30 unfed mosquitoes were checked for the identification of Plasmodium by nested PCR and with the CS-PCR. Nested PCR for P. vivax, P. falciparum and P. malariae detected positive infection in 19, 16 and 21 mosquitoes respectively; whereas CS-PCR detected in 17, 14 and 16 mosquitoes, respectively. The comparison revealed a close agreement between the two assays (κ = 0.723, 0.867 and 0.657, respectively for P. vivax, P. falciparum and P. malariae groups). Subsequently, PCR-RFLP efficiently discriminate P. vivax variants... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2013-03-19T16:07:54Z No. of bitstreams: 1 Ana_Carolina.pdf: 2560132 bytes, checksum: 663a398860ff953a4b1de21a209ee151 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-19T16:07:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana_Carolina.pdf: 2560132 bytes, checksum: 663a398860ff953a4b1de21a209ee151 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O desenvolvimento de uma vacina para malária é considerado atualmente uma prioridade em saúde pública pelo impacto socioeconômico e morbidade da doença com 250 milhões de novos casos por ano. A vacina de febre amarela é considerada uma das vacinas mais bem sucedidas por sua imunogenicidade duradora obtida após uma única dose. Frente a elucidação das respostas polivalentes dirigidas ao vírus vacinal 17D, a utilização do mesmo como vetor de expressão para antígenos heterólogos têm sido encorajada. Tendo em vista que febre amarela e malária compartilham grandes zonas endêmicas nos continentes americano e africano, a construção de uma vacina para malária baseada no vetor de febre amarela 17D se tornou uma abordagem interessante. Foram construídos dois vírus recombinantes contendo a proteína heteróloga MSP-119de P. falciparum (FA17D/MSP-119fal) e P. vivax (FA17D/MSP-119vivax) entre os genes E/NS1 de FA. Esta proteína é constituída de um fragmento de 19 kDa obtido após o processamento proteolítico da proteína de superfície do merozoíta 1 (MSP-1) durante a invasão do eritrócito e é descrita como alvo de anticorpos protetores em animais e pessoas imunes. Os vírus recombinantes foram caracterizados in vitro quanto à capacidade proliferativa em células Vero, estabilidade genética e expressão da proteína heteróloga por microscopia confocal de imunofluorescência e western blotting. A imunização de camundongos BALB/c e primatas não-humanos da espécie Saimiri sciureus foi usada para avaliar as construções quanto à imunogenicidade. Ambos os vírus foram capazes de induzir a produção de anticorpos neutralizantes contra a FA, porém em menores títulos do que os induzidos pelo vírus vacinal 17DD. A indução de anticorpos específicos para a proteína heteróloga após a imunização com os diferentes vírus recombinantes, também foi demonstrada e resultou em baixos títulos de IgG.em ambos os modelos. Os anticorpos induzidos no modelo com macacos Saimiri reconheceram a proteína nativa do parasita em hemácias infectadas por P. falciparum. No entanto, o desafio realizado neste modelo de primata não-esplenectomizado após a imunização com FA17D/MSP-119fal não gerou resultados conclusivos. Estes resultados sugerem a necessidade de aprimoramento da plataforma de expressão em busca de maior imunogenicidade. / The development of a vaccine for malaria is currently considered a priority in public health due to the socioeconomic impact and morbidity of the disease with 250 million new cases registered every year. The yellow fever vaccine is considered one of the most successful vaccines for its longlasting immunogenicity obtained after a single dose. As a result of the elucidation of the polyvalent responses directed to YF17D vaccine virus, the use of this virus as an expression vector of heterologous antigens has been encouraged. Considering that yellow fever and malaria share the major endemic areas in American and African continents, the construction of a vaccine for malaria based on the yellow fever 17D vector became an interesting approach. Two recombinant viruses containing the heterologous protein MSP-119 from P. falciparum (YF17D/MSP-119fal) and P. vivax (YF17D/MSP-119vivax) inserted between the E/NS1 genes have been constructed. This protein consists of a 19 kDa fragment obtained after proteolytic processing of the merozoite surface protein 1 (MSP-1) during invasion of erythrocytes and is described as a target for protective antibodies in animals and immune people. Recombinant viruses were characterized in vitro for their proliferative capacity in Vero cells and genetic stability and expression of heterologous protein were assessed by confocal immunofluorescence and Western blotting. Immunization of BALB/c mice and non-human primate species Saimiri sciureus allowed the evaluation of the constructions in terms of immunogenicity. Both viruses were capable of inducing neutralizing antibodies to YF, but in lower titers than those induced by the vaccine virus 17DD.The induction of specific antibodies for the heterologous protein by the different recombinant viruses was also demonstrated by low levels of IgG in both models. The antibodies induced in this monkey model bound to the native protein in parasite-infected red blood cells by immunofluorescence. The challenge carried out in after immunization of Saimiri monkeys with FA17D/MSP-119fal did not generate conclusive results. These data suggest the need to improve the platform of expression towards higher viral immunogenicity.

Isoprenoids are the largest family of biologically active compounds, synthesized by five carbon subunits namely isopentenyl pyrophosphate (IPP) and dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP). For long time the mevalonate-dependent (MVA) pathway has been considered as the sole source of IPP and DMAPP, until recently a new non-mevalonte dependent (NMVA) pathway was discovered. This new pathway utilizes entirely different set of enzymes for isoprenoids synthesis and don't have any homologues in humans. NMVA pathway is the only source of isoprenoids for certain eubacteria, parasite and plants. Absence of the NMVA pathway in higher organisms has opened a new platform for the development of novel antibiotics and antimalarials. 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS), the first enzyme in NMVA pathway has been reported as the rate limiting enzyme in the synthesis of IPP and DMAPP and has been the center of interest for inhibitor development. Reaction mechanism of thiamine pyrophosphate (TPP) and Mg2+ dependent DXS enzyme has been studied in this report. Using steady state kinetics analysis, product inhibition and dead end inhibitor, the mechanism of substrate (pyruvate and D-glyceraldehyde-3-phosphate) addition was studied. Due to different domain organization in DXS as compared to theother TPP dependent enzyme, the mechanism of addition was found to be random sequential rather than ping-pong mechanism. Based on bioinformatics tool and in vitro studies it has been established that NMVA exists in all the plasmodium species, thus making the enzymes involved in NMVA as an alluring target for new antimalarial drugs. All the plasmodium species and other member of the phylum apicomplexa harbor apicoplast an organelle which is homologous to the chloroplast of plants and algae. All the enzymes from NMVA pathway translocate to apicoplast from nucleus through a secretory pathway using signaling and transit peptide. In this study DXS from P. vivax has been cloned and expressed in E. coli using genomic DNA and codon optimized synthetic DNA as a source. Expression of full length DXS with signal and transit peptide as well as mature protein without these peptide using serial deletion has been studied. Kinetic parameters of P.vivax DXS have been calculated and found to be comparable to the DXS from other species.